鼠傷寒沙門氏菌／回復(fù)突變試驗

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1、八、鼠傷寒沙門氏菌／回復(fù)突變試驗 Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay 1 范圍 本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌／回復(fù)突變試驗的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。 2 規(guī)范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。 3 定義 3.1 回復(fù)突變（Reverse mutation） 細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)

2、。 3.2 基因突變 （Gene mutation） 在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。 3.3 堿基置換突變 （Base substitution mutation） 引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。 堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。 轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌呤被另一嘌呤所代替。 顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌呤被另一嘧啶所代替。 3.4 移碼突變（ Frameshift mutation） 引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。 3

3、.5 鼠傷寒沙門氏菌/回復(fù)突變試驗（ Salmonella typhimurium/reverse mutation assay） 利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)→原養(yǎng)型(his+)回復(fù)突變的試驗方法。 3.6 S9 經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。 4 原理 鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長。假如有致突變物存在，則

4、營養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。 某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變， 故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。 5 儀器和設(shè)備 培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數(shù)器、低溫高速離心機，玻璃器皿等。 6 培養(yǎng)基和試劑 6.1 0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液 成分： L-組氨酸(MW 155) 78mg D-生物

5、素(MW 244) 122mg 加蒸餾水至 1000mL 配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。 6.2 頂層瓊脂培養(yǎng)基 成分： 瓊脂粉 1.2g 氯化鈉 1.0g 加蒸餾水至 200mL 配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。 6.3 Vogel-Bonner (V-B) 培養(yǎng)基E 成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g

6、 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 500g 磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O) 175g 硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 10g 加蒸餾水至 1000mL 配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。 6.4 20%葡萄糖溶液 成分：葡萄糖 200g 加蒸餾水至 1000mL 配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4℃冰箱。

7、6.5 底層瓊脂培養(yǎng)基 成分：瓊脂粉 7.5g 蒸餾水 480mL V-B培養(yǎng)基E 10mL 20%葡萄糖溶液 10mL 配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用。 6.6 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 成分：牛肉膏 2.5g 胰 胨 5.0g 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g 加蒸餾水至 50

8、0mL 配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。 6.7 鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2) 成分：氯化鉀(KCl) 61.5g 氯化鎂(MgCl2·6H2O) 40.7g 加蒸餾水至 500mL 配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。 6.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4) 成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 2.965g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 2

9、9.015g 加蒸餾水至 500mL 配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。 6.9 S9混合液 成分 每毫升S9混合液 肝S9 100ml 鹽溶液 20ml 滅菌蒸餾水 380ml 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500ml 輔酶II(NADP) 4mmol 6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mmol 配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分， 使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實驗結(jié)束，剩余S9混合

10、液應(yīng)該丟棄。 6.10 菌株鑒定用和特殊用途試劑 6.10.1 組氨酸—生物素平板 成分：瓊脂粉 15g 蒸餾水 944mL (V-B)培養(yǎng)基E 20mL 20%葡萄糖 20mL 滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL 滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL 配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基和組氨酸溶液加進(jìn)熱的瓊脂溶液中。待溶液稍為冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。 6.10.2 氨芐青霉素平板和

11、氨芐青霉素/四環(huán)素平板 成分：瓊脂粉 15g 蒸餾水 940mL (V-B)鹽溶液 20mL 20%葡萄糖 20mL 滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL） 10mL 滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL 氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL 四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL 配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無菌的葡萄糖、V

12、B鹽溶液和組氨酸—生物素溶液加進(jìn)熱的溶液中去，混勻。冷卻至大約50℃，無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。 應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。 6.10.3 營養(yǎng)瓊脂平板 成份：瓊脂粉 7.5g 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 500mL 配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。 7 試驗菌株及其生物學(xué)特性鑒定 7.1 試驗菌株 采用TA97、TA98、TA100和TA102一組標(biāo)準(zhǔn)測試菌株。 7.2 生物學(xué)特性鑒定 新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表

13、1所示。 表1 試驗菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn) 菌株 組氨酸 缺陷 脂多糖屏障缺損 氨芐青霉素抗性 切除修復(fù)缺損 四環(huán)素 抗性 自發(fā)回變菌落數(shù)* TA97 TA98 TA100 TA102 + + + + + + + + + + + + + + + - - - - + 90-180 30-50 100-200 240-320 注 “+”表示需要組氨酸 “+”表示具有rfa突變 “+”表示具有R因子 “+”表示具有△uvrB突變 “+”表示具有pAQ1質(zhì)粒 *在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌落數(shù)略增 7.2.

