分子生物學(xué)論文：探析沙門氏菌的檢測(cè)對(duì)預(yù)防和控制沙門氏菌感染的重要性

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1、分子生物學(xué)論文：探析沙門氏菌的檢測(cè)對(duì)預(yù)防和控制沙門氏菌感染的重要性 　　摘要：　沙門氏菌病是一種在自然界廣泛存在的人畜共患病，可以引起人類敗血癥、胃腸炎等疾病，還能導(dǎo)致動(dòng)物傷寒、副傷寒，嚴(yán)重者會(huì)危及人、畜的生命。因此，建立沙門氏菌的快速檢測(cè)方法對(duì)預(yù)防和控制沙門氏菌感染至關(guān)重要。目前沙門氏菌的檢測(cè)技術(shù)有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)和近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的如生物傳感器檢測(cè)技術(shù)、納米技術(shù)、基于適配體檢測(cè)技術(shù)等新型技術(shù)。該文總結(jié)了沙門氏菌各種檢測(cè)方法的原理、優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)及研究情況，并對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)方法及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。 　　關(guān)鍵詞：　食品; 沙門氏菌; 檢測(cè)方法

2、; 研究進(jìn)展; 　　Abstract：　Salmonellosis is a zoonotic disease that is widespread in nature, it can cause diseases such as human sepsis and gastroenteritis, and also cause typhoid and paratyphoid in animals. In severe cases, it can even endanger life of human and animals. Therefore, the establishme

3、nt of a rapid detection method for Salmonella is essential to prevent and control Salmonella infection. At present, the detection technologies of Salmonella including traditional culture methods, immunological detection technologies, molecular biological detection technologies, and some new technolo

4、gies such as the biosensor detection technology, nanotechnology and detection technology based on aptamer developed in recent years. The principles, advantages and disadvantages and researches of various detection methods for Salmonella were summarized, and the detection method and application prosp

5、ect of Salmonella were also prospected. 　　Keyword：　food; Salmonella; detection method; research progress; 　　1885年，在霍亂流行時(shí)分離到豬霍亂沙門氏菌，定名為沙門氏菌屬（Salmonella sp.）。沙門氏菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，種類繁多，目前已檢測(cè)出2 500多種沙門氏菌血清型[2]。沙門氏菌是一種革蘭氏陰性的腸道桿菌，不但能顯性或隱性感染動(dòng)物，而且能通過(guò)污染的動(dòng)物源性食品造成人的食物中毒，嚴(yán)重危害公共健康安全。根據(jù)歐洲食品安全局（Europea

6、n Food Safety Agency,EFSA）統(tǒng)計(jì)，歐洲每年有超過(guò)10萬(wàn)例的人類沙門氏菌病[3]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）統(tǒng)計(jì)顯示，在美國(guó)每年的沙門氏菌感染已經(jīng)增加到1 200萬(wàn)人，引起大約1.9萬(wàn)人住院甚至450人死亡[3]。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)由沙門氏菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的首位。目前沙門氏菌的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法、分子生物學(xué)方法以及近年來(lái)多學(xué)科聯(lián)合應(yīng)用的新型檢測(cè)方法，如生物傳感器技術(shù)、納米技術(shù)、基于適配體檢測(cè)技術(shù)等，這些方法為進(jìn)行沙門氏菌的準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測(cè)提供了方向。本文對(duì)沙門

7、氏菌的檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，為沙門氏菌病的檢測(cè)和防控提供參考。 　　1、 傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法 　　傳統(tǒng)生理生化方法的檢測(cè)過(guò)程包括樣品預(yù)增菌、增菌、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定，具有較高的準(zhǔn)確性，是國(guó)際和國(guó)內(nèi)食品中沙門氏菌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[4]。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 6579《食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)—沙門氏菌檢測(cè)的基準(zhǔn)方法》[5]、GB4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》[6]分別是目前用于食品中沙門氏菌檢測(cè)方法，但是在沙門氏菌病的應(yīng)急處理中經(jīng)常需要盡快得到檢測(cè)結(jié)果，傳統(tǒng)生理生化方法的檢測(cè)周期約4～7 d，操作繁瑣，更多依靠于

8、主觀判定，并且腸桿菌科的生化鑒定具有交叉性，在檢測(cè)速度、特異性、敏感性等方面有一定的局限性。 　　顯色培養(yǎng)基法和添加物質(zhì)法均可以加快病原菌的分離和鑒定，其中利用顯色培養(yǎng)基法進(jìn)行檢測(cè)后結(jié)果準(zhǔn)確，并易于判定，該方法已經(jīng)被收錄于GB/T 4789.4—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》及以后版本的標(biāo)準(zhǔn)中[7]，但是具有較高的實(shí)驗(yàn)成本；添加物質(zhì)法可以縮短檢測(cè)時(shí)間至2 d[8]。疏水網(wǎng)膜法可以提高病原菌的富集效率，該方法操作更為簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間縮短至3 d[9]。以上改進(jìn)方法明顯縮短了沙門氏菌的檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)限，但是無(wú)法徹底解決傳統(tǒng)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣的問(wèn)題。因此需要研

