沙門(mén)氏菌的檢測(cè)鑒定課件.ppt

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1、沙 門(mén) 氏 菌 的 檢 測(cè) 及 鑒 定楊 淑 霞 設(shè) 備 和 材 料 除 微 生 物 實(shí) 驗(yàn) 室 常 規(guī) 滅 菌 及 培 養(yǎng) 設(shè) 備 外 ， 其 他 設(shè) 備 和 材 料 如 下 ： 2.1 冰 箱 ： 2 5 。 2.2 恒 溫 培 養(yǎng) 箱 ： 36 1 ， 42 1 。 2.3 均 質(zhì) 器 。 2.4 振 蕩 器 。 2.5 電 子 天 平 ： 感 量 0.1 g。 2.6 無(wú) 菌 錐 形 瓶 :容 量 500 mL， 250 mL。 2.7 無(wú) 菌 吸 管 ： 1 mL（ 具 0.01 mL刻 度 ） 、 10 mL（ 具 0.1 mL刻 度 ） 或微 量 移 液 器 及 吸 頭 。 2.

2、8 無(wú) 菌 培 養(yǎng) 皿 ： 直 徑 90 mm。 2.9 無(wú) 菌 試 管 ： 3 mm 50 mm、 10 mm 75 mm。 2.10 無(wú) 菌 毛 細(xì) 管 。 2.11 pH計(jì) 或 pH比 色 管 或 精 密 pH試 紙 。 2.12 全 自 動(dòng) 微 生 物 生 化 鑒 定 系 統(tǒng) 。 3 培 養(yǎng) 基 和 試 劑 3.1 緩 沖 蛋 白 胨 水 （ BPW） 。3.2 四 硫 磺 酸 鈉 煌 綠 （ TTB） 增 菌 液 。3.3 亞 硒 酸 鹽 胱 氨 酸 （ SC） 增 菌 液 。3.4 亞 硫 酸 鉍 （ BS） 瓊 脂 。3.5 HE瓊 脂 ： 見(jiàn) 附 錄 A中 A.5。3.6 木

3、糖 賴 氨 酸 脫 氧 膽 鹽 （ XLD） 瓊 脂 。3.7 沙 門(mén) 氏 菌 屬 顯 色 培 養(yǎng) 基 。3.8 三 糖 鐵 （ TSI） 瓊 脂 。3.9 蛋 白 胨 水 、 靛 基 質(zhì) 試 劑 。3.10 尿 素 瓊 脂 （ pH 7.2） 。3.11 氰 化 鉀 （ KCN） 培 養(yǎng) 基 。3.12 賴 氨 酸 脫 羧 酶 試 驗(yàn) 培 養(yǎng) 基 。3.13 糖 發(fā) 酵 管 。3.14 鄰 硝 基 酚 -D半 乳 糖 苷 （ ONPG） 培 養(yǎng) 基 。 3.15 半 固 體 瓊 脂 。3.16 丙 二 酸 鈉 培 養(yǎng) 基 。3.17 沙 門(mén) 氏 菌 O和 H診 斷 血 清 。3.18 生 化

4、 鑒 定 試 劑 盒 。 A.1 緩 沖 蛋 白 胨 水 （ BPW） A.1.1成 分 蛋 白 胨 10.0 g氯 化 鈉 5.0 g磷 酸 氫 二 鈉 （ 含 12個(gè) 結(jié) 晶 水 ） 9.0 g磷 酸 二 氫 鉀 1.5 g蒸 餾 水 1 000 mLpH 7.2 0.2 A.1.2 制 法 將 各 成 分 加 入 蒸 餾 水 中 ， 攪 混 均 勻 ， 靜 置 約 10 min， 煮 沸 溶 解 ， 調(diào) 節(jié) pH， 高壓 滅 菌 121 ， 15 min。 A.2 四 硫 磺 酸 鈉 煌 綠 （ TTB） 增 菌 液 A.2.1基 礎(chǔ) 液 蛋 白 胨 10.0 g、 牛 肉 膏 5.0

5、g、 氯 化 鈉 3.0 g、 碳 酸 鈣 45.0 g、 蒸 餾 水 1 000 mL、 pH 7.0 0.2 除 碳 酸 鈣 外 ， 將 各 成 分 加 入 蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 ， 再 加 入 碳 酸 鈣 ， 調(diào) 節(jié) pH， 高 壓 滅菌 121 ， 20 min。A.2.2硫 代 硫 酸 鈉 溶 液 硫 代 硫 酸 鈉 （ 含 5個(gè) 結(jié) 晶 水 ） 50.0 g， 餾 水 加 至 100 mL， 高 壓 滅 菌 121 ， 20 min。A.2.3碘 溶 液 碘 片 20.0 g、 碘 化 鉀 25.0 g、 蒸 餾 水 加 至 100 mL， 將 碘 化 鉀 充 分 溶

