異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Pseudomonas sihuiensis YG5脫氮性能及影響因素 生物技術(shù)專業(yè)

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1、異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Pseudomonas sihuiensis YG5 脫氮性能及影響因素 【摘要】研究目的：對(duì)污水處理廠中的污泥進(jìn)行處理，從其中將一部分脫氮能力比較強(qiáng)的異氧硝化-好氧反硝化菌篩出來(lái)，然后要研究這部分菌類，分析其脫氮能力以及影響脫氮能力強(qiáng)弱的影響因素。研究方法，選擇龍津污水處理廠作為取材地點(diǎn)，從中采集污泥，然后在污泥中將一部分脫氮能力比較強(qiáng)的異氧硝化-好氧反硝化菌篩選出一株，接下來(lái)在各個(gè)角度對(duì)其屬于何種、何屬生物進(jìn)行判別，包括形態(tài)學(xué)角度、分子學(xué)角度等等，分析其異養(yǎng)硝化與好氧反硝化脫氮性能，并采用單因素與響應(yīng)面結(jié)合的方法研究其影響因素。結(jié)果表明：富集分離純化篩選的

2、菌株編號(hào)為YG5，經(jīng)鑒定為西徽假單胞菌（Pseudomonas sihuiensis.）。YG5異養(yǎng)硝化脫氮影響因素結(jié)果表明：每升中的檸檬酸鈉含量為12.26克，硫酸銨0.47克，pH=8.07，31.67攝氏度，C/N=30，250.00 mL三角瓶裝量為82.61 mL，YG5經(jīng)培養(yǎng)24h，其對(duì)NH4+-N去除率達(dá)到99.00%，幾乎無(wú)NO3--N及NO2--N的積累，且該菌株耐受最大NH4+-N濃度可達(dá)2000 mg·L-1。在好氧反硝化過(guò)程中，YG5耐受最大NO3--N濃度為800 mg·L-1；在好氧亞硝化過(guò)程中，YG5耐受的最大NO2--N濃度為300 mg·L-1。YG5好氧反硝

3、化和好氧亞硝化脫氮性能的最佳C/N均為30，且可耐受C/N范圍均為15~80，說(shuō)明YG5能耐受高濃度有機(jī)物，具有處理高濃度有機(jī)含氮廢水的潛能。Pseudomonas sihuiensis YG5氮平衡結(jié)果表明：當(dāng)初始NH4+-N濃度為99.12 mg·L-1時(shí)，在好氧反硝化過(guò)程中轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮為44.13±2.12%，同化為細(xì)胞的氮44.73±0.83%；若是初始的NO3--N每升含量為99.29毫克的話，則在整個(gè)反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)候會(huì)有16.44±0.41%轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮，同化為細(xì)胞的氮為63.23±0.93%。 【關(guān)鍵詞】異養(yǎng)硝化；好氧反硝化；假單胞菌；脫氮；耐高濃度有機(jī)物；氮平衡 目錄

4、1. 引言 1 2. 材料與方法 1 2.1菌株來(lái)源 1 2.2實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基 1 2.3實(shí)驗(yàn)儀器 2 2.4菌株的鑒定 2 2.4.1形態(tài)學(xué)鑒定 2 2.4.2生理生化鑒定 2 2.4.2分子生物學(xué)鑒定 2 2.5水質(zhì)測(cè)定方法 3 2.6 YG5脫氮性能研究 4 2.6.1種子液的制備 4 2.6.2異養(yǎng)硝化性能 4 2.6.3好氧反硝化性能 4 2.6.4好氧亞硝化性能 4 2.7異養(yǎng)硝化脫氮性能影響因素 4 2.7.1碳源對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 4 2.7.2 C/N對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 4 2.7.3培養(yǎng)條件對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 4 2

5、.7.4 NH4+-N濃度對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 5 2.8好氧反硝化脫氮性能影響因素 5 2.8.1 C/N對(duì)YG5好氧反硝化性能的影響 5 2.8.2 NO3--N濃度對(duì)YG5好氧反硝化性能的影響 5 2.8.3 C/N對(duì)YG5好氧亞硝化性能的影響 5 2.8.4 NO2--N濃度對(duì)YG5好氧亞硝化性能的影響 5 2.9氮平衡分析 5 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 6 3.1菌種的鑒定 6 3.1.1形態(tài)學(xué)鑒定 6 3.1.2生理生化鑒定 6 3.1.3 分子生物學(xué)鑒定 7 3.2菌種YG5脫氮性能結(jié)果 8 3.2.1異養(yǎng)硝化性能結(jié)果 8 3.2.2好氧反硝化性能結(jié)

6、果 9 3.2.3好氧亞硝化性能結(jié)果 10 3.3異養(yǎng)硝化脫氮性能影響因素 11 3.3.1碳源對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 11 3.3.2 C/N對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 12 3.3.3培養(yǎng)條件對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 13 3.3.4 NH4+-N濃度對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響結(jié)果 16 3.4好氧反硝化脫氮性能影響因素 17 3.4.1 C/N對(duì)YG5好氧反硝化性能的影響結(jié)果 17 3.4.2 NO3--N濃度對(duì)YG5好氧反硝化性能的影響結(jié)果 18 3.4.3 C/N對(duì)YG5好氧亞硝化性能的影響結(jié)果 19 3.4.4 NO2--N濃度對(duì)YG5好氧亞硝化性能的影

7、響 20 3.5氮平衡結(jié)果分析 23 4.結(jié)論 24 致謝 25 參考文獻(xiàn) 25 1. 引言 隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們對(duì)自然環(huán)境的過(guò)度開(kāi)發(fā)以及工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，隨之帶來(lái)的是河流或者湖泊等之中的水被各種有害元素污染，在這些污染元素中，氮是含量最多，帶來(lái)的污染也最大的幾種污染元素之一，其所存在的形式有多種，比方說(shuō)有機(jī)氮、亞硝酸氮等等[1]。其中氨氮對(duì)人類造成的危害主要有各種血液疾病，比方說(shuō)高血壓；而硝酸鹽若是隨著人類的飲用而進(jìn)入人體中，則會(huì)發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽會(huì)給人類帶來(lái)極高的致癌風(fēng)險(xiǎn)[2,3]。因此，解決水體中氮素污染問(wèn)題以及氮素處理必定能夠減少人類的病痛，提高幸福

