沙門氏菌的檢驗(yàn)

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1、沙 門 氏 菌 檢 驗(yàn) 全 國(guó) 食 品 衛(wèi) 生 標(biāo) 準(zhǔn) 委 員 會(huì) 微 生 物 標(biāo) 準(zhǔn) 協(xié) 作 組 2 0 0 8 年 1 1 月 1 4 日 -1 8 日 食 品 衛(wèi) 生 微 生 物 學(xué) 檢 驗(yàn) （ GB/T4 7 8 9 .4 ） 主 要 內(nèi) 容修 訂 背 景國(guó) 內(nèi) 外 方 法修 訂 內(nèi) 容 前 增 菌 選 擇 性 增 菌 分 離 平 板生 化 鑒 定 血 清 學(xué) 鑒 定報(bào) 告 修 訂 背 景 歷 史 回 顧 回 顧 一 下 食 品 衛(wèi) 生 微 生 物 學(xué) 檢 驗(yàn) 標(biāo) 準(zhǔn) 的 制 定 ，經(jīng) 歷 了 從 無 到 有 ， 從 事 該 領(lǐng) 域 的 工 作 者 ， 花 費(fèi) 了 巨大 的 心 血 ，

2、 先 后 制 修 訂 了 8 4 版 、 9 4 版 、 和 2 0 0 3 版 的檢 驗(yàn) 標(biāo) 準(zhǔn) ， 每 版 的 標(biāo) 準(zhǔn) ， 都 為 該 年 代 的 食 品 衛(wèi) 生 工作 提 供 了 巨 大 的 技 術(shù) 支 持 ， 同 時(shí) 也 深 深 地 烙 上 了 該時(shí) 代 的 經(jīng) 濟(jì) 特 征 。 必 要 性 由 于 食 品 生 產(chǎn) 及 流 通 的 全 球 化 、 新 的 食 品 加 工技 術(shù) 的 應(yīng) 用 、 東 西 方 飲 食 習(xí) 慣 的 交 融 、 自 然 環(huán)境 的 改 變 等 因 素 的 影 響 ， 目 前 沙 門 氏 菌 污 染 的食 物 種 類 、 季 節(jié) 及 場(chǎng) 所 發(fā) 生 了 重 大 變 化

3、 。 同 時(shí) ，隨 著 檢 測(cè) 技 術(shù) 的 發(fā) 展 ， 對(duì) 于 沙 門 菌 的 快 速 檢 測(cè)方 法 層 出 不 窮 ， 有 些 方 法 已 通 過 國(guó) 際 權(quán) 威 機(jī) 構(gòu)認(rèn) 證 （ 如 AOAC） 成 為 了 國(guó) 際 標(biāo) 準(zhǔn) 方 法 。 任 務(wù) 來 源1 . 修 訂 任 務(wù) 由 衛(wèi) 生 部 全 國(guó) 食 品 衛(wèi) 生 標(biāo) 準(zhǔn) 委 員 會(huì)下 達(dá) ， 由 微 生 物 標(biāo) 準(zhǔn) 協(xié) 作 組 具 體 實(shí) 施 。2 . 兄 弟 單 位 、 企 業(yè) 、 公 司 為 參 與 單 位 。 3 . 共 采 集 到 數(shù) 據(jù) 8 0 0 多 個(gè) ， 專 家 反 饋 意 見 5 0 余 條（ 采 納 9 0 %以 上 ）

4、 條 ， 形 成 標(biāo) 準(zhǔn) 的 草 案 稿 、送 審 稿 。4 . 時(shí) 間 跨 度 2 0 0 4 年 2 0 0 6 年 修 定 原 則 結(jié) 合 目 前 的 國(guó) 際 標(biāo) 準(zhǔn) 和 原 標(biāo) 準(zhǔn) 的 實(shí) 際 使 用 情 況 ， 針 對(duì) 原 標(biāo)準(zhǔn) 的 修 訂 ， 我 們 遵 循 以 下 的 修 訂 原 則 ：1 以 原 國(guó) 標(biāo) 為 基 礎(chǔ) ， 保 持 與 原 標(biāo) 準(zhǔn) 的 連 續(xù) 性 ；2 參 照 國(guó) 際 分 析 協(xié) 會(huì) （ AOAC） 、 國(guó) 際 標(biāo) 準(zhǔn) 組 織 （ ISO） 及 美 國(guó)食 品 藥 品 管 理 局 （ FDA） 的 有 關(guān) 標(biāo) 準(zhǔn) ；3 結(jié) 合 標(biāo) 準(zhǔn) 的 比 對(duì) 實(shí) 驗(yàn) 和 驗(yàn) 證