6、 解 于 少 量 的 蒸餾 水 中 ， 再 投 入 碘 片 ， 振 搖 玻 瓶 至 碘 片 全 部 溶 解 為 止 ， 然 后 加 蒸 餾 水 至 規(guī) 定 的 總 量 ，貯 存 于 棕 色 瓶 內(nèi) ， 塞 緊 瓶 蓋 備 用 。A.2.4 0.5 煌 綠 水 溶 液煌 綠 0.5 g、 蒸 餾 水 100 mL溶 解 后 ， 存 放 暗 處 ， 不 少 于 1d， 使 其 自 然 滅 菌 。A.2.5牛 膽 鹽 溶 液 牛 膽 鹽 10.0 g， 蒸 餾 水 100 mL加 熱 煮 沸 至 完 全 溶 解 ， 高 壓 滅 菌 121 ， 20 min。A.2.6 制 法 基 礎(chǔ) 液 900 m

7、L、 硫 代 硫 酸 鈉 溶 液 100 mL、 碘 溶 液 20.0 mL、 煌 綠 水 溶 液 2.0 mL牛 膽 鹽 溶 液 50.0 mL臨 用 前 ， 按 上 列 順 序 ， 以 無(wú) 菌 操 作 依 次 加 入 基 礎(chǔ) 液 中 ， 每 加 入 一 種 成 分 ， 均 應(yīng) 搖 勻后 再 加 入 另 一 種 成 分 。 A.3 亞 硒 酸 鹽 胱 氨 酸 （ SC） 增 菌 液 A.3.1成 分蛋 白 胨 5.0 g乳 糖 4.0 g磷 酸 氫 二 鈉 10.0 g亞 硒 酸 氫 鈉 4.0 gL-胱 氨 酸 0.01 g蒸 餾 水 1 000 mLpH 7.0 0.2 A.3.2 制

8、法 除 亞 硒 酸 氫 鈉 和 L-胱 氨 酸 外 ， 將 各 成 分 加 入 蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 ， 冷 至 55 以 下 ，以 無(wú) 菌 操 作 加 入 亞 硒 酸 氫 鈉 和 1 g/L L-胱 氨 酸 溶 液 10 mL（ 稱 取 0.1 g L-胱 氨 酸 ， 加 1 mol/L氫 氧 化 鈉 溶 液 15 mL， 使 溶 解 ， 再 加 無(wú) 菌 蒸 餾 水 至 100 mL即 成 ， 如 為 DL-胱 氨 酸 ， 用 量 應(yīng) 加 倍 ） 。 搖 勻 ， 調(diào) 節(jié) pH。 A.4 亞 硫 酸 鉍 （ BS） 瓊 脂 A.4.1成 分 蛋 白 胨 10.0 g牛 肉 膏 5

9、.0 g葡 萄 糖 5.0 g硫 酸 亞 鐵 0.3 g磷 酸 氫 二 鈉 4.0 g煌 綠 0.025 g或 5.0g L水 溶 液 5.0mL檸 檬 酸 鉍 銨 2.0 g亞 硫 酸 鈉 6.0 g瓊 脂 18.0 g 20 g蒸 餾 水 1 000 mLpH 7.5 0.2 A.4.2 制 法 將 前 三 種 成 分 加 入 300 mL蒸 餾 水 （ 制 作 基 礎(chǔ) 液 ） ， 硫 酸 亞 鐵 和 磷 酸 氫 二 鈉 分 別加 入 20 mL和 30 mL蒸 餾 水 中 ， 檸 檬 酸 鉍 銨 和 亞 硫 酸 鈉 分 別 加 入 另 一 20 mL和 30 mL蒸 餾 水 中 ， 瓊

10、脂 加 入 600 mL蒸 餾 水 中 。 然 后 分 別 攪 拌 均 勻 ， 煮 沸 溶 解 。 冷 至80 左 右 時(shí) ， 先 將 硫 酸 亞 鐵 和 磷 酸 氫 二 鈉 混 勻 ， 倒 入 基 礎(chǔ) 液 中 ， 混 勻 。 將 檸 檬酸 鉍 銨 和 亞 硫 酸 鈉 混 勻 ， 倒 入 基 礎(chǔ) 液 中 ， 再 混 勻 。 調(diào) 節(jié) pH， 隨 即 傾 入 瓊 脂 液 中 ，混 合 均 勻 ， 冷 至 50 55 。 加 入 煌 綠 溶 液 ， 充 分 混 勻 后 立 即 傾 注 平 皿 。注 ： 本 培 養(yǎng) 基 不 需 要 高 壓 滅 菌 ，在 制 備 過(guò) 程 中 不 宜 過(guò) 分 加 熱 ，避

11、 免 降 低 其 選 擇 性 ， 貯 于 室 溫暗 處 ， 超 過(guò) 48 h會(huì) 降 低 其 選 擇性 ， 本 培 養(yǎng) 基 宜 于 當(dāng) 天 制 備 ，第 二 天 使 用 。 注 ： 本 培 養(yǎng) 基 不 需 要 高 壓 滅 菌 ， 在 制 備 過(guò) 程 中 不 宜 過(guò) 分 加 熱 ， 避 免降 低 其 選 擇 性 ， 貯 于 室 溫 暗 處 ， 超 過(guò) 48 h會(huì) 降 低 其 選 擇 性 ， 本 培 養(yǎng) 基宜 于 當(dāng) 天 制 備 ， 第 二 天 使 用 。A.5 HE 瓊 脂 （ Hektoen Enteric Agar）A.5.1成 分 蛋 白 胨 12.0 g 牛 肉 膏 3.0 g乳 糖 12