8、指標(biāo)。 目前，我國(guó)污水脫氮處理技術(shù)主要包括物理化學(xué)法和生物法[4]。物理化學(xué)法一般只能去除水中特定形態(tài)的氮，其反應(yīng)簡(jiǎn)單易控制，基建投資小，但是工藝復(fù)雜，成本高，對(duì)環(huán)境易產(chǎn)生二次污染，且吸附與過(guò)濾材料再生困難，適合規(guī)模較小的污水處理廠[2]。生物脫氮以其安全，高效，經(jīng)濟(jì)，可持續(xù)等特點(diǎn)被認(rèn)為是去除水體中氮元素最具有發(fā)展前景的方法[3]。以傳統(tǒng)的脫氮技術(shù)來(lái)進(jìn)行脫氮的話，通常要經(jīng)歷兩個(gè)步驟，第一步是硝化，第二步是反硝化，因?yàn)檫@兩個(gè)步驟中中微生物生長(zhǎng)緩慢，且因過(guò)程所需條件的不同導(dǎo)致硝化作用和反硝化作用不能同時(shí)在同一反應(yīng)器中進(jìn)行，在實(shí)際污水處理過(guò)程中的脫氮效率低，大大增加了污水處理過(guò)程的難度[5]。

9、隨著國(guó)內(nèi)外技術(shù)的不斷進(jìn)步，生物脫氮技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的提高，出現(xiàn)了各種不同的新技術(shù)，有短程硝化技術(shù)、同步硝化技術(shù)等等[6]。其中，反硝化技術(shù)以及同步硝化技術(shù)具備一些吸引人的優(yōu)點(diǎn)，比方說(shuō)反應(yīng)容器小、反應(yīng)系統(tǒng)pH穩(wěn)定、系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)間短、投資和運(yùn)行成本低等，因?yàn)檫@些優(yōu)點(diǎn)而受到了業(yè)界人士的好評(píng)，迅速成為一個(gè)人們的研究方向。目前已知的擁有異養(yǎng)硝化—好氧反硝化功能的菌屬有假單胞、不動(dòng)桿、芽孢桿、節(jié)桿、卓貝爾氏、產(chǎn)堿桿、弧菌等不同種類及性質(zhì)的菌屬[8,9,10,11]。 雖然異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌的研究很多，其在污水治理領(lǐng)域扮演越來(lái)越重要的角色，但仍面臨著一些問(wèn)題，例如異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌適應(yīng)的氮濃度范圍較窄、

10、耐受的氮素負(fù)荷較低、低C/N比條件下脫氮性能較差等問(wèn)題 [12,13]。因此，仍有必要進(jìn)行異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌的篩選，尋找在實(shí)際應(yīng)用中適應(yīng)性能更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)脫氮菌株。 這里計(jì)劃在篩選出需要的菌以后，在各個(gè)角度對(duì)其屬種進(jìn)行判別，包括形態(tài)學(xué)角度、分子學(xué)角度等等，分析其異養(yǎng)硝化與好氧反硝化性能以及對(duì)其性能造成影響的各種影響因素（碳源、C/N、pH、溫度、裝量、耐受氮濃度等）進(jìn)行探究，希望能夠能夠?qū)⑸锩摰碚摶蛘呔N資源進(jìn)行完善，同時(shí)給如何在實(shí)際的污水處理工作中處理這種菌種提供借鑒。 2. 材料與方法 2.1菌株來(lái)源 以福建省龍巖市龍津污水廠采集的活性污泥為菌株來(lái)源。通過(guò)富集、分離純化、初篩和

11、復(fù)篩，選取具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化性能的YG5為目的菌株。YG5采用了斜面保藏和低溫冷凍保藏法保存菌種[14]。短期內(nèi)工作用菌種保藏在4℃牛肉膏蛋白胨斜面，長(zhǎng)期使用-80℃甘油懸液低溫冷凍保藏。 2.2實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基 （1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏 3，NaCl 10，蛋白胨10，pH 7.0-7.2。 （2）LB液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏 5，NaCl 10，蛋白胨 10，pH 7.0。 （3）DM富集培養(yǎng)基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 7.9，KH2PO4 1.5，NH4Cl 0.3，MgSO4·7H2O 0.1，(CH2COONa)2·6H2O 4.7，KNO3

12、 0.3，微量元素溶液 2 mL·L-1。 （4）DM初篩培養(yǎng)基 (g/L)：Na2HPO4·7H2O 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.1，(CH2COONa)2·6H2O 4.7，KNO3 0.3，微量元素溶液 2 mL·L-1 。 微量元素溶液(g·L-1)：ZnSO4 2.2，CaCl 5.5，MnCl2·4H2O 5.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0， （NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1，CuSO4·5H2O 1.6，CoCI2·6H2O 1.6，EDTA 50，pH 7.0。 （5）異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(g·L-1)：（NH4)2SO4 0.47，（

13、CH2C00Na)2 ·6H2O 4.5（或 C6H5Na3O7·2H2O 3.27），維氏鹽溶液50 mL·L-1，pH 7.0。 （6）好氧反硝化培養(yǎng)基(g·L-1)：KNO3 0.72，（CH2C00Na)2·6H2O 4.5（或C6H5Na3O7·2H2O 3.27）， 維氏鹽溶液50 mL·L-1，pH 7.0。 （7） 好氧亞硝化培養(yǎng)基(g·L-1)：NaNO2 0.49，（CH2C00Na)2 ·6H2O 4.5（或C6H5Na3O7·2H2O 3.27）， 維氏鹽溶液 50 mL/L，pH 7.0。 維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO4 6.54，MgSO4·7H2O

14、 2.5，NaCl 2.5，MnSO4·H2O 0.04，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05。 （注：在這些培養(yǎng)基中夾雜一定的瓊脂，以1.5~2%為宜，之后制成固體培養(yǎng)基，再將其經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理，121℃高溫下處理二十分鐘即可。） 2.3實(shí)驗(yàn)儀器 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要用到的一些器材在下表1中羅列出來(lái)： 表1 儀器設(shè)備表 Table 1 Equipment table 編號(hào) 設(shè)備名稱 型號(hào) 生產(chǎn)廠家 1 立式自動(dòng)高壓滅菌鍋 HVE-50 廈門柏嘉生物科技有限公司 2 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DGG-9240B型 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 3 生化培養(yǎng)箱 SHP-

15、250型 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 4 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 GRP-9160型 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 5 空氣培養(yǎng)搖床 SPH-100B SHIPING OSCILLATOR 6 Sartorius電子天平 BSA224S-CW 賽多利斯 7 梯度PCR儀 MULTISKAN-GO 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司 8 大容量高速冷凍離心機(jī) ST16R 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司 9 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) LEGEND MICRO17R 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司 10 超微量分光光度計(jì) MULTISKAN-GO 賽默飛世爾科技（

