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1、 實驗五、植物組織中過氧化氫酶活力測定高錳酸鉀滴定法 一、實驗目的l 1.掌握酶活力測定的方法l 2.了解過氧化氫酶在生物體中的作用原理 二、實驗原理l過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。l R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3+OH)l R(Fe3+OH)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2 l據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應系統(tǒng)中加入一定量（反應過量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應后，用標準高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2，即可
2、求出消耗的H2O2的量。l 5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4 =5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 三、材料、試劑與器具 1.材料：小麥葉片2.試劑（1）10% H2SO4；（2）0.2mol/L磷酸緩沖液pH7.8；（3）0.1mol/L高錳酸鉀標準液：稱取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標定；（4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大約等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標準0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性條件下）進行標定；（5）0.1mo
3、l/L草酸：稱取優(yōu)級純H2C2O4 2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。 3.器具（1）恒溫水??；（2）研缽；三角瓶50ml4；酸式滴定管（10ml）；容量瓶25ml1等 四、實驗步驟1.酶液提取l取小麥葉片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將緩沖洗液轉入容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。 2.反應l取50ml三角瓶4個（兩個測定兩個對照），測定瓶中加入酶液2.5ml，對照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時計時，于
4、30恒溫水浴中保溫10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。3.滴定l用0.1mol/L KMn4標準溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點。 五、計算l酶活力用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示l酶活(mgH2O2/gmin)=l式中： A對照KMnO4滴定毫升數(shù)； B酶反應后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT酶液總量（ml）； V1反應所用酶液量（ml）； F W樣品鮮重（g）； 1.71ml 0.1mol/L的KMnO 4相當于1.7mg H2O2 ( ) .A B VFW V tT 171 六、研討題l 1.影響過氧化氫酶活力測定的因素有哪些?l 2.過氧化氫酶與哪些生化過程有關?l 3.過氧化氫酶的活力測定還有另外一種方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活力。請你查閱資料設計一個應用該方法測定過氧化氫酶活力的實驗。
實驗五、植物組織中過氧化氫酶的活力測定