12、.0 g蔗 糖 12.0 g水 楊 素 2 .0 g 膽 鹽 20.0 g氯 化 鈉 5.0 g瓊 脂 18.0 g 20.0 g蒸 餾 水 1 000 mL 0.4 溴 麝 香 草 酚 藍(lán) 溶 液 16.0 mLAndrade指 示 劑 20.0 mL甲 液 20.0 mL乙 液 20.0 mLpH 7.5 0.2 A.5.2 制 法 將 前 面 七 種 成 分 溶 解 于 400 mL蒸 餾 水 內(nèi) 作 為 基 礎(chǔ) 液 ;將 瓊 脂 加 入 于 600 mL蒸 餾水 內(nèi) 。 然 后 分 別 攪 拌 均 勻 ， 煮 沸 溶 解 。 加 入 甲 液 和 乙 液 于 基 礎(chǔ) 液 內(nèi) ,調(diào) 節(jié) p

13、H。 再加 入 指 示 劑 ,并 與 瓊 脂 液 合 并 ,待 冷 至 50 55 傾 注 平 皿 。注 : 本 培 養(yǎng) 基 不 需 要 高 壓 滅 菌 ， 在 制 備 過(guò) 程 中 不 宜 過(guò) 分 加 熱 ， 避 免 降 低 其 選 擇性 。 甲 液 的 配 制硫 代 硫 酸 鈉 34.0 g檸 檬 酸 鐵 銨 4.0 g蒸 餾 水 100 mL 乙 液 的 配 制去 氧 膽 酸 鈉 10.0 g 蒸 餾 水 100 mL Andrade 指 示 劑 酸 性 復(fù) 紅 0.5 g 1mol/L氫 氧 化 鈉 溶 液 16.0 mL 蒸 餾 水 100 mL 將 復(fù) 紅 溶 解 于 蒸 餾 水 中

14、 ,加 入 氫 氧 化 鈉 溶 液 。數(shù) 小 時(shí) 后 如 復(fù) 紅 褪 色 不 全 ,再 加 氫 氧 化 鈉 溶 液 1 mL 2 mL。 6、 木 糖 賴 氨 酸 脫 氧 膽 鹽 （ XLD） 瓊 脂 A.6.1成 分 酵 母 膏 3.0 gL-賴 氨 酸 5.0 g木 糖 3.75 g乳 糖 7.5 g蔗 糖 7.5 g去 氧 膽 酸 鈉 2.5 g檸 檬 酸 鐵 銨 0.8 g硫 代 硫 酸 鈉 6.8 g氯 化 鈉 5.0 g瓊 脂 15.0 g酚 紅 0.08 g蒸 餾 水 1 000 mLpH 7.4 0.2 A.6.2制 法 除 酚 紅 和 瓊 脂 外 ， 將 其 他 成 分 加

15、入 400 mL蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 ， 調(diào) 節(jié) pH。 另 將瓊 脂 加 入 600 mL蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 。 將 上 述 兩 溶 液 混 合 均 勻 后 ， 再 加 入 指 示劑 ， 待 冷 至 50 55 傾 注 平 皿 。注 :本 培 養(yǎng) 基 不 需 要 高 壓 滅 菌 ， 在 制 備 過(guò) 程 中 不 宜 過(guò) 分 加 熱 ， 避 免 降 低 其 選 擇 性 ，貯 于 室 溫 暗 處 。 本 培 養(yǎng) 基 宜 于 當(dāng) 天 制 備 ， 第 二 天 使 用 。 A.7 三 糖 鐵 （ TSI） 瓊 脂 A.7.1成 分 蛋 白 胨 20.0 g牛 肉 膏 5.0

16、 g乳 糖 10.0 g蔗 糖 10.0 g葡 萄 糖 1.0 g硫 酸 亞 鐵 銨 （ 含 6個(gè) 結(jié) 晶 水 ） 0.2 g酚 紅 0.025 g或 5.0 g/L溶 液 5.0 mL氯 化 鈉 5.0 g硫 代 硫 酸 鈉 0.2 g瓊 脂 12.0 g蒸 餾 水 1 000 mL pH 7.4 0.2 A.7.2 制 法 除 酚 紅 和 瓊 脂 外 ， 將 其 他 成 分 加 入 400 mL蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 ， 調(diào) 節(jié) pH。 另將 瓊 脂 加 入 600 mL蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 。將 上 述 兩 溶 液 混 合 均 勻 后 ， 再 加 入 指 示 劑

17、 ， 混 勻 ， 分 裝 試 管 ， 每 管 約 2 mL 4 mL， 高 壓 滅 菌 121 10 min或 115 15 min， 滅 菌 后 置 成 高 層 斜 面 ， 呈 桔 紅色 。 A.8 蛋 白 胨 水 、 靛 基 質(zhì) 試 劑 A.8.1 蛋 白 胨 水 蛋 白 胨 （ 或 胰 蛋 白 胨 ） 20.0 g 氯 化 鈉 5.0 g 蒸 餾 水 1 000 mLpH 7.4 0.2 將 上 述 成 分 加 入 蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 ， 調(diào) 節(jié) pH， 分 裝 小 試 管 ,121 高 壓 滅菌 15 min。A.8.2 靛 基 質(zhì) 試 劑A.8.2.1 柯 凡 克 試