16、中國(guó)）有限公司 11 雙目顯微鏡 BA210 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司 12 紫外分光光度計(jì) UV-1800 上海美譜達(dá)儀器有限公司 13 水浴鍋 XMTE-8112 精宏 14 超凈工作臺(tái) SW-CJ-1F 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 15 多參數(shù)水質(zhì)分析儀 連化科技 2.4菌株的鑒定 2.4.1形態(tài)學(xué)鑒定 將經(jīng)過(guò)篩選后所獲得的菌株放在牛肉膏蛋白胨平板，經(jīng)過(guò)二十四小時(shí)的培養(yǎng)以后對(duì)其進(jìn)行觀察，觀察內(nèi)容包括菌落形態(tài)，革蘭氏染色等以及經(jīng)過(guò)透射電鏡觀察的菌體形態(tài)。 2.4.2生理生化鑒定 在進(jìn)行生理生化試驗(yàn)的時(shí)候參考相關(guān)手冊(cè)來(lái)進(jìn)行[15][15]

17、 2.4.2分子生物學(xué)鑒定 首先要將細(xì)菌的DNA提出出來(lái)，這里用來(lái)提取的工具是Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，在提取的時(shí)候嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行，提取出來(lái)的DNA用細(xì)菌的通用引物擴(kuò)增。下表2為PCR引物和它的序列，表3表示的是反應(yīng)體系，表4表示的反應(yīng)條件[17,18]。對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)施檢測(cè)所使用的原料是1%瓊脂糖凝膠，在處于220V的電壓下進(jìn)行半個(gè)小時(shí)的電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，確定擴(kuò)增條帶后送至蘇州金唯智公司進(jìn)行序列的測(cè)定。 表2 PCR擴(kuò)增引物 Table 2 PCR amplification primers 基因 引物 序列 （5'-3'） 片段長(zhǎng)度

18、 （bp） 16S rRNA 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1500 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT napA NAP1 TCTGGACCATGG-GCTTCAACCA 877 NAP2 ACGACGACCGGCCAGCGCAG 表3 PCR反應(yīng)體系 Table 3 PCR reaction system 反應(yīng)體系 體積（μL） 10×PCR buffer 2.5 dNTP 0.5 F 0.5 R 0.5 Taq酶 0.25 ddH2O 20.75 Total 25 表4 16S

19、 rRNA、napA基因的PCR反應(yīng)程序 Table 4 PCR reaction procedures for 16S rRNA，napA genes 基因 PCR反應(yīng)程序 16S rRNA napA基因 預(yù)變性 95℃/3 min 94℃/5 min 變性 95℃/45s 94℃/30s 退火 55℃/45s 58℃/30s 延伸 72℃/45s 72℃/1 min 循環(huán)數(shù) 35 30 補(bǔ)充延伸 72℃/7 min 72℃/7 min 2.5水質(zhì)測(cè)定方法 若是用常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行分析的話，可以選擇的指

20、標(biāo)有很多，包括NH4+-N，NO2--N，COD等等，這些指標(biāo)的具體數(shù)值測(cè)量均遵循相應(yīng)的規(guī)程。在檢測(cè)的時(shí)候所具體使用到的方法如下表5： 表5 水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)的檢測(cè)項(xiàng)目與方法 Table 5 Testing items and methods for conventional indexes 指標(biāo) 方法 生物量（OD600） 采用超微量分光光度法在600 nm出測(cè)定 pH 玻璃電極法 氨氮（NH4+-N） 納式試劑分光光度法 硝酸鹽氮（NO3--N） 麝香草酚分光光度法 亞硝酸鹽氮（NO2--N） N-(1-萘基)-乙二胺光度法 總氮（TN） 堿性過(guò)硫酸鉀消解分

21、光光度法 化學(xué)需氧量（COD） COD儀器消解法 2.6 YG5脫氮性能研究 2.6.1種子液的制備 把YG5菌株接入到LB液體培養(yǎng)基之中，在溫度為三十度的搖床上一直進(jìn)行培養(yǎng)，指導(dǎo)其達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為止。菌懸液4000 r·min-1離心10 min，用無(wú)菌水清洗3次，隨后用無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌濃度OD600值為0.60~0.80，制得種子液。 2.6.2異養(yǎng)硝化性能 把YG5菌株的種子液接種到培養(yǎng)基之中，接種量為3%，這里選擇的培養(yǎng)基中的NH4+-N的初始濃度是100mg/L，C/N=10，類型屬于異氧硝化型的，接種完成后，保持溫度一直處于三十?dāng)z氏度,經(jīng)過(guò)四十八小時(shí)的培養(yǎng)，在其中，每

22、過(guò)六個(gè)小時(shí)就測(cè)定一次其中的OD600、pH值，NH4+-N、TN和COD的含量以及NO3--N、NO2--N的積累量。 2.6.3好氧反硝化性能 將YG5菌株的種子液接種到培養(yǎng)基之中，接種量為3%，這里選擇的培養(yǎng)基中的NO3--N初始濃度等于100 mg/L，C/N等于10，培養(yǎng)基類型為好氧反硝化型的，接種完成后，保持溫度一直處于三十?dāng)z氏度，經(jīng)過(guò)四十八小時(shí)的培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，每過(guò)六個(gè)小時(shí)就測(cè)定一次其中的菌體生物量OD600、pH值，NO3--N、TN和COD的含量以及NH4+-N、NO2--N的積累量。 2.6.4好氧亞硝化性能 將菌株YG5的種子液接種到培養(yǎng)基之中，接種量為3%，這

23、里選擇的培養(yǎng)基中NO2--N的初始濃度等于100mg/L，C/N等于十，培養(yǎng)基類型為好氧亞硝化培養(yǎng)基，接種完成后，保持溫度一直處于三十?dāng)z氏度，經(jīng)過(guò)四十八小時(shí)的培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，每過(guò)6h取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中菌體生物量OD600、pH值，NO2--N、TN和COD的含量以及NH4+-N、NO3--N的積累量。 2.7異養(yǎng)硝化脫氮性能影響因素 2.7.1碳源對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 在這種培養(yǎng)基中，分別使用檸檬酸鈉、乙酸鈉、琥珀酸鈉、葡萄糖、蔗糖作為碳源，無(wú)機(jī)碳源碳酸氫鈉和無(wú)碳培養(yǎng)基作為對(duì)照。把YG5菌株接種到容量為250毫升的三角瓶中，接種量為3%，瓶中含有培養(yǎng)基，其C/N=10，NH4+-

24、N濃度為100 mg·L-1，類型上屬于異氧硝化型的，接種完成后，保持溫度處于30攝氏度，150 r·min-1培養(yǎng)24h，測(cè)定菌液中菌體生物量OD600、pH值和NH4+-N、TN的含量。 2.7.2 C/N對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 以檸檬酸鈉為碳源，C/N設(shè)為10、30、50、100、150、200。把種子液接種到容量為250毫升的三角瓶中，接種量為3%，瓶中裝有培養(yǎng)基，其類型為異氧硝化型的，其NH4+-N初始濃度為100 mg·L-1，30℃，150 r·min-1培養(yǎng)24h，測(cè)定菌液中菌體生物量OD600、pH值和NH4+-N，TN的含量。 2.7.3培養(yǎng)條件對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性

