結(jié)直腸癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表達及意義

《結(jié)直腸癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表達及意義》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《結(jié)直腸癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表達及意義（4頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、結(jié)直腸癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表達及意義 【摘要】 目的 檢測結(jié)直腸癌組織中黑色素瘤抗原基因mage1、3和4的表達，探討其在結(jié)直腸癌免疫治療及作為免疫分子標(biāo)志物的可行性。方法 采用rtpcr方法，檢測65例結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)正常粘膜組織中mage1、3和4的mrna表達，并對pcr擴增產(chǎn)物進行dna測序驗證。結(jié)果 65例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，53.8%（35/65)的患者至少表達一種mage基因。mage1、3、4 mrna表達率分別是18.5%(12/65)、33.9%(22/65)和20%(13/65)，表達任意兩種或以上的mage基因的標(biāo)本為27.7%(18/65)，

2、而相應(yīng)正常粘膜組織均未檢測到上述基因的表達。dna測序結(jié)果表明rtpcr產(chǎn)物確為目的基因片段。mage基因表達與患者的年齡(除外mage1,p=0.011)、性別、cea、腫瘤大小和位置、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度及tnm分期無關(guān)(p>0.05)。結(jié)論 結(jié)直腸癌中mage3可作為腫瘤疫苗的備選基因和免疫學(xué)檢測的分子標(biāo)志物，具有作為腫瘤免疫治療特異性靶位的潛在價值，而mage1,4因表達率低限制了其應(yīng)用價值。 【關(guān)鍵詞】 黑色素瘤抗原基因 結(jié)直腸腫瘤 mrna表達 黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene，mage）是首先從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤特異

3、性抗原基因，主要表達于以黑色素瘤為主的惡性腫瘤組織中，現(xiàn)已證實在肝、胃、肺等惡性腫瘤中有較高的表達，而在正常組織（除睪丸和胎盤外）不表達[1]，其表達又與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系十分密切。WWw.133229.coM利用這一特點可作為腫瘤免疫治療理想的靶抗原。應(yīng)用mage基因編碼的抗原肽對黑色素瘤及轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤免疫治療的實驗和臨床研究正在進行，并已取得較好的療效[2,3]。但mage基因在結(jié)直腸癌中表達的研究較少且結(jié)果不一。為了解mage基因在結(jié)直腸癌中的表達特點，我們采用rtpcr方法檢測mage1、3和4在結(jié)直腸癌中表達狀況，為研制結(jié)直腸癌特異性的腫瘤疫苗及開展以此為靶抗原的免疫治療

4、提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 組織標(biāo)本 65例結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)的正常粘膜組織標(biāo)本，均取自2005年7月～11月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院手術(shù)治療的患者。男44例，女21例；年齡30～80歲，中位年齡55.0歲。其中，高中分化腺癌57例；粘液腺癌3例，復(fù)發(fā)2例；低分化癌2例，復(fù)發(fā)1例。腫瘤分期和分級根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果按最新國際抗癌協(xié)會tnm分期[4]，who標(biāo)準(zhǔn)分級，其中ⅰ期8例，ⅱ期32例，ⅲ期16例，ⅳ9例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。所有病例術(shù)前均未進行放化療。標(biāo)本采集：癌組織取癌灶周邊無明顯壞死的腫瘤組織，正常組織取自距病灶10cm以上的正常粘

5、膜，組織大小約1cm1cm1cm。標(biāo)本在手術(shù)切除后10min內(nèi)放入液氮凍存，后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實。睪丸組織用作陽性對照。 1.2 方法 1.2.1 rna提取及逆轉(zhuǎn)錄 用trizol提取組織總rna，紫外分光光度計測od值，以od260/od280＝1.8～2.0為rna質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含總rna 3μg，oligo(dt)18 0.5μg，10mmol/ldntp 2μl，rnase抑制劑20u，逆轉(zhuǎn)錄酶200u，總體積為20μl。逆轉(zhuǎn)錄完畢后70℃變性10min，冰上冷卻后-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。以上所用器材均為rnase free

6、。gapdh用作內(nèi)參照。 1.2.2 mage1、mage3和mage4基因的擴增（25μl反應(yīng)體系） 以1μl cdna為pcr擴增模板，加1.5μl mgcl2，2.5μl 10buffer，1μl dntps ，1μl引物(包括mage、gapdh)，0.2μl taq 酶，16.8μl 滅菌水。各基因的引物[5]及反應(yīng)條件見表1。反應(yīng)完成后取5μl pcr產(chǎn)物，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，少量溴乙錠染色鑒定。于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果。采用biorad凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片。表1 rtpcr引物序列和反應(yīng)條件 1.2.3 mage1、mage3和mage