18、 劑 ： 將 5 g對(duì) 二 甲 氨 基 甲 醛 溶 解 于 75 mL戊 醇 中 ,然 后 緩 慢 加入 濃 鹽 酸 25 mL。A.8.2.2 歐 -波 試 劑 ： 將 1 g對(duì) 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 溶 解 于 95 mL95 乙 醇 內(nèi) 。 然后 緩 慢 加 入 濃 鹽 酸 20 mL。A.8.3 試 驗(yàn) 方 法挑 取 小 量 培 養(yǎng) 物 接 種 ,在 36 1 培 養(yǎng) 1 d 2 d， 必 要 時(shí) 可 培 養(yǎng) 4 d 5 d。 加 入 柯 凡 克 試 劑 約 0.5 mL， 輕 搖 試 管 ,陽(yáng) 性 者 于 試 劑 層 呈 深 紅 色 ； 或 加 入 歐 -波 試 劑 約 0.5

19、 mL， 沿 管 壁 流 下 ， 覆 蓋 于 培 養(yǎng) 液 表 面 ,陽(yáng) 性 者 于 液 面 接 觸 處 呈玫 瑰 紅 色 。注 ： 蛋 白 胨 中 應(yīng) 含 有 豐 富 的 色 氯 酸 。 每 批 蛋 白 胨 買(mǎi) 來(lái) 后 ， 應(yīng) 先 用 已 知 菌 種 鑒定 后 方 可 使 用 。 9 尿 素 瓊 脂 （ pH 7.2） A.9.1成 分 蛋 白 胨 1.0 g氯 化 鈉 5.0 g葡 萄 糖 1.0 g磷 酸 二 氫 鉀 2.0 g0.4 酚 紅 3.0 mL瓊 脂 20.0 g蒸 餾 水 1 000 mL20%尿 素 溶 液 100 mL pH7.2 0.2 A.9.2制 法 除 尿 素 、

20、 瓊 脂 和 酚 紅 外 ， 將 其 他 成 分 加 入 400 mL蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 ， 調(diào) 節(jié) pH。 另將 瓊 脂 加 入 600 mL蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 。將 上 述 兩 溶 液 混 合 均 勻 后 ， 再 加 入 指 示 劑 后 分 裝 ， 121 高 壓 滅 菌 15 min。 冷 至 50 55 ,加 入 經(jīng) 除 菌 過(guò) 濾 的 尿 素 溶 液 。 尿 素 的 最 終 濃 度 為 2 。 分 裝 于 無(wú) 菌 試 管 內(nèi) ， 放 成 斜 面 備 用 。A.9.3試 驗(yàn) 方 法 挑 取 瓊 脂 培 養(yǎng) 物 接 種 ,在 36 1 培 養(yǎng) 24 h，

21、觀 察 結(jié) 果 。 尿 素 酶 陽(yáng) 性 者 由 于 產(chǎn) 堿 而使 培 養(yǎng) 基 變 為 紅 色 。 .10 氰 化 鉀 （ KCN） 培 養(yǎng) 基 A.10.1成 分 蛋 白 胨 10.0 g氯 化 鈉 5.0 g磷 酸 二 氫 鉀 0.225 g磷 酸 氫 二 鈉 5.64 g蒸 餾 水 1 000 mL0.5 氰 化 鉀 20.0 mLA.10.2 制 法 將 除 氰 化 鉀 以 外 的 成 分 加 入 蒸 餾 水 中 ， 煮 沸 溶 解 ， 分 裝 后 121 高 壓 滅 菌 15 min。放 在 冰 箱 內(nèi) 使 其 充 分 冷 卻 。 每 100 mL培 養(yǎng) 基 加 入 0.5 氰 化 鉀

22、 溶 液 2.0 mL（ 最 后 濃 度為 1:10 000） ， 分 裝 于 無(wú) 菌 試 管 內(nèi) ,每 管 約 4 mL,立 刻 用 無(wú) 菌 橡 皮 塞 塞 緊 ,放 在 4 冰 箱內(nèi) ,至 少 可 保 存 兩 個(gè) 月 。 同 時(shí) ， 將 不 加 氰 化 鉀 的 培 養(yǎng) 基 作 為 對(duì) 照 培 養(yǎng) 基 ,分 裝 試 管 備 用 。A.10.3 試 驗(yàn) 方 法 將 瓊 脂 培 養(yǎng) 物 接 種 于 蛋 白 胨 水 內(nèi) 成 為 稀 釋 菌 液 ， 挑 取 1環(huán) 接 種 于 氰 化 鉀 （ KCN） 培 養(yǎng) 基 。 并 另 挑 取 1環(huán) 接 種 于 對(duì) 照 培 養(yǎng) 基 。 在 36 1 培 養(yǎng) 1