25、能的影響 溫度，pH及裝量對(duì)YG5異養(yǎng)硝化脫氮能力的影響采用響應(yīng)面法進(jìn)行研究。以檸檬酸鈉為碳源，C/N為10。根據(jù)Design-Expert 8.0.6 Trial軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，對(duì)溫度、pH、裝量進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析。根據(jù)NH4+-N去除率擬合出響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型，最終確定YG5的最適溫度、pH、裝量。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，對(duì)影響菌株脫氮效果的三個(gè)因素進(jìn)行編碼，三個(gè)水平對(duì)應(yīng)的編碼值分別為-1、0、1。各因素水平取值如表6： 表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平 Table 6 Factors and level of response su

26、rface design 編號(hào) 因素 Factor 單位 Unit 水平 Level -1 0 1 A pH - 6.5 7.5 8.5 B 裝量 mL 70 100 130 C 溫度 ℃ 28 35 42 2.7.4 NH4+-N濃度對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 把菌株YG5接種到容量為250毫升的三角瓶中，接種量為3%，瓶中含有培養(yǎng)基，其裝量為100毫升，NH4+-N初始濃度分別為100、300、500、1000、1500、2000 mg/L，接種完成中，保持其一直處于31攝氏度，并且pH為7.5，在此種環(huán)境下培養(yǎng)七

27、天，在培養(yǎng)過(guò)程中，每二十四小時(shí)取一次樣，檢測(cè)培養(yǎng)液中菌體生物量OD600、pH值，NH4+-N和TN的含量以及NO3--N、NO2--N的積累量。 2.8好氧反硝化脫氮性能影響因素 2.8.1 C/N對(duì)YG5好氧反硝化性能的影響 將檸檬酸鈉所謂碳源，C/N設(shè)為5、10、15、20、30、50、80。把菌株YG5種子液接種到容量為250毫升的三角瓶中，瓶中裝有培養(yǎng)基，接種量為3%，培養(yǎng)基有100毫升，在接種完成以后，保持其處于三十?dāng)z氏度，經(jīng)過(guò)二十四小時(shí)的培養(yǎng)，然后測(cè)定其中菌體生物量OD600、pH值以及NO3--N、TN的含量。 2.8.2 NO3--N濃度對(duì)YG5好氧反硝化性能的影響

28、 把菌株YG5種子液接種到培養(yǎng)基中，接種量為3%，培養(yǎng)基中的NO3--N濃度分別為100、300、500、800、1200、1500 mg/L，培養(yǎng)基類型為好氧反硝化型的，接種完成后，保持溫度處于三十?dāng)z氏度，經(jīng)過(guò)七天的培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，每24h取樣檢測(cè)菌液中菌體生物量OD600、pH值，NO3--N和TN的含量以及NH4+-N、NO2--N的積累量。 2.8.3 C/N對(duì)YG5好氧亞硝化性能的影響 以檸檬酸鈉為碳源，C/N設(shè)為5、10、15、20、30、50、80。把YG5菌株的種子液接種到容量為250毫升的三角瓶中，接種量為3%，培養(yǎng)基的量為100毫升，類型為好氧亞硝化型的，接種完成后

29、，保持其處于三十?dāng)z氏度，經(jīng)過(guò)二十四小時(shí)的培養(yǎng)后測(cè)定菌液中菌體生物量OD600、pH值以及NO2--N、TN的含量。 2.8.4 NO2--N濃度對(duì)YG5好氧亞硝化性能的影響 將YG5菌株的種子液接種到培養(yǎng)基中，接種量為3%，培養(yǎng)基中NO2--N濃度分別為100、300、500、800、1000 mg/L，類型為好氧反硝化型的，接種完成后，保持溫度處于三十?dāng)z氏度，經(jīng)過(guò)七天的培養(yǎng)，每24h取樣檢測(cè)菌液中菌體生物量OD600、pH值，NO2--N和TN的含量以及NH4+-N、NO2--N的積累量。 2.9氮平衡分析 異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌通過(guò)兩種作用消耗氮，包括同化作用和反硝化作用，微

30、生物在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中會(huì)將一些氮同化，將其存儲(chǔ)在細(xì)胞之內(nèi)；另外有一些氮通過(guò)反硝化作用以氮氧化合物或氮?dú)獾葰鈶B(tài)形式逸散到外界氣體環(huán)境中[20,21]。為了更好地分析菌株YG5同化作用和反硝化作用之間的氮平衡，C/N為10，pH為7條件下，分別將菌株YG5種子液分別接種到初始NH4+-N或NO3--N濃度為100 mg/L的培養(yǎng)基中 ，接種完成后保持溫度在三十?dāng)z氏度，培養(yǎng)三天。測(cè)定未接菌時(shí)的初始TN含量，培養(yǎng)后每24h取樣離心，測(cè)上清液中的TN，為剩余溶解性氮。對(duì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)離心處理的菌液，使用超聲破碎儀來(lái)破碎，剔除其中的氮，然后測(cè)定TN。對(duì)破碎過(guò)的菌液進(jìn)行離心處理，以每分鐘4000轉(zhuǎn)的速度持續(xù)十分鐘

31、，取其上清液，過(guò)濾之后用其濾液來(lái)測(cè)定最終溶解性TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N。計(jì)算過(guò)程遵循以下原則：菌體內(nèi)部所含的氮再加上最終溶解性總氮即為最終總氮；最終溶解性有機(jī)、硝、亞硝、氨氮四者之和即為最終溶解性總氮；剩余溶解性有機(jī)、硝、亞硝、氨氮四者之和等于剩余溶解性總氮；最終總氮與溶解性總氮之間的差在初始總氮之中所占的比例即為轉(zhuǎn)化為細(xì)胞體內(nèi)氮的比率；初始總氮與最終總氮的差在初始總氮之中所占的比例即為氮去除率。 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 3.1菌種的鑒定 3.1.1形態(tài)學(xué)鑒定 YG5菌株經(jīng)過(guò)二十四小時(shí)在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基之中的劃線培養(yǎng)，其培養(yǎng)結(jié)果如下圖：菌株YG5為圓形小菌落，呈

32、乳白色半透明狀，表面光滑濕潤(rùn)，黏稠不易挑取。革蘭氏染色結(jié)果表明菌株YG5為革蘭氏陰性。菌株YG5透射電鏡結(jié)果如圖2所示：菌株YG5屬于短桿菌，有鞭毛，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢。 圖1菌株YG5的菌落形態(tài) 圖2菌株YG5透射電鏡圖 Figure 1 Colony morphology of strainYG5 Figure 2 Transmission electron microscopy of strain YG5 3.1.2生理生化鑒定 測(cè)定菌株YG5的生理生化特性，結(jié)果見(jiàn)表7：乳糖