9、究準(zhǔn)確、方便的沙門氏菌快速檢測(cè)方法。 　　2 、免疫學(xué)檢測(cè)方法 　　免疫學(xué)技術(shù)是以免疫學(xué)為理論基礎(chǔ)利用抗原抗體的特異性反應(yīng)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行放大檢測(cè)的一種方法，具有靈敏性較高、檢測(cè)時(shí)間短、高通量的優(yōu)點(diǎn)，因此在食品微生物檢測(cè)中得到普遍應(yīng)用。 　　2.1、 酶聯(lián)免疫分析法 　　酶聯(lián)免疫分析法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）最早是于1977年首次應(yīng)用以檢測(cè)食品中沙門氏菌，目前已經(jīng)成為沙門氏菌檢測(cè)中的常用免疫分析技術(shù)，它是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶的催化作用相結(jié)合來(lái)檢測(cè)特異性抗原[10]。ELI

10、SA主要包括直接ELISA、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA及競(jìng)爭(zhēng)ELISA等[7]。ELISA法的檢測(cè)效率高于傳統(tǒng)檢測(cè)法，但也需要長(zhǎng)時(shí)間增菌，操作中會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，并且ELISA難以檢測(cè)多種病原。該技術(shù)目前需要研究具有高特異性的重組抗原，并能進(jìn)行多種標(biāo)記的全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)。伍燕華等[11]用抗沙門氏菌多克隆抗體和抗沙門氏菌單克隆抗體C1359建立了沙門氏菌的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，可以快速檢測(cè)A、B、C、D、E等五種典型沙門氏菌，最低可以檢測(cè)的沙門氏菌純培養(yǎng)液濃度為1104CFU/m L。WILANEE C等[12]將具有大表面積和良好生物相容性的SWCNT作為鼠傷寒沙門

11、氏菌抗體和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）的載體，建立成一個(gè)Ab/SWCNTs/HRP結(jié)構(gòu)的信號(hào)放大探針，以此探針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法的靈敏度是傳統(tǒng)ELISA法的1 000倍。方一臻[13]將外膜蛋白Pag C進(jìn)行重組純化，經(jīng)過(guò)各條件優(yōu)化建立了檢測(cè)沙門氏菌抗原的間接ELISA方法，該方法重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、可以應(yīng)用于沙門氏菌的主要血清型中。何一欣[14]經(jīng)過(guò)篩選得到了腸炎沙門氏菌的納米抗體，并建立了檢測(cè)牛奶樣品中腸炎沙門氏菌的雙抗體夾心ELISA方法，靈敏度為1～10 CFU/m L，為快速檢測(cè)沙門氏菌提供了技術(shù)支持。

12、　　2.2、 免疫熒光技術(shù) 　　免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique,IFT）的基本原理是將熒光色素標(biāo)記在抗體（抗原）上，與對(duì)應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下發(fā)出可見(jiàn)熒光，從而定性檢測(cè)抗原（抗體）。熒光物種類一般有異硫氰酸熒光素、羅丹明熒光素、二氯三嗪基氨基熒光素等。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，特異性好，但缺點(diǎn)是會(huì)產(chǎn)生非特異性染色[8]，敏感性較低[7]。WANG B B等[15]建立了一種檢測(cè)蛋殼上沙門氏菌的高特異性免疫熒光法，該方法將熒光強(qiáng)度高、水溶性好的Cd Te量子點(diǎn)作為標(biāo)記物與沙門氏菌抗體結(jié)合，量子點(diǎn)標(biāo)記抗體與沙門氏菌發(fā)生特異

13、性反應(yīng)，最低檢出限為1102CFU/m L。PANDEY S K等[16]建立了一個(gè)檢測(cè)傷寒沙門氏菌的新型夾心熒光免疫分析方法，以抗Vi莢膜多糖抗體為捕獲劑，以陽(yáng)離子受體分子多黏菌素B為粘結(jié)劑，檢出限為10 CFU/m L。夏圣等[17]以納米熒光碳點(diǎn)（carbon dots,CDs）這一新型納米材料作為免疫示蹤材料來(lái)檢測(cè)樣品中乙型副傷寒沙門氏菌。該方法將抗沙門氏菌Ha因子抗體與CDs耦聯(lián)制備出免疫納米熒光碳點(diǎn)，并將抗沙門氏菌O4因子抗體與磁珠粒耦聯(lián)進(jìn)行樣品中乙型副傷寒沙門氏菌的富集后，再與免疫熒光碳點(diǎn)產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，形成抗O4-磁珠-細(xì)菌-抗Ha-CD免疫復(fù)合物。使用免疫親和分離液從復(fù)合物