23、d 2 d， 觀 察 結(jié) 果 。 如 有細(xì) 菌 生 長(zhǎng) 即 為 陽(yáng) 性 （ 不 抑 制 ） ， 經(jīng) 2 d細(xì) 菌 不 生 長(zhǎng) 為 陰 性 （ 抑 制 ） 。注 :氰 化 鉀 是 劇 毒 藥 ,使 用 時(shí) 應(yīng) 小 心 ， 切 勿 沾 染 ， 以 免 中 毒 。 夏 天 分 裝 培 養(yǎng) 基 應(yīng) 在 冰 箱內(nèi) 進(jìn) 行 。 試 驗(yàn) 失 敗 的 主 要 原 因 是 封 口 不 嚴(yán) ,氰 化 鉀 逐 漸 分 解 ， 產(chǎn) 生 氫 氰 酸 氣 體 逸 出 ，以 致 藥 物 濃 度 降 低 ， 細(xì) 菌 生 長(zhǎng) ， 因 而 造 成 假 陽(yáng) 性 反 應(yīng) 。 試 驗(yàn) 時(shí) 對(duì) 每 一 環(huán) 節(jié) 都 要 特 別注 意 。

24、A.11 賴 氨 酸 脫 羧 酶 試 驗(yàn) 培 養(yǎng) 基 A.11.1成 分 蛋 白 胨 5.0 g酵 母 浸 膏 3.0 g葡 萄 糖 1.0 g蒸 餾 水 1 000 mL 1.6 溴 甲 酚 紫 -乙 醇 溶 液 1.0 mLL-賴 氨 酸 或 DL-賴 氨 酸 0.5 g/100 mL或 1.0 g/100 mLpH 6.8 0.2 A.11.2制 法 除 賴 氨 酸 以 外 的 成 分 加 熱 溶 解 后 ,分 裝 每 瓶 100 mL， 分 別 加 入 賴 氨 酸 。 L-賴 氨 酸 按 0.5 加 入 ， DL-賴 氨 酸 按 1 加 入 。 調(diào) 節(jié) pH。 對(duì) 照 培 養(yǎng) 基 不

25、加 賴 氨 酸 。 分 裝 于 無(wú) 菌 的 小 試 管 內(nèi) ， 每 管 0.5 mL， 上 面 滴 加 一 層 液 體 石 蠟 ， 115 高 壓 滅 菌 10 min。A.11.3試 驗(yàn) 方 法 從 瓊 脂 斜 面 上 挑 取 培 養(yǎng) 物 接 種 ， 于 36 1 培 養(yǎng) 18 h 24 h， 觀 察 結(jié) 果 。 氨 基 酸 脫羧 酶 陽(yáng) 性 者 由 于 產(chǎn) 堿 ， 培 養(yǎng) 基 應(yīng) 呈 紫 色 。 陰 性 者 無(wú) 堿 性 產(chǎn) 物 ， 但 因 葡 萄 糖 產(chǎn) 酸 而 使 培養(yǎng) 基 變 為 黃 色 。 對(duì) 照 管 應(yīng) 為 黃 色 。 A.12 糖 發(fā) 酵 管 A.12.1成 分 牛 肉 膏 5.

26、0 g蛋 白 胨 10.0 g氯 化 鈉 3.0 g磷 酸 氫 二 鈉 （ 含 12個(gè) 結(jié) 晶 水 ） 2.0 g0.2 溴 麝 香 草 酚 藍(lán) 溶 液 12.0 mL蒸 餾 水 1 000 mLpH 7.4 0.2 A.12.2 制 法 A.12.2.1葡 萄 糖 發(fā) 酵 管 按 上 述 成 分 配 好 后 ， 調(diào) 節(jié) pH。 按 0.5 加 入 葡 萄 糖 ， 分 裝 于 有一 個(gè) 倒 置 小 管 的 小 試 管 內(nèi) ， 121 高 壓 滅 菌 15 min。A.12.2.2 其 他 各 種 糖 發(fā) 酵 管 可 按 上 述 成 分 配 好 后 ,分 裝 每 瓶 100 mL， 121 高

27、壓 滅 菌 15 min。 另 將 各 種 糖 類 分 別 配 好 10 溶 液 ， 同 時(shí) 高 壓 滅 菌 。 將 5 mL糖 溶 液 加 入 于 100 mL培 養(yǎng) 基 內(nèi) ， 以 無(wú) 菌 操 作 分 裝 小 試 管 。注 ： 蔗 糖 不 純 ,加 熱 后 會(huì) 自 行 水 解 者 ， 應(yīng) 采 用 過(guò) 濾 法 除 菌 。A.12.3 試 驗(yàn) 方 法 :從 瓊 脂 斜 面 上 挑 取 小 量 培 養(yǎng) 物 接 種 ， 于 36 1 培 養(yǎng) ,一 般 2 d3 d。 遲 緩 反 應(yīng) 需 觀 察 14 d 30 d。 A.13 ONPG 培 養(yǎng) 基 A.13.1 成 分 鄰 硝 基 酚 -D半 乳

28、糖 苷 （ ONPG）（ O-Nitrophenyl-D-galactopyranoside）60.0 mg0.01mol/L磷 酸 鈉 緩 沖 液 （ pH7.5） 10.0 mL 1 蛋 白 胨 水 （ pH7.5） 30.0 mL A.13.2制 法 將 ONPG溶 于 緩 沖 液 內(nèi) ， 加 入 蛋 白 胨 水 ， 以 過(guò) 濾 法 除 菌 ， 分 裝 于 無(wú) 菌 的 小 試 管 內(nèi) ， 每 管0.5 mL， 用 橡 皮 塞 塞 緊 。A.13.3試 驗(yàn) 方 法 自 瓊 脂 斜 面 上 挑 取 培 養(yǎng) 物 1滿 環(huán) 接 種 于 36 1 培 養(yǎng) 1 h 3 h和 24 h觀 察 結(jié) 果