33、氧化發(fā)酵、尿素水解、甲基紅、V.P反應(yīng)、硝酸鹽還原、綠膿菌素、吲哚實(shí)驗(yàn)、石蕊牛奶、乙酸氧化、明膠液化實(shí)驗(yàn)為陰性。氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、淀粉水解、油脂水解、檸檬酸鹽、果膠水解實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，說(shuō)明菌株YG5具有氧化酶、接觸酶、淀粉酶、脂肪酶、水解酶活性和分解葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸和氣體，能夠利用檸檬酸鈉為碳源產(chǎn)生碳酸鹽的能力。初步判斷YG5與假單胞菌的生理生化特性相符。 表7 YG5菌株的生化特性 Table 7 Physiological and biochemical characteristics of strain YG5 實(shí)驗(yàn)名稱 （Experimental name）

34、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （Experimental result） 實(shí)驗(yàn)名稱 （Experimental name） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （Experimental result） 氧化酶 + 硝酸鹽還原 － 接觸酶 + 綠膿菌素 － 葡萄糖氧化發(fā)酵 + 吲哚實(shí)驗(yàn) － 乳糖氧化發(fā)酵 － 石蕊牛奶 － 尿素水解 － 產(chǎn)硫化氫 － 淀粉水解 + 檸檬酸鹽 + 甲基紅 － 果膠水解 + VP － 乙酸氧化 － 油脂水解 + 明膠液化 － 注：表中 “+”代表陽(yáng)性，發(fā)生了這種反應(yīng)；“－”代表陰性，沒(méi)有發(fā)生這種反應(yīng)。 3.1.3 分子生物學(xué)鑒

35、定 菌株YG5 16S rRNA和napA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳成像，得到了如圖3的試驗(yàn)結(jié)果，從中可以明顯的看出其PCR產(chǎn)物的條帶亮度更高，其中沒(méi)有蘊(yùn)含雜質(zhì)，條帶位置分別在1000~2000、750~1000 bp之間，說(shuō)明獲得目標(biāo)產(chǎn)物。然后對(duì)其產(chǎn)物純化，測(cè)序處理，分析其結(jié)果的同源性，這里使用的分析方法是BLAST程序，通過(guò)MEGA7將系統(tǒng)的發(fā)育樹(shù)描繪出來(lái)。下圖4和圖5為其繪制成果：菌株YG5的16S rRNA基因序列與Pseudomonas sihuiensis KCTC 32246序列同源性為99.57%；napA基因與Pseudomonas sihuiensis KCTC

36、 32246的序列同源性最高，為99.67%?？紤]其本身在形態(tài)上以及生理上的一些特征將其命名為Pseudomonas sihuiensis YG5，以下簡(jiǎn)稱為YG5。 圖3菌株YG5的16S rRNA與napA基因PCR電泳圖 Figure 3 16S rRNA and napA gene PCR electrophoretic map of strain YG5 圖4基于16s rRNA序列同源性構(gòu)建菌株YG5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Figure 4 Phylogenetic tree of strain YG5 was constructed based on the h

37、omology of 16s rRNA sequence 圖5基于napA序列同源性構(gòu)建菌株YG5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) Figure 5 Phylogenetic tree of strain YG5 was constructed based on napA sequence homology 3.2菌種YG5脫氮性能結(jié)果 3.2.1異養(yǎng)硝化性能結(jié)果 異養(yǎng)硝化培養(yǎng)體系中，以NH4+-N為氮源，菌株YG5生長(zhǎng)和脫氮性能變化結(jié)果如圖6所示：0~12h，菌株的生物量增長(zhǎng)迅速，OD600從0.05增長(zhǎng)至0.43，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；18h，生物量達(dá)到最大值，OD600為0.45；隨后生長(zhǎng)曲線

38、較為平緩，進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。體系的pH值隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸遞增，從初始的7.13提高到8.77，說(shuō)明YG5生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)堿。這與目前報(bào)道的許多異養(yǎng)硝化菌類似，例如Acinetobacter calcoaceticus N7培養(yǎng)的24h，pH從7.50上升至8.80[22]；Pseudomonas aeruginosa YL培養(yǎng)的24h，pH從7.00增長(zhǎng)至9.00[23]；Alteromonas macleodii 8D在培養(yǎng)的48h中，pH無(wú)明顯變化，基本維持在7.57[24]。 0~12h，菌株YG5對(duì)NH4+-N和TN降解迅速，NH4+-N去除速率最高達(dá)8.37 mg·(L·h)-1，

39、NO3--N開(kāi)始積累；12~30h，菌株YG5對(duì)NH4+-N和TN降解緩慢；30h，菌株YG5對(duì)NH4+-N去除率為100.00%，TN的去除率最高達(dá)96.57%。菌株YG5的異養(yǎng)硝化與生長(zhǎng)規(guī)律一致，這說(shuō)明氮的去除與菌體生長(zhǎng)有很大的關(guān)系，該結(jié)果與Alcaligenes faecalis Ni3-1，Pseudomonas sp．DK1的脫氮作用主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期情況一致[25,2627]。另外，菌株YG5異養(yǎng)硝化過(guò)程中幾乎沒(méi)有NO3--N，NO2--N的積累，這與Klebsiella sp.y6情況相一致[28]。一般異養(yǎng)硝化菌，適應(yīng)期長(zhǎng)，不能在短時(shí)間內(nèi)將體系中的氮完全去除，例如在初始NH4

40、+-N濃度都為100 mg·L-1的情況下，Pseudomonas putida YH培養(yǎng)48h NH4+ -N 去除率為98.90%[17]，Acinetobacter sp JQ1004 33h菌株NH4+ -N 去除率為 99.45%[29]，而YG5僅需30h NH4+ -N 去除率就能達(dá)到100.00%，說(shuō)明YG5的NH4+-N去除速率更高，具有較強(qiáng)的脫氮性能。 圖6 YG5異養(yǎng)硝化性能變化情況 Fig. 6 Change of YG5 heterotrophic nitrification performance 3.2.2好氧反硝化性能結(jié)果 好氧反硝化培養(yǎng)體系中，菌株

41、YG5以NO3--N為氮源，其生長(zhǎng)和脫氮性能變化結(jié)果如圖7所示：0~18h，菌株YG5生物量增長(zhǎng)迅速，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在18小時(shí)的時(shí)候上升到最高值，OD600為0.35；18~24h處于下降的狀態(tài)，這是因?yàn)樘荚床蛔?，代謝產(chǎn)物累積，抑制菌的生長(zhǎng)；24h后，菌株YG5生長(zhǎng)曲線較為平緩，處于穩(wěn)定期。0~18h，NO3--N，TN的去除率逐漸增加，NO2--N積累量為1.32 mg·L-1，反應(yīng)過(guò)程中還伴有少量的NH4+-N積累；18h，NO3--N與TN的去除率分別達(dá)到77.80%和64.76%；18~48h，NO3--N和TN降解緩慢；24h，TN的去除率最高達(dá)68.81%；36h，NO3--N最高