7、4基因擴增產(chǎn)物dna的測序 隨機選取三種mage基因的陽性pcr產(chǎn)物（各3例）進行純化和序列測定。pcr產(chǎn)物純化采用bioflux試劑盒，操作按說明進行。送上海捷瑞生物工程有限公司進行dna測序。 1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件spss10.0對數(shù)據(jù)進行pearson χ2 檢驗或fisher確切概率法檢驗,以p2 結(jié)果 2.1 不同mage基因的表達 mage1、3和4三種基因在不同結(jié)直腸癌組織標(biāo)本表達情況見表2。65例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中mage mrna表達頻率最高的是mage3，表達率為33.9%(22/65)，mage1和mage4分別是1

8、8.5%(12/65)和20%(13/65)。內(nèi)參照gapdh在所有組織標(biāo)本中均有穩(wěn)定表達，且強度基本一致，證實逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna的完整性,見圖1。dna測序證實擴增條帶均為目的基因。所有正常粘膜組織中均未檢測出上述mage基因中任何一種的表達。表2 結(jié)直腸癌組織mage1、3和4基因的陽性表達 2.2 mage基因表達與臨床病理特征的關(guān)系 三種mage基因的表達與患者年齡(除外mage1，p=0.007)、性別、cea、腫瘤大小和位置、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及tnm分期無關(guān)，結(jié)果見表3。 2.3 結(jié)直腸癌標(biāo)本中mage基因表達的聚集性 65例癌組織中三

9、種mage基因表達呈不均勻分布，部分癌組織基因表達呈聚集性。53.8%(35/65)的癌癥患者至少表達一種抗原基因，其中mage1、3同時表達為12.3%(8/65)，mage1、4為10.7%(7/65)，mage3、4為9.2%(6/65)，三種同時表達9.2%(6/65)。 2.4 三種mage基因擴增產(chǎn)物dna的測序 dna測序表明三種mage基因的rtpcr產(chǎn)物與genebank數(shù)據(jù)庫（mage1、3、4基因的登錄號分別為nm_004988.3、nm_005362.3、nm_001011548.1）檢索序列一致，證實所得目的基因的序列正確。 3 討論

10、 mage基因家族位于x染色體上，除睪丸和胎盤組織外，在正常組織中均不表達，但在肝、胃、肺等惡性腫瘤中表達，其編碼的抗原肽可與mhc分子表3 mage基因表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系注：*為淋巴結(jié)陰性組與陽性組mage表達率比較的p值，#為淋巴結(jié)n1組與n2組比較的p值結(jié)合遞呈到細胞表面，被t細胞識別，從而激活抗腫瘤免疫應(yīng)答[1]。因此mage基因編碼蛋白成為腫瘤免疫治療的靶抗原，以此抗原為主組成的疫苗是目前腫瘤疫苗研究和應(yīng)用的熱點[2,3]。自1991年van der bruggen 等用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)首次在黑色素瘤細胞中分離出mage1基因以來，許多學(xué)者對不同mage基因在不同惡性腫

11、瘤組織的表達進行了廣泛研究，但有關(guān)mage基因在結(jié)直腸癌中表達的報道很少且各家報道的結(jié)果不一。scanlan等[6]在關(guān)于mage基因的綜述中提出結(jié)直腸癌屬于mage基因低表達的腫瘤(以不足30％的基因家族在一種腫瘤中的表達率>20%為標(biāo)準(zhǔn))。park等[7]研究38例結(jié)直腸癌病例的結(jié)果顯示，mage1未見一例表達，mage3和mage4陽性表達率分別為5.3%和16.7%，有36.3%的腫瘤標(biāo)本至少表達一種基因，其表達與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分型、dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(p>0.05)。本實驗僅有mage1表達與年齡有關(guān)(p=0.011)，分析原因可能與本組病例老年患者偏

12、少有關(guān)。gerhardt等[8]研究26例結(jié)直腸癌手術(shù)病例的癌組織及癌旁組織、手術(shù)切緣和8種細胞株的16種腫瘤抗原基因(主要為mage)的表達情況，認為85%的標(biāo)本至少表達一種腫瘤抗原，其中mage1表達率為58%，而mage3未見表達。而li等[5]研究121例結(jié)直腸癌標(biāo)本結(jié)果顯示mage1、3和4的陽性表達率分別為11.6%、27.3%、22.3%。 本實驗結(jié)果顯示mage基因1、3和4的陽性表達率分別為18.5%、33.9%和20%，以mage3表達率較高，53.8%(35/65)的患者至少表達一種抗原基因，而表達與性別、cea值、腫瘤大小、位置、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、