29、。 如 果 - 半 乳 糖 苷 酶 產(chǎn) 生 ， 則 于 1 h 3 h變 黃 色 ， 如 無(wú) 此 酶 則 24 h不 變 色 。 A.14 半 固 體 瓊 脂 A.14.1成 分 牛 肉 膏 0.3 g蛋 白 胨 1.0 g氯 化 鈉 0.5 g瓊 脂 0.35g 0.4 g蒸 餾 水 100 mLpH 7.4 0.2 A.14.2 制 法 按 以 上 成 分 配 好 ,煮 沸 溶 解 ,調(diào) 節(jié) pH。 分 裝 小 試 管 。 121 高 壓 滅 菌 15 min。 直 立 凝 固備 用 。 注 :供 動(dòng) 力 觀 察 、 菌 種 保 存 、 H抗 原 位 相 變 異 試 驗(yàn) 等 用 。 A.1

30、5 丙 二 酸 鈉 培 養(yǎng) 基 A.15.1成 分 酵 母 浸 膏 1.0 g 硫 酸 銨 2.0 g 磷 酸 氫 二 鉀 0.6 g 磷 酸 二 氫 鉀 0.4 g 氯 化 鈉 2.0 g 丙 二 酸 鈉 3.0 g 0.2 溴 麝 香 草 酚 藍(lán) 溶 液 12.0 mL 蒸 餾 水 1 000 mL pH 6.8 0.2 A.15.2制 法 除 指 示 劑 以 外 的 成 分 溶 解 于 水 ， 調(diào) 節(jié) pH， 再 加 入 指 示 劑 ， 分 裝 試 管 ， 121 高壓 滅 菌 15 min。A.15.3試 驗(yàn) 方 法 用 新 鮮 的 瓊 脂 培 養(yǎng) 物 接 種 ， 于 36 1 培 養(yǎng)

31、 48 h， 觀 察 結(jié) 果 。 陽(yáng) 性 者 由 綠 色 變 為 藍(lán) 色 。 4 檢 驗(yàn) 程 序 5 操 作 步 驟 5.1 前 增 菌 稱 取 25 g（ mL） 樣 品 放 入 盛 有 225 mL BPW的 無(wú) 菌 均 質(zhì) 杯 中 ， 以 8 000 r/min 10 000 r/min均 質(zhì) 1 min 2 min， 或 置 于 盛 有 225 mL BPW的 無(wú) 菌均 質(zhì) 袋 中 ， 用 拍 擊 式 均 質(zhì) 器 拍 打 1 min 2 min。 若 樣 品 為 液 態(tài) ， 不 需 要均 質(zhì) ， 振 蕩 混 勻 。 如 需 測(cè) 定 pH值 ， 用 1 mol/mL無(wú) 菌 NaOH或 H

32、Cl調(diào) pH 至6.8 0.2。無(wú) 菌 操 作 將 樣 品 轉(zhuǎn) 至 500 mL錐 形 瓶 中 ， 如 使 用 均 質(zhì) 袋 ， 可 直 接 進(jìn) 行 培 養(yǎng) ，于 36 1 培 養(yǎng) 8 h 18h。如 為 冷 凍 產(chǎn) 品 ,應(yīng) 在 45 以 下 不 超 過(guò) 15 min,或 2 5 不 超 過(guò) 18 h解 凍5.2 增 菌 輕 輕 搖 動(dòng) 培 養(yǎng) 過(guò) 的 樣 品 混 合 物 ， 移 取 1 mL， 轉(zhuǎn) 種 于 10 mL TTB 內(nèi) ， 于42 1 培 養(yǎng) 18 h 24 h。 同 時(shí) ， 另 取 1 mL， 轉(zhuǎn) 種 于 10 mL SC內(nèi) ， 于36 1 培 養(yǎng) 18 h 24 h。 5.3

33、分 離 5.5 血 清 學(xué) 鑒 定 5.5.1 抗 原 的 準(zhǔn) 備 一 般 采 用 1.2 1.5 瓊 脂 培 養(yǎng) 物 作 為 玻 片 凝 集 試 驗(yàn) 用 的 抗 原 。O血 清 不 凝 集 時(shí) ， 將 菌 株 接 種 在 瓊 脂 量 較 高 的 （ 如 2 3 ） 培 養(yǎng) 基 上 再 檢 查 ；如 果 是 由 于 Vi抗 原 的 存 在 而 阻 止 了 O凝 集 反 應(yīng) 時(shí) ， 可 挑 取 菌 苔 于 1 mL生 理 鹽 水 中做 成 濃 菌 液 ， 于 酒 精 燈 火 焰 上 煮 沸 后 再 檢 查 。 H抗 原 發(fā) 育 不 良 時(shí) ， 將 菌 株 接 種 在0.55 0.65 半 固 體