14、中除去磁珠粒，通過(guò)檢測(cè)分離液中CDs的熒光強(qiáng)度來(lái)推算樣品中病原菌的量。此方法的檢測(cè)下限為103CFU/m L，檢測(cè)時(shí)間約2 h。 　　2.3、 免疫磁性分離技術(shù) 　　由于食品樣品經(jīng)常為固液多相混合態(tài)，采用傳統(tǒng)方法難以分離出少量致病菌。免疫磁性分離技術(shù)（immunomagnetic separation technique,IST）是將磁性顆粒與抗體特異性偶聯(lián)，偶合物與樣品中致病微生物進(jìn)行特異性結(jié)合，結(jié)合了致病微生物的磁珠在磁場(chǎng)的作用下向磁極方向移動(dòng)，與樣品處理液分開(kāi)，得到濃集的致病菌。此技術(shù)提高了病原的濃縮效率，經(jīng)常與免疫學(xué)、生物學(xué)等技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，具有更高的靈敏

15、度和特異性，并且不需要前增菌步驟，檢測(cè)時(shí)間縮短至僅為幾小時(shí)[18]。申靜等[19]將結(jié)合了沙門氏菌單抗的羧基磁珠作為免疫磁珠，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）納米探針，建立一種快速方法來(lái)進(jìn)行樣品中沙門氏菌的特異性檢測(cè)。李亞茹等[20]用納米磁珠結(jié)合抗沙門氏菌多克隆抗體，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化建立了免疫磁珠分離方法。并根據(jù)沙門氏菌ttr基因合成引物和探針，建立實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR）方法。將這兩種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)

16、了高效、靈敏地檢測(cè)蝦中沙門氏菌。免疫磁性技術(shù)具有選擇性分離、快速濃縮的優(yōu)點(diǎn)，是綜合磁載體技術(shù)和免疫學(xué)的一項(xiàng)重要檢測(cè)技術(shù)。 　　2.4、 免疫層析法 　　免疫層析法（immunochromatography assay,ICA）的原理是將抗體固定在硝酸纖維素膜的某區(qū)域，再將樣品浸入干燥的硝酸纖維素膜一端，樣品在毛細(xì)管的作用下沿該膜移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中的抗原會(huì)特異性地結(jié)合抗體，采用酶染色或膠體金使發(fā)生免疫反應(yīng)的區(qū)域顯色，來(lái)進(jìn)行病原體的特異性檢測(cè)。該技術(shù)以免疫滲透為基礎(chǔ)，具有簡(jiǎn)單快速、成本低廉、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)[7]，但也存在靈敏度較低、無(wú)法定量的問(wèn)題。劉

17、志科等[21]建立了一種雞白痢沙門氏菌抗體檢測(cè)的膠體金免疫層析法，該方法將inv A基因進(jìn)行原核表達(dá)并純化，將山羊抗體Ig Y用30 nm膠體金溶液標(biāo)記，分別包被于NC膜上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線。該方法準(zhǔn)確度高、方便快速。李倩茹等[22]建立了以熒光微球?yàn)闃?biāo)記物的熒光微球免疫層析檢測(cè)法，將抗體與羧基化的磁性微球偶聯(lián)，再將熒光微球免疫層析法與抗鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠相結(jié)合以濃縮和檢測(cè)食品中的鼠傷寒沙門氏菌。該法具有快速、特異、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。 　　2.5、 免疫組織化學(xué)法 　　免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry,IHC）也稱為免疫細(xì)胞化學(xué)法，是指特異

18、性抗體經(jīng)過(guò)顯色劑標(biāo)記后與組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行特異性結(jié)合并產(chǎn)生呈色反應(yīng)，以對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性、定量檢測(cè)的一種方法。此方法通過(guò)利用熒光顯微鏡、電子顯微鏡對(duì)細(xì)胞、亞細(xì)胞水平的抗原物質(zhì)（病原體、多肽、蛋白質(zhì)、激素、酶等）進(jìn)行顯像和放大來(lái)檢測(cè)各種抗原，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、適用廣泛的優(yōu)點(diǎn)。免疫組織化學(xué)技術(shù)主要包括免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)。黃策等[23]利用紅細(xì)胞吸附免疫熒光技術(shù)解決了熒光免疫快速檢測(cè)沙門氏菌中雜菌的干擾，但是該技術(shù)中的紅細(xì)胞使用前必須先用抗體致敏，并且紅細(xì)胞上由于抗體少，針對(duì)病原菌含量少的樣品可能會(huì)出現(xiàn)假陰性。他們后來(lái)建立了玻片固相抗體吸附免疫熒光技術(shù)，此技術(shù)是在顯微鏡載玻片

