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1、實驗六 細菌生化特性試驗 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 2021年 2月 21日星期日 實驗原理 各種細菌在其新陳代謝中，由于利用營養(yǎng) 物質(zhì)的能力有所差異，排泄的代謝產(chǎn)物亦 不同，所以利用這點進行生化試驗，可達 到鑒定細菌種的目的，尤其在鑒定腸道桿 菌時，生化試驗是極其常用的一種方法。 一、目的要求 1. 學(xué)習(xí)常用的生化實驗方法； 2. 掌握 大腸桿菌與沙門氏菌 的主要生化特點。 個體為桿狀 散在或成對 G 二、背景知識介紹 1. 大腸桿菌 中等大小 0.4-0.7 2-3m 大腸埃希氏菌是這個菌群的代表成原； 與廣泛的獸醫(yī)臨床病征有關(guān)，如： 犢牛的腸道感染和水瀉； 幼豬的水瀉和腹瀉，斷奶仔豬水腫??； 狗
2、的尿道感染； 雞：臍炎、眼炎、腸炎、肝周炎、肺炎、 氣囊炎、腹膜炎、肉芽腫等 。 個體為桿狀 散在或成對 G 2. 沙門氏菌 是一大群寄生于人和動物腸道內(nèi)、生化特性和抗原結(jié)構(gòu) 相似， G，兼性厭氧的無芽胞直桿菌。 在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和公共衛(wèi)生上均十分重要： 絕大多數(shù)沙門氏菌對人和動物有致病性； 能致人和動物多種不同臨床表現(xiàn)的沙門氏菌??； 人類食物中毒的主要病原之一。 傷寒沙門氏菌 鼠傷寒沙門氏菌 除 雛沙門 和 雞沙門氏菌 外， 其余各菌具有周生鞭毛。 三、實驗材料 1. 常規(guī)接種工具：接種棒、酒精燈等 2. 革蘭氏染色液、玻片、滴管 等 3. 菌種 : 大腸桿菌的普通瓊脂（或麥康凱）培養(yǎng)物（ 1個
3、 /組） 沙門氏菌的普通瓊脂（或麥康凱）培養(yǎng)物（ 1個 /組） 大腸桿菌、沙門氏菌的鄧亨氏蛋白胨水培養(yǎng)物； 大腸桿菌、沙門氏菌的葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物。 4. 培養(yǎng)基： 三糖鐵斜面（ 1支 /人） 5. 生化管： 葡、乳、麥、甘、蔗、 H2S 、尿、枸（ 1套 /人） 6. 試劑： 吲哚試劑、 M.R試劑、 V-P試劑 等 四、實驗內(nèi)容 1. 觀察 大腸桿菌在普通瓊脂上的生長表現(xiàn)； 大腸桿菌在麥康凱平板上生長表現(xiàn)； 沙門氏菌在普通瓊脂上的生長表現(xiàn)； 沙門氏菌在麥康凱平板上生長表現(xiàn)； 大腸桿菌與沙門氏菌的革蘭氏染色、鏡檢； 記錄結(jié)果。 2. 三糖鐵瓊脂接種 挑取待試菌菌落穿刺接種三糖鐵底部并涂布于
4、斜面； 置 37 培養(yǎng)。 3. 生化管接種培養(yǎng) 糖發(fā)酵試驗： 葡 乳 麥 甘 蔗 H2S試驗； 尿素酶試驗； 枸櫞酸鹽利用試驗。 葡 乳 麥 甘 蔗 H 2S 尿 枸 葡 乳 麥 甘 蔗 H2S 尿 枸 大腸桿菌 沙門氏菌 大腸桿菌 沙門氏菌 置 37 培養(yǎng) 4. 吲哚試驗 接種大腸桿菌或沙門氏菌于 5mL鄧亨氏蛋白胨水中 ，置 37 培養(yǎng) 3-5d； 靜置分層后，沿試管壁加入吲哚試劑 1mL； 上層變?yōu)榧t色者為陽性反應(yīng)。 乙醚 混勻 分層 吲哚試劑 陽性 陰性 吲哚試驗原理 蛋白質(zhì)中的色氨酸 有些細菌 如大腸埃希氏菌 吲哚 對位二甲基氨基 苯甲醛 + 玫瑰吲哚 紅色 試劑配方一： 對二甲基氨