34、 瓊 脂 平 板 的 中 央 ， 俟 菌 落 蔓 延 生 長(zhǎng) 時(shí) ， 在 其 邊 緣 部 分 取 菌檢 查 ； 或 將 菌 株 通 過(guò) 裝 有 0.3 0.4 半 固 體 瓊 脂 的 小 玻 管 1次 2次 ， 自 遠(yuǎn) 端 取菌 培 養(yǎng) 后 再 檢 查 。5.5.2 多 價(jià) 菌 體 抗 原 （ O） 鑒 定 在 玻 片 上 劃 出 2個(gè) 約 1 cm 2 cm的 區(qū) 域 ， 挑 取 1環(huán) 待 測(cè) 菌 ， 各 放 1/2環(huán) 于 玻 片 上 的每 一 區(qū) 域 上 部 ， 在 其 中 一 個(gè) 區(qū) 域 下 部 加 1滴 多 價(jià) 菌 體 （ O） 抗 血 清 ， 在 另 一 區(qū) 域 下 部 加 入 1滴

35、 生 理 鹽 水 ， 作 為 對(duì) 照 。 再 用 無(wú) 菌 的 接 種 環(huán) 或 針 分 別 將 兩 個(gè) 區(qū) 域 內(nèi) 的菌 落 研 成 乳 狀 液 。 將 玻 片 傾 斜 搖 動(dòng) 混 合 1 min， 并 對(duì) 著 黑 暗 背 景 進(jìn) 行 觀 察 ， 任 何程 度 的 凝 集 現(xiàn) 象 皆 為 陽(yáng) 性 反 應(yīng) 。5.5.3 多 價(jià) 鞭 毛 抗 原 （ H） 鑒 定 同 5.5.2。 5.5.4 血 清 學(xué) 分 型 （ 選 做 項(xiàng) 目 ） 5.5.4.1 O 抗 原 的 鑒 定 用 A F多 價(jià) O血 清 做 玻 片 凝 集 試 驗(yàn) ， 同 時(shí) 用 生 理 鹽 水 做 對(duì) 照 。 在 生 理 鹽 水 中

36、 自 凝 者為 粗 糙 形 菌 株 ， 不 能 分 型 。被 A F多 價(jià) O血 清 凝 集 者 ， 依 次 用 O4； O3、 O10； O7； O8； O9； O2和 O11因 子血 清 做 凝 集 試 驗(yàn) 。 根 據(jù) 試 驗(yàn) 結(jié) 果 ， 判 定 O群 。 被 O3、 O10血 清 凝 集 的 菌 株 ， 再 用O10、 O15、 O34、 O19單 因 子 血 清 做 凝 集 試 驗(yàn) ， 判 定 E1、 E2、 E3、 E4各 亞 群 ，每 一 個(gè) O抗 原 成 分 的 最 后 確 定 均 應(yīng) 根 據(jù) O單 因 子 血 清 的 檢 查 結(jié) 果 ， 沒(méi) 有 O單 因 子 血清 的 要 用

37、兩 個(gè) O復(fù) 合 因 子 血 清 進(jìn) 行 核 對(duì) 。不 被 A F多 價(jià) O血 清 凝 集 者 ， 先 用 9種 多 價(jià) O血 清 檢 查 ， 如 有 其 中 一 種 血 清 凝 集 ，則 用 這 種 血 清 所 包 括 的 O群 血 清 逐 一 檢 查 ， 以 確 定 O群 。 每 種 多 價(jià) O血 清 所 包 括 的 O因 子 如 下 ：O多 價(jià) 1 A， B， C， D， E， F， 群 （ 并 包 括 6,14群 ）O多 價(jià) 2 13， 16， 17， 18， 21群 O多 價(jià) 3 28， 30， 35， 38， 39群O多 價(jià) 4 40， 41， 42， 43群O多 價(jià) 5 44，

38、45， 47， 48群O多 價(jià) 6 50， 51， 52， 53群O多 價(jià) 7 55， 56， 57， 58群O多 價(jià) 8 59， 60， 61， 62群O多 價(jià) 9 63， 65， 66， 67群 不 常 見(jiàn) 的 菌 型 ， 先 用 8種 多 價(jià) H血 清 檢 查 ， 如 有 其 中 一 種 或 兩 種 血 清 凝 集 ， 則 再 用 這一 種 或 兩 種 血 清 所 包 括 的 各 種 H因 子 血 清 逐 一 檢 查 ， 以 第 1相 和 第 2項(xiàng) 的 H抗 原 。 8種多 價(jià) H血 清 所 包 括 的 H因 子 如 下 ：H多 價(jià) 1 a， b， c， d， i H多 價(jià) 2 eh，

39、enx， enz15， fg， gms， gpu， gp， gq， mt， gz51H多 價(jià) 3 k， r， y， z， z10， lv， lw， lz13， lz28， lz40H多 價(jià) 4 1,2； 1,5； 1,6； 1,7； z6H多 價(jià) 5 z4z23， z4z24， z4z32， z29， z35， z36， z38H多 價(jià) 6 z39， z41， z42， z44H多 價(jià) 7 z52， z53， z54， z55H多 價(jià) 8 z56， z57， z60， z61， z62每 一 個(gè) H抗 原 成 分 的 最 后 確 定 均 應(yīng) 根 據(jù) H單 因 子 血 清 的 檢 查 結(jié) 果 ，