42、達(dá)78.43%；48h，NH4+-N積累量為3.20 mg·L-1，NO2--N積累量為1.10 mg·L-1。大部分異氧硝化好氧反硝化菌在通過(guò)NO3--N來(lái)發(fā)生以及反硝化的過(guò)程中，同時(shí)檢測(cè)到中間產(chǎn)物NO2--N的積累。例如Pseudomonas sp. CD1在初始NO3--N濃度為253.50 mg·L-1的情況下，培養(yǎng)48h后NO2--N的積累量為3.20 mg·L-1[29]；Pseudomonas aeruginosa YL在初始NO3--N濃度為200 mg·L-1的情況下，培養(yǎng)48h后NO2--N的積累量為59.90 mg·L-1[30]；Pseudomonas putida Y

43、H在初始NO3--N濃度為100 mg·L-1的情況下，培養(yǎng)48h后所積累的NO2--N最終完全去除[17]。以上結(jié)果表明，NO2--N是異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌好氧反硝化脫氮過(guò)程的中間產(chǎn)物。 圖7 YG5 好氧反硝化性能變化情況 Fig. 7 Change of YG5 aerobic denitrification performance 3.2.3好氧亞硝化性能結(jié)果 好氧亞硝化培養(yǎng)體系中，YG5以NO2--N為氮源，生長(zhǎng)和脫氮性能變化規(guī)律如圖8所示：0~6h，菌株YG5生物量增長(zhǎng)較慢，為菌株生長(zhǎng)適應(yīng)期；6~12h，菌株YG5生物量增長(zhǎng)迅速，為菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； 42h OD600最

44、大達(dá)0.38；42~48h，菌株YG5生物量開(kāi)始下降，菌株進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期。0~18h，NO2--N，TN的去除率增長(zhǎng)迅速，在反應(yīng)的時(shí)候會(huì)有不多的NH4+-N和NO2--N生成；在18h的時(shí)候，NO2--N去除掉了74.29%，TN去除掉了75.21%；在18~30h這段時(shí)間內(nèi)，開(kāi)始降解，但是降解速度并不高，在30h的時(shí)候兩者的去除率達(dá)到極限值82.12%，76.73%；30h后，NO2--N，TN的去除率逐漸降低；48h，NH4+-N的積累量達(dá)到了11.03 mg·L-1，而NO3--N幾乎沒(méi)有積累。好氧亞硝化過(guò)程中有少量的NH4+-N積累，這部分氮源可能來(lái)自于少量衰亡的細(xì)菌，例如Altero

45、monas macleodii 8D好氧亞硝化過(guò)程中也檢測(cè)到 NH4+-N的明顯積累，40h NH4+-N濃度達(dá)3.11 mg·L-1，48h下降至1.99 mg·L-1[24]；Arthrobacter arilaitensis Y-10好氧亞硝化過(guò)程中有微量NH4+-N積累[31]。YG5的好氧反硝化性能變化規(guī)律與好氧亞硝化性能變化規(guī)律相似。這與Pseudomonas sp.y3對(duì)NO3--N和NO2--N的利用情況相似[32]，而B(niǎo)acillus hwajinpoensis SLWX2好氧亞硝化性能強(qiáng)于好氧反硝化性能[33]，綜上所述，不同種屬的異養(yǎng)硝化菌對(duì)NO3--N或NO2--N的利

46、用情況存在差異。 圖8 YG5好氧亞硝化性能變化情況 Fig. 8 Change of YG5 aerobic nitrification performance 3.3異養(yǎng)硝化脫氮性能影響因素 3.3.1碳源對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 在微生物的正常生長(zhǎng)周期中，C是一種不可或缺的營(yíng)養(yǎng)物，在其組織結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，在生命活動(dòng)活動(dòng)中也是一種重要的能量來(lái)源。來(lái)源于不同途徑的碳隨此種菌株的脫氮性能所造成的影響在圖9中可以體現(xiàn)出來(lái)：在碳來(lái)源于檸檬酸鈉的時(shí)候，此種菌種的OD600值最高，能夠達(dá)到0.31，NH4+-N和TN去除率最大分別達(dá)到89.48%和81.92%；以琥珀酸鈉

47、為碳源時(shí)，菌株YG5 OD600值為0.30，兩者的去除能夠達(dá)到82.98%和78.09%。在碳來(lái)源于乙酸鈉或者草酸鈉的時(shí)候,OD600分別為0.10、0.06，對(duì)來(lái)自乙酸鈉的碳源，兩者的去除率能夠達(dá)到25.99%和25.29%，對(duì)來(lái)自于草酸鈉的碳源，兩者的去除率能夠達(dá)到3.48%和3.03%，這說(shuō)明了在碳來(lái)源于有機(jī)酸的時(shí)候，菌株YG5生物量比較高，脫氮效果較好。當(dāng)碳源是葡萄糖，蔗糖時(shí)，菌株YG5基本沒(méi)有增長(zhǎng)。以碳酸氫鈉為碳源時(shí)，OD600為0.06，NH4+-N去除率為50.23%，說(shuō)明菌株YG5可以利用無(wú)機(jī)碳源，具有自養(yǎng)硝化的能力，但無(wú)機(jī)碳源不適合菌株YG5的生長(zhǎng)和NH4+-N去除。綜上，

48、選擇檸檬酸鈉為菌株YG5脫氮性能研究的碳源。 菌株YG5與目前報(bào)道大部分異養(yǎng)硝化菌一樣，相對(duì)于糖類，更容易高效利用有機(jī)酸。原因是琥珀酸鈉與檸檬酸鈉是微生物將復(fù)雜有機(jī)物轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單小分子有機(jī)物時(shí)三羧酸循環(huán)中的中間產(chǎn)物，可以直接參與TCA循環(huán)，而糖類需要轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸再利用[35]，小分子的有機(jī)酸碳更適合y6菌的生長(zhǎng)[28]；國(guó)內(nèi)學(xué)者林而舒等人曾經(jīng)針對(duì)過(guò)碳源的不一致與異氧硝化能力之間的關(guān)系，其中NH4+-N的濃度為100mg/L，以檸檬酸鈉作為碳源，菌株Enterobacter asburiae YB NH4+-N去除率最大達(dá)81.20%。但不同種屬的異養(yǎng)硝化菌對(duì)碳源的利用情況也不盡相同，例如Bac