5、實(shí) 驗(yàn) ， 積 極 吸 取 新 方 法 、 新 技 術(shù) ，修 訂 標(biāo) 準(zhǔn) 。 修 定 依 據(jù)1. GB/T4789.42. AOAC Official Method ： 967.26， 967.27，967.283. ISO ： 65794 . USFDA ： Bacteriological Analytical Manual, Chapter 5: Salmonella。 修 改 內(nèi) 容1 前 增 菌 ；2 選 擇 性 增 菌 ；3 分 離 ；4 生 化 鑒 定 ；5 . 血 清 學(xué) 鑒 定 ；6 .報(bào) 告 。 國(guó) 內(nèi) 外 方 法 比 較 國(guó) 內(nèi) 外 沙 門 氏 菌 檢 測(cè) 方 法 （ 傳

6、統(tǒng) 方 法 ）國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)USFDAFSISAOAC ISO 凍 肉 、 蛋 品 、 乳 品 及 其 他 加 工 食 品 鮮 肉 、 鮮 蛋 、 鮮 乳 或 其 他 未 經(jīng) 加 工 的 食 品前 增 菌 法25g BPW225mL36 1 一 般 4h， 干 蛋 品 18h 24h10mL MM（ 或 TTB） 100mL 10mL SC100mL 直 接 增 菌 法25g 滅 菌 生 理 鹽 水 25mL檢 樣 勻 液 25mL MM（ 或 TTB） 100mL 檢 樣 勻 液 25mL SC100mL BS DHL（ 或 HE、 WS、 SS）TSI（ 排 除 A/A H2S 結(jié) 果 ）

7、 ， 靛 基 質(zhì) ， 尿 素 ， KCN， 賴 氨 酸 沙 門 氏 菌 血 清 學(xué) 試 驗(yàn) 甘 露 醇 山 梨 醇H2S 靛 尿 KCN 賴 H2S 靛 尿 KCN 賴 / 非 如 左 述 的 各 種 反 應(yīng) 結(jié) 果沙 門 氏 菌 血 清 學(xué) 試 驗(yàn) ONPG 沙 門 氏 菌 非 沙 門 氏 菌 42 18h 24h 36 1 18h 24h 42 18h 24h 36 1 18h 24h36 1 40h 48h 36 1 18h 24h 中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) GB/T 4789.4-2003 樣 品 （ 20類 ） 25g225mL 乳 糖 肉 湯 （ LB） or 胰

8、 酪 胨 大 豆 肉 湯 （ TSB） or 煌 綠 溶 液 （ BG ） or通 用 前 增 菌 肉 湯 （ UPB） or營(yíng) 養(yǎng) 肉 湯 （ NB） or 再 造 脫 脂 奶 粉 or 四 硫 酸 鹽 煌 綠 （ TT）pH6.8 0.2 24 2 h 35RVTT 43 0.2 or 35 2.0 24 2h 24 2h 42 0.2 BS & XLD & H E 24 2h 35TSI & LIA 非 沙 門 菌 沙 門 菌 非 沙 門 菌LIA+ LIA TSI K/A LIA TSI A/A尿 素 酶 ， H 抗 原 （ 多 價(jià) H 抗 血 清 或 Spicer-Edwards f

9、lagellar (H ) test ） ， 賴 氨 酸 脫 羧 酶 ，酚 紅 衛(wèi) 矛 醇 肉 湯 ， 色 氨 酸 肉 湯 （ KCN，丙 二 酸 鹽 ， 吲 哚 ） ， O抗 原酚 紅 乳 糖 肉 湯 ， 酚 紅 蔗 糖 肉 湯 ， MR VP,西 蒙 氏 檸 檬 酸 鹽 （ API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II,MICRO-ID, or Vitek GNI）+O抗 原 & H抗 原 細(xì) 菌 學(xué) 分 析 手 冊(cè) （ FDA/BAM） USDA/FSIS MLG 4.02 樣 品BPW or BPW（ 含 結(jié) 晶 紫 ）35 1 20-24

10、h BG S & DMLIA or XLT442 0.5 2224h0.5 0.05mL 10mL TT 0.1 0.02mL 10mL mRV42 0.5 2224h35 1 1824h & 48hTSI & LIA血 清 學(xué) 試 驗(yàn)商 業(yè) 生 化 試 劑 盒 或 自 動(dòng) 鑒 定 系 統(tǒng) or傳 統(tǒng) 生 化 鑒 定 報(bào) 告 結(jié) 果 AOAC沙 門 菌 檢 測(cè) 方 法AOAC Official Method 9 6 7 .2 5Salmonella in FoodsPreparation of Culture Media and ReagentsAOAC Official Method 9 6