19、上固定抗菌抗體和未致敏紅細(xì)胞，其中抗體吸附病原菌，紅細(xì)胞僅作為熒光顯微鏡鏡檢的指示物。該技術(shù)與紅細(xì)胞吸附免疫熒光法相比敏感性更高，并且配制試劑更簡(jiǎn)便，易于在基層單位推廣。 　　2.6、 免疫擴(kuò)散法 　　免疫擴(kuò)散法（immunodiffusion,ID）是在抗原抗體的免疫沉淀反應(yīng)基礎(chǔ)上將瓊脂作為惰性載體，通過(guò)比較沉淀與抗原濃度的關(guān)系，可以定量檢測(cè)樣品中抗原（蛋白質(zhì)）含量。免疫擴(kuò)散法包括環(huán)狀免疫單擴(kuò)散法和雙向擴(kuò)散法。FELDSINE P T等[24]將改良免疫擴(kuò)散法與《細(xì)菌分析手冊(cè)》中方法進(jìn)行比較來(lái)檢測(cè)生肉和高污染食品中的沙門氏菌，此改良免疫擴(kuò)散法是加拿大農(nóng)業(yè)部建立

20、的方法，目的是在保持檢測(cè)時(shí)間為2 d的同時(shí)，在42℃四硫磺酸鈉煌綠肉湯中添加高溫選擇性富集步驟。在所檢測(cè)的320個(gè)樣品中，使用改良免疫擴(kuò)散法和《細(xì)菌分析手冊(cè)》培養(yǎng)方法的假陰性率分別為5.2%和3.5%，總體一致性達(dá)96.9%。GAST R K等[25]分別用熒光偏振和側(cè)向流免疫擴(kuò)散法來(lái)檢測(cè)孵化的雞蛋內(nèi)容物中腸炎沙門氏菌，結(jié)果顯示兩種方法在雞蛋內(nèi)容物中檢出限均為108CFU/m L（大多數(shù)為107CFU/m L），雖然快速檢測(cè)的靈敏度明顯低于培養(yǎng)法，但是用10 CFU腸炎沙門氏菌感染10個(gè)雞蛋并在25℃孵育72 h時(shí)，快速檢測(cè)法和培養(yǎng)法都可以檢測(cè)到病原菌。 　　2.7、 免疫傳感

21、器法 　　免疫傳感器法（immunosensor assay,IA）是根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)，將抗原（抗體）作為感應(yīng)元件與信號(hào)傳導(dǎo)器相結(jié)合，通過(guò)反應(yīng)待測(cè)抗體（抗原）的濃度來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的一種方法。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高。陳晨等[26]在納米金和石墨烯共沉積的絲網(wǎng)印刷碳電極表面用雙抗體夾心法建立了一個(gè)電化學(xué)免疫傳感器來(lái)進(jìn)行沙門氏菌的快速檢測(cè)，該傳感器具有特異、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，檢出限為1.18102CFU/m L。胡雨欣[27]采用免疫磁納米粒子進(jìn)行腸炎沙門氏菌的高效富集，并和雙通道等離子共振（surface plasmon resonance,SPR）傳感器偶合起來(lái)，建立了一種以

22、SPR傳感器進(jìn)行腸炎沙門氏菌檢測(cè)的新方法，該方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，檢測(cè)限為1.4 CFU/m L。馬駿爽等[28]將納米金、氧化石墨烯、氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料、氧化石墨烯/離子液體以電沉積方法分別修飾到絲網(wǎng)印刷電極上，并與酶標(biāo)抗體結(jié)合制備成四種免疫傳感器，綜合比對(duì)后結(jié)果顯示在免疫傳感器的各項(xiàng)指標(biāo)尤其是準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性方面離子液體和納米金材料明顯優(yōu)于其他材料。 　　2.8、 免疫色譜技術(shù) 　　免疫色譜技術(shù)（immunochromatographic technique,ICT）是以抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)。該方法首先在柱填料中偶聯(lián)抗原（抗體）來(lái)制備親和層

23、析柱，當(dāng)樣品通過(guò)層析柱后，就可以從混合樣品中將與抗原（抗體）特異性結(jié)合的免疫成分分離純化出來(lái)。免疫色譜法在近30年來(lái)發(fā)展迅速，具有高效、快速、安全的優(yōu)點(diǎn)，該方法選擇性最高并且分離純化最有效。YEUNG C Y等[29]建立了一種脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）探針-金納米顆粒免疫色譜法來(lái)檢測(cè)樣品中沙門氏菌的16S核糖體DNA，并將該方法與VITEK 2系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)比較，結(jié)果顯示該方法檢測(cè)159份樣品的敏感性為100%，特異性為94.93%,DNA純化后的檢測(cè)時(shí)間僅為30 min，是一種方便、快速、成本低的檢測(cè)方法。BAUTISTA D A等[30]評(píng)估了基于免