5、基苯甲醛 1g 無水乙醇 95mL 濃鹽酸 20mL 試劑配方二： 對 二甲基 氨基苯甲醛 5g 戊醇（或異戊醇） 75mL 濃鹽酸 25mL 先用乙醇溶解試劑后加鹽酸，避光保存。 5. M.R試驗 接種大腸桿菌或沙門氏菌于 5mL葡萄糖蛋白胨水中， 置 37 培養(yǎng) 3-5d）； 于培養(yǎng)物中加入幾滴試劑； 變紅色者為陽性反應(yīng)， 桔紅到黃色則為陰性。 M.R試劑 陽性 陰性 6. V-P試驗 接種大腸桿菌或沙門氏菌于 1mL葡萄糖蛋白胨水中， 置 37 培養(yǎng) 3-5d）； 于培養(yǎng)物中加入 0.5mL V-P甲液； 隨后加 V-P乙液 0.5mL，輕搖； 靜置 10-15min。 15min內(nèi)變紅
6、者為陽性。 V-P甲液 V-P乙液 陽性 陰性 M.R與 V-P試驗原理 M.R試驗 ： 甲基紅是一種 pH指示劑： 當細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸且產(chǎn)酸量大時； 在加入甲基紅指示劑后顯紅色為陽性。 pH 4.4 - 6.2 紅 黃 葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 2,3-丁二烯醇 某些細菌能發(fā)酵 二乙酰 堿 V-P試驗 ： + 胨中的胍基化合物 注意： 通常 M.R和 V-P試驗是密切相關(guān)： 如果一個微生物 M.R是陽性，則 V-P是陰性；或者相反。 粉 紅 色 化 合 物 + M.R試劑 V-P試劑 甲基紅 0.02g 95酒精 60mL 蒸餾水 40mL 甲液： 萘酚酒精溶液 （ 萘酚 5g無水乙醇
7、 100mL） 乙液： KOH溶液 （ KOH 40g，水 100ml） 將甲液和乙液分裝棕色瓶中，于 4-10 保存。 五、結(jié)果觀察 1. 大腸桿菌的生長表現(xiàn) 普通瓊脂 ：形成圓形、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落， 直徑約 23mm； 麥康凱 ： 瓊脂上形成 紅色菌落 較大的菌落。 三糖鐵瓊脂 斜面 產(chǎn)酸（黃色） 底部 產(chǎn)酸（黃色） 產(chǎn)氣 H2S 反應(yīng)模式表示 ： A A ； 2. 沙門氏菌的生長表現(xiàn) 普通瓊脂 ：生長不良； 麥康凱 ： 瓊脂上形成 灰白色菌落 。 三糖鐵瓊脂 斜面 產(chǎn)堿（紅色） 底部 產(chǎn)酸（黃色） 產(chǎn)氣 H2S 反應(yīng)模式表示 ： K A ( ) ； ( ) 3. 細菌的染色、鏡檢 大腸桿菌 沙門氏菌 G 直桿菌，大小 0.4-0.7 2-3m， 無芽胞，兩端鈍圓，散在或成對。 4. 生化管接種培養(yǎng) 葡 乳 麥 甘 蔗 H 2 S 尿 枸 葡 乳 麥 甘 蔗 H 2 S 尿 枸 大腸桿菌 沙門氏菌 /- 5. 吲哚、 M.R、 V-P試驗結(jié)果 大腸桿菌 沙門氏菌 吲 哚 試 驗 M.R 試 驗 V-P 試 驗 吲 哚 試 驗 M.R 試 驗 V-P 試 驗 六、思考題 1. 革蘭氏染色特性與形態(tài)特點？ 2. 在麥康凱平板上的生長表現(xiàn)？ 3. 在三糖鐵瓊脂上的生長表現(xiàn)？ 4. 常規(guī)糖發(fā)酵情況？ 5. IMViC試驗結(jié)果？ 大腸桿菌與沙門氏菌 ：
實驗五 大腸桿菌與沙門氏菌.ppt