40、 沒(méi) 有 H單 因 子 血 清 的 要 用 兩 個(gè) H復(fù) 合 因 子 血 清 進(jìn) 行 核 對(duì) 。 檢 出 第 1相 H抗 原 而 未 檢 出 第 2相 H抗 原 的 或 檢出 第 2相 H抗 原 而 未 檢 出 第 1相 H抗 原 的 ,可 在 瓊 脂 斜 面 上 移 種 1 2代 后 再 檢 查 。 如 仍只 檢 出 一 個(gè) 相 的 H抗 原 ， 要 用 位 相 變 異 的 方 法 檢 查 其 另 一 個(gè) 相 。 單 相 菌 不 必 做 位 相 變異 檢 查 。 位 相 變 異 試 驗(yàn) 方 法 如 下 ：小 玻 管 法 ： 將 半 固 體 管 （ 每 管 約 1 mL 2 mL） 在 酒 精

41、 燈 上 溶 化 并 冷 至 50 ， 取已 知 相 的 H因 子 血 清 0.05 mL 0.1 mL， 加 入 于 溶 化 的 半 固 體 內(nèi) ， 混 勻 后 ， 用 毛 細(xì)吸 管 吸 取 分 裝 于 供 位 相 變 異 試 驗(yàn) 的 小 玻 管 內(nèi) ， 俟 凝 固 后 ， 用 接 種 針 挑 取 待 檢 菌 ， 接種 于 一 端 。 將 小 玻 管 平 放 在 平 皿 內(nèi) ， 并 在 其 旁 放 一 團(tuán) 濕 棉 花 ， 以 防 瓊 脂 中 水 分 蒸 發(fā)而 干 縮 ， 每 天 檢 查 結(jié) 果 ， 待 另 一 相 細(xì) 菌 解 離 后 ， 可 以 從 另 一 端 挑 取 細(xì) 菌 進(jìn) 行 檢 查

42、 。培 養(yǎng) 基 內(nèi) 血 清 的 濃 度 應(yīng) 有 適 當(dāng) 的 比 例 ， 過(guò) 高 時(shí) 細(xì) 菌 不 能 生 長(zhǎng) ， 過(guò) 低 時(shí) 同 一 相 細(xì) 菌 的動(dòng) 力 不 能 抑 制 。 一 般 按 原 血 清 1： 200 1： 800的 量 加 入 。 小 倒 管 法 ： 將 兩 端 開(kāi) 口的 小 玻 管 （ 下 端 開(kāi) 口 要 留 一 個(gè) 缺 口 ， 不 要 平 齊 ） 放 在 半 固 體 管 內(nèi) ,小 玻 管 的 上 端應(yīng) 高 出 于 培 養(yǎng) 基 的 表 面 ， 滅 菌 后 備 用 。 臨 用 時(shí) 在 酒 精 燈 上 加 熱 溶 化 ， 冷 至 50 ，挑 取 因 子 血 清 1環(huán) ， 加 入 小

43、套 管 中 的 半 固 體 內(nèi) ， 略 加 攪 動(dòng) ， 使 其 混 勻 ， 俟 凝 固 后 ，將 待 檢 菌 株 接 種 于 小 套 管 中 的 半 固 體 表 層 內(nèi) ， 每 天 檢 查 結(jié) 果 ， 待 另 一 相 細(xì) 菌 解 離 后 ，可 從 套 管 外 的 半 固 體 表 面 取 菌 檢 查 ， 或 轉(zhuǎn) 種 1 軟 瓊 脂 斜 面 ， 于 37 培 養(yǎng) 后 再 做 凝集 試 驗(yàn) 。 簡(jiǎn) 易 平 板 法 ： 將 0.35 0.4 半 固 體 瓊 脂 平 板 烘 干 表 面 水 分 ， 挑 取 因 子 血 清 1環(huán) ， 滴 在 半 固 體 平 板 表 面 ， 放 置 片 刻 ， 待 血 清

44、吸 收 到 瓊 脂 內(nèi) ， 在 血 清 部 位 的中 央 點(diǎn) 種 待 檢 菌 株 ， 培 養(yǎng) 后 ， 在 形 成 蔓 延 生 長(zhǎng) 的 菌 苔 邊 緣 取 菌 檢 查 。 5.5.4.3 Vi 抗 原 的 鑒 定 用 Vi因 子 血 清 檢 查 。 已 知 具 有 Vi抗 原 的 菌 型 有 ： 傷 寒 沙 門(mén) 氏 菌 ， 丙 型 副 傷 寒 沙門(mén) 氏 菌 ,都 柏 林沙 門(mén) 氏 菌 。5.5.4.4 菌 型 的 判 定 根 據(jù) 血 清 學(xué) 分 型 鑒 定 的 結(jié) 果 ， 按 照 附 錄 B或 有 關(guān) 沙 門(mén) 氏 菌 屬 抗 原 表 判 定 菌 型 。6 結(jié) 果 與 報(bào) 告 綜 合 以 上 生 化 試 驗(yàn) 和 血 清 學(xué) 鑒 定 的 結(jié) 果 ， 報(bào) 告 25 g（ mL） 樣 品 中 檢 出 或 未 檢 出沙 門(mén) 氏 菌 。 提問(wèn) 答疑Question and answerQuestion and answer 謝 謝 大 家 ！作 者 ： 楊 淑 霞微 博 ： 霞 日 里 的 陽(yáng) 光THANKS