24、疫色譜的試紙條檢測(cè)家禽中沙門氏菌的敏感性和特異性，當(dāng)使用不同沙門氏菌菌種的純菌落時(shí)分析靈敏度為1104～1105CFU/m L；當(dāng)直接檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌感染的雞糞便時(shí)敏感性為12.3%，特異性為100%；與XLT4選擇性培養(yǎng)基相比當(dāng)樣品在2%BPW中預(yù)增菌后敏感性和特異性分別增加至93.8%和89%；隨后用TT肉湯增菌后敏感性和特異性分別提高至94.7%和96.8%。與在XLT4選擇性培養(yǎng)基分離病原菌相比，該試紙條檢測(cè)法在預(yù)增菌和增菌步驟會(huì)縮短18～48 h。 　　3 、分子生物學(xué)方法 　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)的逐漸發(fā)展，人們對(duì)生物體的認(rèn)識(shí)已經(jīng)到達(dá)微觀水平，通過(guò)檢

25、測(cè)病原微生物的核酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)，來(lái)進(jìn)行不同致病微生物、同一微生物不同抗原類型的分離鑒定[31]。許多沙門氏菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法以其快速、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)也逐漸被廣泛應(yīng)用。 　　3.1、 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) 　　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是一項(xiàng)體外基因擴(kuò)增技術(shù)，是由美國(guó)的MULLIS K等在1985年首次建立的[9]，具有檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)、敏感性高[10]的優(yōu)點(diǎn)，是一種目前廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法，但是操作比較復(fù)雜，檢測(cè)結(jié)果不太穩(wěn)定。常用的PCR檢測(cè)方法包括多重PCR法、熒光定量PCR法、免疫PCR法等。趙新等[

26、32]以沙門氏菌inv A基因作為目的基因，建立了檢測(cè)沙門氏菌微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)法，此方法不需要構(gòu)建質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)沙門氏菌含量。王青龍等[33]建立了實(shí)時(shí)熒光PCR來(lái)檢測(cè)食品中的亞利桑那沙門氏菌，特異性很好，檢測(cè)靈敏度為1～10 CFU/m L。PRASHANT S等[34]建立了雙重實(shí)時(shí)熒光PCR來(lái)檢測(cè)牛肉制品中大腸桿菌（Escherichia coli）、stx1、stx2基因和沙門氏菌（Salmonella），此方法利用內(nèi)標(biāo)形成具有高分辨率的兩個(gè)溶解曲線，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、成本低廉。程玲玲等[35]設(shè)計(jì)并篩選出三對(duì)特異性引物來(lái)進(jìn)行雞白痢沙門氏菌（

27、Salmonella pullorum）檢測(cè)，并且經(jīng)條件優(yōu)化得到一種含兩種DNA聚合酶的三重PCR反應(yīng)體系，該體系可以實(shí)現(xiàn)免核酸提取的直接PCR，檢測(cè)靈敏性高，檢出限 　　3.2、 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技術(shù)是2000年NOTOMI T等[36]開(kāi)發(fā)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是針對(duì)靶基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四種特異性引物，利用一種鏈置換脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）聚合酶在等溫條件（63℃左右）保溫30～60 min，即可完成核酸擴(kuò)

28、增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，LAMP具有簡(jiǎn)單、靈敏、成本低的特點(diǎn)，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳等過(guò)程[10]，適用于高通量檢測(cè)，但是對(duì)引物設(shè)計(jì)要求比較嚴(yán)格[37,38]。LI J等[39]建立了食品中沙門氏菌特異性基因62181533的LAMP法，檢出限為4.1 CFU/m L，具有高度特異性和靈敏性，檢測(cè)時(shí)間 　　3.3、 核酸探針技術(shù) 　　核酸探針技術(shù)的原理是堿基配對(duì)，核酸探針是指帶有標(biāo)記物的能識(shí)別特定核酸序列的脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）片段[42]，它能與其互補(bǔ)的核酸序列雜交形成雙鏈，可以用于待測(cè)核酸樣品中特定基因