49、illus pumilus BP-171以葡萄糖為碳源，NH4+-N的去除效果最佳，培養(yǎng)12h NH4+-N去除率達(dá)74.07%[36]；Diaphorobacter sp. PDB3以苯酚為碳源，當(dāng)初始NH4+-N為40 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)21h NH4+-N完全去除[37]。 圖9 碳源對(duì)菌株YG5生長(zhǎng)及異養(yǎng)硝化性能的影響 Fig. 9 Effect of carbon sources on growth and heterotrophic nitrification of strain YG5 3.3.2 C/N對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 C/N值的高低會(huì)對(duì)其

50、性能帶來(lái)影響，結(jié)果如圖10所示:當(dāng)C/N為10~30時(shí)，菌株YG5 OD600都達(dá)到0.35以上；C/N從30增加至200時(shí)，菌株YG5 菌體OD600明顯下降，由0.36下降到0.08。當(dāng)C/N為10~30時(shí)，兩者的去除率不低于95%，在C/N提高到50、100、150、200時(shí)，NH4+-N去除率出現(xiàn)了一定的降低，分別為56.87%、33.30%、19.30%、16.89%。綜上所述，菌株YG5最適C/N范圍為10~30。C/N對(duì)菌株的生長(zhǎng)和NH4+-N降解有顯著影響，由于菌株的多樣性與代謝機(jī)理的不同，異養(yǎng)硝化菌C/N的適應(yīng)范圍也不同[11]。例如當(dāng)初始NH4+-N濃度為100 mg·L-

51、1時(shí)，Enterobacter asburiae YT C/N的最適范圍是10~12，當(dāng)C/N為12，OD600與NH4+-N去除率最高分別達(dá)到1.94和98.90%[38]；Pseudomonas aeruginosa YL C/N的最適范圍是10~15，當(dāng)C/N為10，OD600與NH4+-N去除率最高分別達(dá)到1.38和90.80%[23]。綜上所述，與 YT、YL相比，菌株YG5在高碳氮比下脫氮更具有優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明了菌株YG5在高負(fù)荷碳源條件下可以高效的脫氮，具有潛在的廢水處理應(yīng)用優(yōu)勢(shì)與潛能。

52、

53、 圖10 C/N對(duì)菌株YG5生長(zhǎng)及異養(yǎng)硝化性能的影響 Fig.10 Effect of C/N on the growth and heterotrophic nitrification of strain YG5 3.3.3培養(yǎng)條件對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響 (1)實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果 以pH（A），裝量（B），溫度（C）這三個(gè)參數(shù)作為自變量，以NH4+-N去除率作為因變量，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)以后，所得到的試驗(yàn)結(jié)果在下表中羅列了出來(lái)： 表8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 Table 8 Design scheme

54、and result of response surface experiment 編號(hào) Number pH（A） 裝量（mL）（B） Loading capacity 溫度（℃）（C） Temperature NH4+-N去除率（%） NH4+-N removal rate 1 0 0 0 97.92 2 1 0 1 82.96 3 0 1 -1 83.28 4 0 0 0 96.58 5 0 0 0 96.58 6 1 1 0 81.39 7 -1 0 -1 94.15 8 1 -1 0

55、93.04 9 -1 -1 0 93.09 10 -1 0 1 78.81 11 0 0 0 95.78 12 0 -1 1 76.25 13 0 1 1 73.01 14 0 -1 -1 95.33 15 1 0 -1 95.76 16 0 0 0 97.65 17 -1 1 0 80.99 (2)方差分析 利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到擬合二次回歸模型方程： R1=96.90+0.76A-4.88B-7.19C+0.

56、11AB+0.63AC+2.20BC-1.91A2-7.86B2-7.07 C2 其中R1代表氨氮去除率，A，B，C分別代表pH，裝量，溫度的編碼值。對(duì)上述模型方程進(jìn)行方差分析，其結(jié)果如表9所示： 表9 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析 Table 9 Variance analysis of experimental results 方差 來(lái)源 平方和 Sum of Squares 自由度 df 均方 Mean Square F值 F Value p值 P value 模型 1157.86 9 128.65 56.86 ** A 4.67 1

57、 4.67 2.06 0.19 B 190.51 1 190.51 84.20 ** C 413.08 1 413.08 182.56 ** AB 0.053 1 0.053 0.023 0.88 AC 1.60 1 1.60 0.71 0.42 BC 19.37 1 19.37 8.56 * A2 15.37 1 15.37 6.79 * B2 260.29 1 260.29 115.04 ** C2 210.47 1 210.47 93.02 ** 殘差 15.84 7 2.26

58、 失擬項(xiàng) 12.78 3 4.26 5.58 0.06 純誤差 3.06 4 0.76 總誤差 1173.70 17 注：*為顯著（p<0.05），**為極顯著（p<0.01） 模型的p<0.01，為極顯著，說(shuō)明用響應(yīng)面法建立的回歸模型是有意義的。失擬項(xiàng)的p>0.05，說(shuō)明無(wú)失擬因素存在，這個(gè)回歸模型擬合出來(lái)曲線具備了比較好的擬合度，因此通過(guò)這個(gè)模型來(lái)研究分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可行的。在進(jìn)行過(guò)方差分析以后，能夠發(fā)現(xiàn)B，C（p<0.01），顯然差異極大，二次項(xiàng)B2，C2（p<0.01）也顯然差異極大；BC（p<0.05）顯然差異極大，AB，AC（p>

59、0.05）沒(méi)有明顯的差異。這能夠看出各個(gè)因素之間對(duì)響應(yīng)值并不是單一的線性關(guān)系，且對(duì)響應(yīng)值的影響存在一個(gè)極值點(diǎn)，這個(gè)極值點(diǎn)正是最佳條件[39]。根據(jù)模型方程可預(yù)測(cè)當(dāng)pH為8.07，250 mL三角瓶裝量為82.61 mL，溫度為31.67℃時(shí)，反應(yīng)體系的異養(yǎng)硝化能力為最佳。 (3)模型分析 將三種因素分別進(jìn)行兩兩的分析比較，然后經(jīng)過(guò)回歸分析，將等高線圖和響應(yīng)面圖繪制出來(lái)，在等高線圖中，可以根據(jù)其形狀來(lái)判斷相互作用的大小，若是等高線表現(xiàn)為圓形，則表示了沒(méi)有顯著的作用，若等高線表現(xiàn)為橢圓形，則表示了相互作用是顯著的，在所有橢圓中，面積最小的一個(gè)的中心點(diǎn)即為響應(yīng)面的最高點(diǎn)[35,40]。響應(yīng)面的作

