生物選修一第四章導學案1

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1、 旬陽中學生物選修一導學案 編號： 課題 ：蛋白質的提取和分離 課時： 主編人：王富嬌 審核人：趙長敏 審批人：劉偉 日期 班組： 姓名： 組評： 師評： 學習目標： 1.嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白 2.了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 學習重、難點： 1.凝膠色譜法的原理和方法 2.樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 第一學習時間 自 主 預 習 不看不講 & 基礎知識梳理（系統(tǒng)形象化） 知識回顧： 血液由 和

2、 組成，其中紅細胞最多。紅細胞具有 的特點。紅細胞中有一種非常重要的蛋白質 ，其作用是 ，血紅蛋白有 個肽鏈組成，包括 ，其中每條肽鏈環(huán)繞一個 ，磁基團可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現(xiàn)紅色。 思考1：你認為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？ 思考2：與其它真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質的分離有什么意義？ 基礎知識 一

3、、實驗原理 蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質。 二、 實驗步驟 可分為四大步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。 1．樣品處理 （1）紅細胞的洗滌 ①目的：去除 雜質蛋白 ②方法：低速短時間離心（速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的 黃色血漿，將下層暗紅色的的紅細胞液體倒入燒杯再加入用 五倍的 體積質量分數(shù)為0．9％的氯化鈉溶液洗滌。 ⑤低速離心（低速短時間） ⑥重復4、5步驟 三 次，直至上清液

4、中已沒有 黃色 ，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。 （2）血紅蛋白的釋放 在蒸餾水和40%甲苯作用下，攪拌10min,紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 注：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。 加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。 細胞結構不同，破碎的方法不同，常用有： 2. 粗分離 ①分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。 第1層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白

5、的水溶液，第4層是其他雜質沉淀物(暗紅色)。 將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。 ②透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。 目的：可以去除樣品中分子量較小的雜質，或用于更換樣品的緩沖液。 3． 純化（一般采用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離和純化） 純化主要是根據蛋白質之間以及 與其他物質之間在分子大小、 、 、 等方面純在的差異進行的。常用的方

6、法有： （其原理見名師P38） 4. SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定 判斷 的蛋白質是否達到要求，需要進行蛋白質純度的鑒定。 SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度 SDS電泳的成功關鍵之一是電泳過程中，蛋白質與SDS的結合程度。 思考：是否所有種類的蛋白質的提取和分離都是這樣的？為什么？ 第二學習時間 新 知 學 習 不議不講 & 重難點合作探究（技能系統(tǒng)化） 一．凝膠色譜法（原理） 凝膠色譜法也稱做 ，是根據

7、 分離蛋白質的有效方法。凝膠實際上是一些由 構成的多孔球體，在小球體內部有許多貫穿的通道，相對分子質量不同的蛋白質分子通過凝膠時速度不同，相對分子質量較小的蛋白質 進入凝膠內部的通道，路程 ，移動速度 ；而相對分子質量 的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在 移動，路程 ，移動速度 。相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。 具體過程： 凝膠顆粒 相對分子質量較小的蛋白質 相對分子質量較大的蛋白質 （1） （2） （3） （4） （5） B A

8、 多孔板 A． 的蛋白質由于 作用進入凝膠顆粒內部而被滯留； 的蛋白質被排阻在凝膠顆粒外面，在了里之間迅速通過。 B．1） 混合物上柱； 2）洗脫開始， 的蛋白質擴散進入凝膠顆粒內； 的蛋白質被排阻于凝膠顆粒之外； 3） 的蛋白質被滯留； 的蛋白質被向下移動。 4） 不同的蛋白質分子完全分開

9、； 5） 的蛋白質行程較短，已從 中洗脫出來， 的蛋白質還在行進中。 2．緩沖溶液 緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內進行的各種生物化學反應都是在一定的pH下進行的，例如：血漿的pH是 ，要在實驗條件下準確模擬生物體內的過程，必須保持體外的pH與體內的基本一致。 思考：說出人體血液中緩沖對？ 思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的

10、是什么？ 3．凝膠色譜操作 第一步要制作 ，第二步要 ，因為 ，所以裝柱前需要根據色譜柱的內體積計算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時，不得有 存在。因為氣泡會 ，降低分離效果。第三步是 。 用凝膠色譜法分離蛋白質時，分子量大的蛋白質 （ ） A．路程較長，移動速度較慢 B．路程較長，移動速度較快 C．路程較短，移動速度較慢 D．路程較短，移動速度較快 二、電泳

11、 （1）概念：電泳是指 。 （2）原理：許多重要的生物大分子，如 等都具有 。 在 下，這些基團會帶上 。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其 移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子 以及分子本身 、 的