29、序列的檢測(cè)。此技術(shù)具有快速、特異、敏感的特點(diǎn)[43]，已經(jīng)應(yīng)用于一些病原微生物的檢測(cè)和研究。目前已經(jīng)用于病原檢測(cè)的核酸探針有基因組DNA探針、互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,c DNA）分子探針和近些年來(lái)開(kāi)發(fā)出來(lái)的如Taq Man探針、分子信標(biāo)等寡核苷酸探針。ALMEIDA C等[44]利用新型肽核酸探針結(jié)合熒光原位雜交來(lái)檢測(cè)水、奶粉、糞便中的沙門氏菌，準(zhǔn)確度達(dá)到100%。袁慕云等[45]建立了基于Taq Man探針的沙門氏菌雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腸炎沙門氏菌和腸道沙門氏菌的同時(shí)檢測(cè)，該方法具有高靈敏度和強(qiáng)特異性，腸炎沙門

30、氏菌和腸道沙門氏菌的檢測(cè)限分別為260 CFU/m L和280 CFU/m L。ISABEL M等[43]篩選出了Sal-3和Sal-5兩個(gè)核酸序列作為檢測(cè)沙門氏菌的探針，Sal-3探針在鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌培養(yǎng)液中的檢測(cè)限（limit of detection,LOD）值分別為105CFU/m L和104CFU/m L,Sal-5探針的檢測(cè)限稍高于Sal-3探針，分別為104CFU/m L和104CFU/m L，檢測(cè)結(jié)果與PCR、ISO 6579標(biāo)準(zhǔn)方法一致。 　　3.4、 基因芯片技術(shù) 　　基因芯片的基本原理是雜交測(cè)序法，是指標(biāo)記樣品DNA與一組固定

31、于支持物上的核酸探針雜交，通過(guò)分析雜交的信號(hào)強(qiáng)度獲得樣品DNA序列?；蛐酒?991年由美國(guó)學(xué)者FODOR S P[46]提出的。不同于PCR、免疫分析等只能檢測(cè)一種或較少的幾種微生物基因片段、操作過(guò)程復(fù)雜，基因芯片技術(shù)可以同時(shí)對(duì)大量基因片段進(jìn)行分析[8]，具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化以及高通量的優(yōu)點(diǎn)，是目前可用于多種微生物檢測(cè)的快速方法之一，但也存在實(shí)驗(yàn)成本（探針合成、核酸標(biāo)記、數(shù)據(jù)分析）較高、測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定等問(wèn)題。許俊鋼[47]應(yīng)用基因芯片檢測(cè)了大腸菌群（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）和志賀氏菌（

32、Shigella castellani）共30份樣品，結(jié)果顯示其準(zhǔn)確率高，檢測(cè)時(shí)間在8 h內(nèi)，檢測(cè)效率顯著提高。LI Y[48]利用可視化DNA微矩陣技術(shù)結(jié)合多重PCR方法來(lái)檢測(cè)常見(jiàn)的致病菌，包括大腸菌群、沙門氏菌、志賀氏菌和單增李斯特菌，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)包括沙門氏菌在內(nèi)的14種致病菌陽(yáng)性的食品及菌液，結(jié)果顯示檢出限為102CFU/m L，是一種快速、特異、高通量的檢測(cè)方法。 　　3.5、 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù) 　　擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（amplified fragment length polymorphism,AFLP）的基本原理是先用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行基因

33、組DNA的雙酶切，產(chǎn)生不同分子質(zhì)量大小的隨機(jī)DNA片段，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)不同長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段進(jìn)行多態(tài)性分析。此技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，在微生物研究方面的應(yīng)用較為廣泛[1]，但是對(duì)內(nèi)切酶質(zhì)量和DNA純度要求很嚴(yán)格。目前AFLP技術(shù)在沙門氏菌研究方面報(bào)道較少。有學(xué)者[1]對(duì)含有62個(gè)血清型的78株沙門氏菌菌株進(jìn)行了AFLP指紋圖譜分析后，結(jié)果顯示每一個(gè)血清型都有獨(dú)特的AFLP指紋圖，并且AFLP指紋的分辨率較高，可以因此區(qū)分不同菌株。 　　4 、新型檢測(cè)方法 　　4.1、 生物傳感器檢測(cè)技術(shù) 　　生物傳感器是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感并將其濃度

34、轉(zhuǎn)化為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器，是由固定化的生物分子識(shí)別元件（如微生物、細(xì)胞、組織、酶、抗原、抗體等生物活性物質(zhì)）、適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換器（如光敏管、氧電極、壓電晶體）及信號(hào)放大裝置組成的分析系統(tǒng)。目前用于檢測(cè)沙門氏菌的傳感器有酶?jìng)鞲衅?、電化學(xué)傳感器、免疫傳感器、基因傳感器、光敏傳感器等[7]。生物傳感器具有準(zhǔn)確度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。嚴(yán)杏[49]建立了一種DNA適配體傳感器來(lái)檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi)A，其基本原理是熒光疊加、熒光能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）和限制性內(nèi)切酶酶解作用