60、用在于當(dāng)某一變量的編碼值處于0時(shí)，可以看出其余兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互影響[35]。 pH與裝量對(duì)菌株YG5 NH4+-N去除率的相互影響結(jié)果如圖11(a)所示：等高線的形狀為橢圓形，說(shuō)明當(dāng)溫度一定時(shí)，pH與裝量之間的交互作用顯著。整體響應(yīng)面較為陡峭，響應(yīng)值隨著裝量的變化率大于隨著pH的變化率，表示裝量比pH對(duì)菌株YG5 NH4+-N去除率的影響程度大。pH和溫度對(duì)菌株YG5 NH4+-N去除率的相互影響結(jié)果如圖11(b)所示：在等高線圖中，可以發(fā)現(xiàn)圖線多呈橢圓，說(shuō)明了pH與溫度之間有顯著的影響關(guān)系，其響應(yīng)面不平緩，在溫度發(fā)生改變的時(shí)候，響應(yīng)值改變量更大，說(shuō)明溫度比pH對(duì)NH4+-N去除率的影

61、響程度大。裝量和溫度對(duì)菌株YG5 NH4+-N去除率的相互影響結(jié)果如圖11(c)所示：在等高線圖中，其圖線多為橢圓，說(shuō)明裝量溫度之間有顯著的影響關(guān)系，其響應(yīng)面不陡峭，響應(yīng)值隨著溫度的變化率與隨著pH的變化率相當(dāng)，表示裝量與溫度對(duì)NH4+-N去除率的影響程度相當(dāng)。 c b a 圖11 各交互項(xiàng)影響NH4+-N去除率的等高線圖和響應(yīng)面圖 Fig.11 Each interaction term affects the contour plot and response surface plot of NH4+-N removal rate (4

62、) 、模型驗(yàn)證 以響應(yīng)面的形態(tài)來(lái)對(duì)此種菌株的最佳脫氮條件進(jìn)行分析：pH 8.07，裝量為250 mL三角瓶約裝82.61 mL，溫度 31.67℃，此時(shí)NH4+-N去除率預(yù)測(cè)值為96.58%。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行三組水平實(shí)驗(yàn)，150 r·min-1培養(yǎng)24h，測(cè)得實(shí)際平均NH4+-N去除率為99.11%?？梢?jiàn)實(shí)際值與回歸方程所得到的理論值非常接近，菌株YG5優(yōu)化后NH4+-N去除率與優(yōu)化前相比提高了16.13%。同時(shí)，檢測(cè)了菌株YG5優(yōu)化后TN去除率為98.39%，與優(yōu)化前TN去除率相比較提高了20.30%。以上結(jié)果表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株YG5的脫氮條件，取得了

63、良好的效果。 3.3.4 NH4+-N濃度對(duì)YG5異養(yǎng)硝化性能的影響結(jié)果 下圖12表示了NH4+-N的濃度大小的變化對(duì)此種菌株的生長(zhǎng)情況或者異氧硝化脫氮性能所能夠造成的影響：剛開(kāi)始NH4+-N濃度大小值等于100、300、500、1000、1500、2000 毫克每升，菌株YG5異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)七天：在NH4+-N的濃度處于一百到三百毫克每升的區(qū)間內(nèi)的時(shí)候，此種菌株的生物量隨著氮濃度的增加而增加，OD600由0.98上升到2.23；當(dāng)NH4+-N濃度為300~2000 mg·L-1時(shí)，菌株生物量發(fā)生明顯的降低，OD600由2.23下降到0.06，說(shuō)明氮濃度過(guò)高對(duì)菌的生長(zhǎng)和脫氮性能產(chǎn)

64、生抑制作用，抑制了菌株的生長(zhǎng)代謝以及有效反應(yīng)。當(dāng)NH4+-N濃度為100~500 mg·L-1時(shí)，NH4+-N，TN去除率達(dá)97.00%以上，其中NH4+-N濃度為500 mg·L-1時(shí)，兩者的去除率達(dá)到極限值，分別為百分之一百和百分之九十八；當(dāng)NH4+-N在每升溶液中的含量為一千、一千五、兩千毫克的時(shí)候，隨著氮越來(lái)越濃，其去除率越來(lái)越低，分別為35.07%、7.83%、10.31%。同時(shí)，測(cè)定了NO3--N，NO2--N積累情況，結(jié)果表明無(wú)論是高氮負(fù)荷還是低氮負(fù)荷二者都無(wú)明顯積累。綜上所述，菌株 YG5 能夠適應(yīng)較寬范圍的NH4+-N負(fù)荷，在高NH4+-N負(fù)荷下仍具有較高的異養(yǎng)硝化能力，高于

65、目前報(bào)道的一些好氧反硝化菌株，例如當(dāng)初始NH4+-N濃度為20~160 mg·L-1時(shí)，Pseudomonas alcaliphila AD-28用來(lái)去除NH4+-N的時(shí)候，去除效果很好，可以達(dá)到百分之九十，在NH4+-N的每升含量上升到兩百毫克的時(shí)候，Pseudomonas putida YH對(duì)N的去除效果很好，可以達(dá)到百分之九十八，在NH4+-N的每升含量提高到五百毫克的時(shí)候，其去除率降低為三分之二[17]，在NH4+-N的每升含量不低于五十毫克，不超過(guò)一百毫克的時(shí)候，Acinetobacter sp YN3能夠起到很好的去除效果，對(duì)；NH4+-N能夠達(dá)到百分之九十八的去除率。在其每升含量

66、提高至一百五十毫克的時(shí)候，去除率降低到百分之十九[42]。比起前面所說(shuō)的這些菌株來(lái)說(shuō)，YG5在處理含量比較高的污水方面具備相當(dāng)強(qiáng)的潛力。 圖12 NH4+-N濃度對(duì)YG5異養(yǎng)硝化脫氮性能的影響 Fig. 12 Effect of NH4+-N concentration on nitrogen removal by heterotrophic nitrification of YG5 3.4好氧反硝化脫氮性能影響因素 3.4.1 C/N對(duì)YG5好氧反硝化性能的影響結(jié)果 C/N是衡量反硝化體系中電子供體和電子受體比率的指標(biāo)，是好氧反硝化細(xì)菌在呼吸過(guò)程中獲得高效脫氮效率的重要因素[42]。不同C/N對(duì)菌株YG5的生長(zhǎng)情況以及好氧反硝化脫氮的影響結(jié)果如圖13所示:當(dāng)C/N為5~30時(shí)，菌株YG5 OD600隨著C/N的增加而增加，這是由于低的碳源含量不能滿足菌株YG5的生長(zhǎng)，其中C/N為30時(shí)，YG5 OD600最大達(dá)到0.88；當(dāng)C/N為50和80時(shí)，菌株YG5 OD600隨著C/N的增加而降低，分別為0.75和0.59，說(shuō)明碳源已經(jīng)超過(guò)了菌體所需的量，對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定抑