13、腫瘤浸潤深度、組織學(xué)分級及tnm分期無關(guān)，提示這些基因與腫瘤進展情況及惡性程度無關(guān)，這與文獻報道的結(jié)果相似。相應(yīng)正常結(jié)直腸粘膜組織均未檢測到基因表達，證實了mage在結(jié)直腸癌中的特異性表達，并有理由認為mage編碼抗原可能成為結(jié)直腸癌特異性免疫治療的攻擊靶點。同時分析結(jié)直腸癌組織相同基因研究結(jié)果，各家不一，我們認為原因可能有：①標(biāo)本數(shù)不同或標(biāo)本量太少不能說明整體情況；②pcr引物設(shè)計及技術(shù)條件的差異；③不同人種表達的hla分子類型不盡相同。 對mage基因表達的分析還發(fā)現(xiàn)，在所檢測的65例標(biāo)本中呈不均勻分布，表達任意兩種mage基因的標(biāo)本為27.7%(18/65)，三種同時表達9.2%(

14、6/65)，呈聚集性表達，即表達一種mage家族基因的標(biāo)本可同時表達其他一種或兩種以上的同一家族基因。mage基因聚集性表達為使用多價疫苗、增強免疫反應(yīng)提供了可能。本實驗結(jié)果顯示mage3在國人結(jié)直腸癌中較高表達而正常組織不表達。這種現(xiàn)象就使臨床上有可能將其編碼蛋白作為免疫源用于結(jié)直腸癌的腫瘤免疫治療，而mage1和4因其較低的表達率限制了應(yīng)用價值，與上述研究者的預(yù)期結(jié)果相吻合。同時我們還注意到在tnm分期ⅰ、ⅱ的早期病例即有較高的表達（mage1、3和4的表達率分別為22.5%、32.5%和25％），說明mage表達有可能是結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的早期事件，檢測mage基因表達有可能作為結(jié)

15、直腸癌免疫學(xué)檢測的分子標(biāo)志物，并且具有作為免疫治療、基因治療特異性靶位的潛在價值。 mage基因在結(jié)直腸癌組織的確切表達機制和功能還沒有完全研究清楚。dna甲基化是目前被廣泛接受的關(guān)于mage基因表達與沉默的機制，特別是啟動子區(qū)域cpg 島甲基化的狀態(tài)直接影響基因的轉(zhuǎn)錄失活和表達[9]。dna甲基化異常一般發(fā)生在腫瘤發(fā)生的早期階段，而本實驗結(jié)果并未顯示mage基因的表達與腫瘤分期有關(guān)。因此，進一步深入研究結(jié)直腸癌組織中dna甲基化對其表達調(diào)控的影響也是今后我們要研究的課題。 【參考文獻】[1]ries j,schultzemosgau s,neukam f,et al.invest

16、igation of the expression of melanoma antigenencoding genes (magea1 to a6) in oral squamous cell carcinomas to determine potential targets for genebased cancer immunotherapy[j].int j oncol,2005,26 (3):817824. [2]mahdian r,kokhaei p,najar hm,et al. dendritic cells,pulsed with lysate of allogene

17、ic tumor cells,are capable of stimulating mhcrestricted antigenspecific antitumor t cells[j].2006，23(2):273282. [3]hersey p,menzies sw,coventry b,et al.phaseqⅰ/ⅱ study of immunotherapy with tcell peptide epitopes in patients ⅳ melanoma[j].cancer immunol immunother,2005,54(3):208218. [4]gospod

18、arowicz mk,miller d,groome pa,et al.the process for continuous improvement of the tnm classification[j].cancer,2004,100(1):15. [5]li m,yuan yh,han y,et al.expression profile of cancertestis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue[j].clin cancer res,2005,11(5): 1809

19、1814. [6]scanlan mj,simpson aj,old lj.the cancer/testis genes: review,standardization,and commentary[j].cancer immun,2004,4:1.review [7]park ms,park jw,jeon ch,et al. expression of melanoma antigenencoding genes (mage) by common primers for magea1 toa6 in colorectal carcinomas among koreans[j].korean med sci,2002,17(4):497501. [8]gerhardt a,usener d,keese m,et al.tissue expression and seroreactivity of tumorspecific antigens in colorectal cancer[j]. cancer lett,2004,208 (2):197206.