35、。其中限制性內(nèi)切酶I介導(dǎo)的靶標(biāo)循環(huán)可以將熒光信號(hào)放大，當(dāng)靶標(biāo)濃度為1102～11011cells/m L時(shí)，熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系良好，檢測(cè)下限為1102cells/m L，結(jié)果顯示該方法具有高度靈敏性和特異性。CHEN I H等[50]利用噬菌體包被的ME傳感器建立兩種檢測(cè)模式，以比較雞肉中沙門氏菌的檢測(cè)效果，結(jié)果表明在檢測(cè)雞肉表面時(shí)，添加了7.86105CFU/mm2沙門氏菌的噬菌體C4-22傳感器與未添加的噬菌體對(duì)照傳感器相比顯示出12倍以上的沙門氏菌結(jié)合能力。王月等[51]利用生物素-脫氧核糖核苷三磷酸（biotin-deoxy-ribonucleoside triphosphate,B-

36、d NTP）改良了沙門氏菌目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了以核酸橫流生物傳感器為檢測(cè)依據(jù)的沙門氏菌可視化檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)快速、結(jié)果直觀，檢出限為10 CFU/m L。 　　4.2、 納米技術(shù) 　　納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（1～100 nm）的材料[52]，具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)的基本特征。將納米材料與電子材料、生物學(xué)結(jié)合起來(lái)，就可以利用如酶、抗體等特定識(shí)別分子來(lái)分析待測(cè)樣品，并產(chǎn)生特定信號(hào)。納米材料應(yīng)用于食品中致病菌檢測(cè)方面的技術(shù)包括納米生物傳感器技術(shù)、納米金免疫標(biāo)記技術(shù)、納米磁分離技術(shù)等。納米材料如氧化石

37、墨烯、碳納米管、等離子體金、磁珠等被用作生物傳感器的傳感部分，已經(jīng)應(yīng)用于致病菌的檢測(cè)[53]。將納米技術(shù)與常規(guī)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，具有大批量檢測(cè)、方便快捷、靈敏度高[8]的優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)檢測(cè)成本和技術(shù)水平要求較高。徐連應(yīng)等[54]建立了一種基于復(fù)合納米材料和酶切信號(hào)的電化學(xué)傳感器，已經(jīng)成功檢測(cè)出羊奶中的沙門氏菌，檢測(cè)敏感性為200 CFU/m L，具有檢測(cè)限低、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于食品中沙門氏菌的快速定量檢測(cè)。LIU X等[55]利用夾心免疫分析法原理，將免疫傳感器結(jié)合抗體修飾Fe3O4磁性納米（immunosensor combining antibody-functionaliz

38、ed Fe3O4magnetic nanoparticles,immuno MNPs）構(gòu)建了一個(gè)表面等離子共振（surface plasmon resonance,SPR）傳感器，用于腸炎沙門氏菌的快速檢測(cè)。此方法的檢測(cè)限為14 CFU/m L，與immuno MNPs結(jié)合的SPR免疫傳感器與腸炎沙門氏菌常規(guī)SPR傳感器相比，其靈敏度提高了4個(gè)數(shù)量級(jí)。該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的SRP傳感器具有成本低、簡(jiǎn)便、高度敏感的特點(diǎn)，有望成為食品中致病菌檢測(cè)的新方法。肖穩(wěn)等[56]研究了一種羧甲基殼聚糖-分子信標(biāo)-金納米合成材料，根據(jù)以分子信標(biāo)共價(jià)功能化為基礎(chǔ)的殼聚糖技術(shù)，利用金納米比色方法來(lái)進(jìn)行鼠傷寒沙門氏菌SSe

39、C基因的檢測(cè)，該方法的靈敏度和特異性較高，對(duì)目的基因的檢測(cè)下限為50 nmol/L。 　　4.3、 基于適配體的檢測(cè)技術(shù) 　　適配體是采用指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）從人工合成的隨機(jī)文庫(kù)中篩選出的一段寡核苷酸序列，該序列對(duì)相應(yīng)的配體具有高度親和力和特異性。核酸適配體作為一種新型識(shí)別分子，具有制備方便、可體外化學(xué)合成、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[57]，并且比抗體的制備周期短、特異性高，但是該技術(shù)目前檢測(cè)的致病菌種類比較少，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)還存