12、不同使帶電分子產生不同的 ，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 兩種常用的電泳方法是 和 ，在測定蛋白質分子量時通常使用 。蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于 以及 等因素。（3）泳動特點：帶電顆粒直徑越小，越接近于球形，所帶近電荷 ， 在電場中泳動速度就 ，反之，則慢。 三、注意事項 1. 電泳技術 電泳技術就是在電場的作用下，利用

13、待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。 2．加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 3．與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進行蛋白質的分離的意義？ 哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀，沒有細胞核和細胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 4. 紅細胞的洗滌 如果分層不明顯

14、，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 5．如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功 由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 此外，還可以加入大分子的有色物質，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 6．為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？ 如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部

15、的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。 7．沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的？ 不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內的空氣。 8．G-75的含義？ “G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。 9．裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密 10．如何檢測血紅蛋白的分離是否成功？ 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。

16、11. 如何測定蛋白質的分子量？ 使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標準曲線，可以測定未知蛋白質的分子量。 【課堂總結】 血 紅 蛋 白 的 取 和 分 離 凝膠色譜法 原 理 分離過程 凝膠電泳法 緩沖溶液 組 成 作 用 蛋白質的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 離 蛋白質分子的差異性 蛋白質分子的差異性 凝膠色譜法

17、 原 理 分離過程 凝膠電泳法 凝膠色譜法 原 理 分離過程 凝膠電泳法 緩沖溶液 組 成 作 用 緩沖溶液 組 成 作 用 蛋白質的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 蛋白質的 提取分離 樣品處理 粗 分 離 純 化 純度鑒定 第三學習時間 課 程 訓 練 不練不講 ! 自我檢測（能力具體化，練習層次化） 一、非選擇題 1、細胞含有大量的血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分

18、離血紅蛋白，請回答下列有關問題： （1）血紅蛋白提取和分離的程度可分為四步：______、______、______和______。 （2）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。 ①加入檸檬酸鈉的目的是__________________。 ②以上所述的過程即是樣品處理，它包括______、______、收集血紅蛋白溶液。 （3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經過透析，這就是樣品的粗分離。 ①透析的目的是__________________。 ②透析的原理是______________________

19、________。 （4）然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。 ①樣品純化的目的是______________________________。 ②血紅蛋白有什么特點？______________________________。這一特點對進行蛋白質的分離有什么意義？_______________________________。 2、下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時樣品的加入(圖I)和洗脫(圖Ⅱ)示意圖，請據圖回答下列問題。 (1)在加樣示意圖中，正確的加樣順序是 。 (2)用吸管加樣時，應注意正確操作，分別

20、是① 。②貼著管壁加樣、③ 。(3)等樣品 。時，才加入緩沖液 。 待 接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每 mL收集一管，連續(xù)收集。 3、凝膠色譜技術是一種快速而又簡單的分離技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果，目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫(yī)學等有關領域廣泛應用，不但應用于科學實驗研究，而且，已經大規(guī)模地用于工業(yè)生產。據圖回答問題： （1）a、b均為蛋白質分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是 ，原因是

21、 。 （2）自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結構可由 替代。 （3）裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內不能有氣泡存在，原因是 。 （4）洗脫用的液體應盡量與浸泡凝膠所用的液體 (填“相同”或“不同”)，洗脫時，對洗脫液的流速要求是 。 49．早在上世紀六十年代，在美國的黃石國家森林公園發(fā)現(xiàn)了一種嗜熱細菌，從這種細菌中分離提取了一種酶，稱為TaqDNA聚合酶。實

22、驗得知PCR反應變性時溫度為950C，經50個循環(huán)后TaqDNA聚合酶仍有65%的活性； TaqDNA聚合酶表現(xiàn)為Mg2+依賴，濃度在2．0mmol/L的MgCl2能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性 ； （1）若要培養(yǎng)嗜熱細菌，培養(yǎng)基中應有水、碳源、 、 等營養(yǎng)物質。在此基礎上，培養(yǎng)該菌時需先將培養(yǎng)基 。 （2）若將培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基用于植物組織培養(yǎng)，還應加入 。 （3）TaqDNA聚合酶可用于PCR，原因是該酶有 ，因此在PCR擴增時可以 加入。 （4）請將下列實驗流程圖補充完整： （5）凝膠色譜法和凝膠電泳法是分離蛋白質的兩種常用方法，據此回答問題。 ①凝膠色譜法分離蛋白質的原理是根據不同大小的蛋白質分子在凝膠柱中的 不同而實現(xiàn)分離的： ②使用電泳法分離蛋白質．是利用了待分離樣品中各種分子的 差異，以及分子本身的 、形狀的不同。 - 9 - 崇德 勵志 篤學 尚健