14、1 組氨酸缺陷 原理：組氨酸缺陷型試驗菌株本身不能合成組氨酸，只能在補充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。 鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長。 7.2.2 脂多糖屏障缺損 原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì)如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。 鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫

15、溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。 7.2.3 氨芐青霉素抗性 原理：含R因子的試驗菌株對氨芐青霉素有抗性。因為R因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。 鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。 7.2.4 紫外線敏感性 原理：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏

16、感，當(dāng)受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則能照常生長。 鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細(xì)菌不生長，而具有完整的切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常生長。 7.2.5 四環(huán)素抗性 原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。 鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明

17、該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質(zhì)粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質(zhì)粒。 7.2.6 自發(fā)回變 原理：每種試驗菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗菌株的一項特性。 鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸—生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)，混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃培養(yǎng)箱中孵育48h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。 結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。 7.2.7 回變特性—診斷性試驗 原理：每種試驗菌株對診斷性誘變劑

18、回變作用的性質(zhì)以及S9混合液的效應(yīng)不一。 鑒定方法：按照平板摻入試驗的操作步驟進(jìn)行。將受試物換成診斷性誘變劑。 結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對某些診斷性誘變劑特有的回變結(jié)果參見表2。 表2 測試菌株的回變性 誘變劑 劑量(mg) S9 TA97 TA98 TA100 TA102 柔毛霉素 疊氮化鈉 ICR—191 鏈霉黑素 絲裂霉素C 2,4,7-三硝基-9-芴酮 4-硝基-O-次苯二胺 4-硝基喹啉-N-氧化物 甲基磺酸甲酯 2-氨基芴 苯并（a）芘 6.0 1.5 1.0 0.25 0.5 0.20 20

19、0.5 1.0 10 1.0 - - - - - - - - - + + 124 76 1640 inh inh 8377 2160 528 174 1742 337 3123 3 63 inh inh 8244 1599 292 23 6194 143 47 3000 185 inh inh 400 798 4220 2730 3026 937 592 188 0 2230 2772 16 0 287 6586 261 255 注：inh表示抑菌。表中數(shù)

20、值均已扣除溶劑對照回變菌落數(shù)。 8 大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9的制備 8.1 誘導(dǎo) 最廣泛應(yīng)用的大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導(dǎo)劑，劑量為500mg/kg體重。誘導(dǎo)劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合也可做為誘導(dǎo)劑。 8.2 S9制備 動物誘導(dǎo)后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按每克

21、肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝2 mL ~3 mL。儲存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。 上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進(jìn)行。制備肝S9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。 9 溶劑的選擇 如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水作為溶劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每

22、皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100ml。 10 劑量的設(shè)計 決定受試物最高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對細(xì)菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。 對原料而言，一般最高劑量組可為5mg/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。 11 試驗操作步驟 11.1 增菌培養(yǎng) 取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)1

23、0h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于1～2×109活菌數(shù)。 11.2 平板摻入法 實驗時，將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。 實驗中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時設(shè)空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。 12 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷 記錄受試物各劑量組

24、、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。 如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系者，則該受試物判定為致突變陽性。 受試物經(jīng)上述四個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個試驗菌株檢測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。 13 試驗報告 試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容： （1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、使用溶劑； （2）試驗菌株：所用試驗菌株； （3）代謝活化系統(tǒng)：所用誘

25、導(dǎo)劑； （4）試驗方法：簡述操作步驟，除受試物劑量分組外，還應(yīng)說明空白對照、溶劑對照和陽性對照， 陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)； （5）結(jié)果：以列表方式報告受試物的Ames實驗結(jié)果（表1）； （6）結(jié)論。 表1 Ames試驗菌株的回變結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差） 組別 劑量 (mg/皿) TA97 -( S9) +( S9) TA98 -( S9) +( S9) TA100 -( S9) +( S9) TA102 -( S9) +( S9) 受試物 自發(fā)回變 溶劑對照 陽性物對照 113