40、在較大難度[58]。近年來(lái)已經(jīng)篩選出多種致病菌的適配體并應(yīng)用于食品檢測(cè)，基于適配體檢測(cè)食品中沙門氏菌的技術(shù)也在逐漸發(fā)展。段諾[59]首先將適配體、磁性納米顆粒、雙色上轉(zhuǎn)換納米顆粒分別作為識(shí)別元件、捕獲探針和顯示探針，與上轉(zhuǎn)換激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)結(jié)合起來(lái)，建立了一種同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌和金黃色葡萄菌的方法，鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限分別為5 CFU/m L和8 CFU/m L；其次基于適配體識(shí)別和量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)，并與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，建立了同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌和副溶血性弧菌的方法，結(jié)果顯示該方法與平板計(jì)數(shù)法無(wú)顯著差異；最后根據(jù)Accu Blue染料具有弱熒光強(qiáng)度，結(jié)合雙鏈DNA后產(chǎn)生高熒光強(qiáng)

41、度，結(jié)合單鏈DNA后熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，建立了無(wú)標(biāo)記熒光適配體傳感器，分別實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌和副溶血性弧菌的檢測(cè)，檢測(cè)限為25 CFU/m L、35 CFU/m L。賈飛[60]首先基于適配體識(shí)別和還原氧化石墨烯-納米金制備了新型電流型傳感器，對(duì)食品中沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為80 CFU/m L(S/N=3）；其次利用一步電沉積法還原氧化石墨烯-碳納米管復(fù)合納米材料，構(gòu)建了基于適配體的新型無(wú)標(biāo)記電化學(xué)傳感器來(lái)檢測(cè)沙門氏菌，檢出限為25 CFU/m L(S/N=3）。蔣曉華等[61]根據(jù)合成的金屬有機(jī)骨架材料（Uio-66-NH2）的熒光猝滅特性和適配體的識(shí)別作用，制備了熒光生物傳感器來(lái)檢測(cè)蝦肉樣

42、品中的沙門氏菌，該傳感器的靈敏度、特異性較好，檢出限（S/N=3）為7 CFU/m L。 　　5 、結(jié)論與展望 　　食品中微生物檢測(cè)對(duì)于保證人們的飲食健康有重要意義，尤其是近年來(lái)致病菌感染受到了人們的廣泛關(guān)注。沙門氏菌作為常見(jiàn)的致病菌在畜禽類及其制品中的感染逐漸增多，沙門氏菌檢測(cè)方法也在不斷發(fā)展。 　　最常用的沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)有傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法和分子生物學(xué)檢測(cè)法。傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，檢測(cè)成本低，但是操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，目前該方法仍然是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織認(rèn)可的沙門氏菌檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。免疫學(xué)檢測(cè)方法的

43、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)批量多、檢測(cè)速度快，能夠廣泛應(yīng)用到沙門氏菌檢測(cè)中，但是操作中多次洗滌容易引起交叉污染和假陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果主要由一抗的質(zhì)量決定，而一抗的制備需要大量時(shí)間去摸索，并且目前無(wú)法檢測(cè)所有的沙門氏菌血清型。分子生物學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速，但是所需的儀器費(fèi)用高，對(duì)檢測(cè)人員、檢測(cè)條件和環(huán)境的要求比較嚴(yán)格，如PCR技術(shù)在引物設(shè)計(jì)、操作環(huán)境方面容易引起不穩(wěn)定結(jié)果；基因芯片的標(biāo)記技術(shù)、增強(qiáng)芯片檢測(cè)靈敏性等技術(shù)問(wèn)題需要進(jìn)一步優(yōu)化。生物傳感器技術(shù)、納米技術(shù)、基于適配體檢測(cè)技術(shù)等新型檢測(cè)技術(shù)為建立沙門氏菌快速檢測(cè)方法提供了技術(shù)支撐，但是存在技術(shù)要求嚴(yán)格、實(shí)驗(yàn)成本高等問(wèn)題，其中基于適配體

44、的檢測(cè)技術(shù)還需要提高適配體篩選效率、研究適配體與靶分子的結(jié)和作用機(jī)制。 　　聯(lián)合使用兩種或兩種以上方法能適當(dāng)彌補(bǔ)單一檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生的缺陷，將傳統(tǒng)的生化檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來(lái)用于致病菌的檢測(cè)，才能提高病原微生物的研究和檢測(cè)水平。將一些新型技術(shù)與常規(guī)檢測(cè)方法聯(lián)合使用，促進(jìn)了沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展。目前由于高技術(shù)要求、成本費(fèi)用高等原因，大多數(shù)新型檢測(cè)技術(shù)僅在實(shí)驗(yàn)室研究階段。一項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)能否得到廣泛應(yīng)用，除了檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)外，還與成本較低、接近實(shí)際應(yīng)用有關(guān)。隨著人們對(duì)食品安全的密切關(guān)注和食品衛(wèi)生監(jiān)管的快速檢測(cè)要求，開(kāi)發(fā)靈敏度高、快速準(zhǔn)確、成本較低、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是今后檢測(cè)食品中沙門氏菌的重要研究方向。