11、 7 .2 6Salmonella in Processed FoodsDetectionAOAC Official Method 9 6 7 .2 7Salmonella in FoodsIdentificationAOAC Official Method 9 6 7 .2 8Salmonella in FoodsSerological Tests 食 品 中 的 沙 門 菌 檢 測(cè) 方 法AOAC 967.25 967.28 處 理 樣 品 沙 門 菌 1mL+10mLSC 1mL+10mLTT35 24 2hXLD & HE & BS35 24 2h（ BS 24h&48h）35 24

12、2hTSI & LIA35 24 2h純 培 養(yǎng) 物 不 純 培 養(yǎng) 物純 培 養(yǎng) 物MAC or XLD or HE尿 素 酶 尿 素 酶 非 沙 門 菌 H抗 原 ， LIA， 酚 紅 衛(wèi) 矛 醇 肉 湯 ， 色 氨 酸 肉 湯 （ KCN， 丙 二 酸 鹽 ， 吲 哚 ） ， O抗 原 非沙門菌補(bǔ) 充 生 化 試 驗(yàn)酚 紅 乳 糖 肉 湯 ， 酚 紅 蔗 糖 肉 湯 ， MR VP,西 蒙 氏 檸 檬 酸 鹽 非沙門菌 25g樣 品225mL BPW35 or 37 1620 h0.1mL+10mL RV 10mL+100mL SC42 24h 35 or 37 24h,48h酚 紅 煌

13、 綠 瓊 脂 （ 亮 綠 瓊 脂 ） & 第 二 種 選 擇 性 平 板35 or 37 2024h 無 典 型 菌 落 再 培 養(yǎng) 18 24h典 型 菌 落 （ pink red） 營(yíng) 養(yǎng) 瓊 脂 純 化 可 疑 菌 落 35 or 37 1824hTSI， 尿 素 酶 ， 賴 氨 酸 脫 羧 酶 ， ONPG ， VP， 吲 哚血 清 學(xué) 試 驗(yàn)（ O抗 原 ， Vi抗 原 ， H 抗 原 ）報(bào) 告 結(jié) 果送 參 考 實(shí) 驗(yàn) 室 分 型 ISO 6579:1993(E) 微 生 物 沙 門 菌 檢 測(cè) 的 通 用 方 法 修 訂 內(nèi) 容 沙 門 氏 菌 檢 驗(yàn) 1 前 增 菌2 選 擇

14、性 增 菌3 分 離4 鑒 定5 報(bào) 告 檢 樣3 6 1 ， 8 h 1 8 h TSI， 賴 氨 酸 ， NA， 靛 基 質(zhì) ， 尿 素 (pH 7 .2 )， KCN挑 取 可 疑 菌 落BS XLD（ 或 HE、 科 瑪 嘉 顯 色 培 養(yǎng) 基 ）1 mL+TTB 1 0 mL 1 mL+SC1 0 mL2 5 g（ mL） 樣 品 +2 2 5 mLBPWH2 S+靛 基 質(zhì) - 尿 素 -KCN- 賴 氨 酸 + H2 S+靛 基 質(zhì) + 尿素 - KCN-賴 氨 酸 + H2 S-靛 基 質(zhì) -尿 素-KCN- 賴 氨 酸 +/- 反 應(yīng) 結(jié) 果 與 左側(cè) 描 述 不 符商 品

15、化 生 化鑒 定 系 統(tǒng)4 2 1 ， 1 8 h 2 4 h 3 6 1 ， 1 8 h 2 4 h3 6 1 ， 4 0 h 4 8 h 3 6 1 ， 1 8 h 2 4 h甘 露 醇 +、 山 梨 醇 + ONPG-報(bào) 告 非 沙 門 氏 菌沙 門 氏 菌 ， 血 清 學(xué) 試 驗(yàn) 沙 門 氏 菌 檢 驗(yàn) 程 序 前 增 菌1 取 消 樣 品 分 類 ， 前 增 菌 液 統(tǒng) 一 為 “ 緩 沖 蛋 白 胨水 ” 原 國(guó) 標(biāo) ： BPW FDA、 AOAC： 多 種 前 增 菌 液 ISO： BPW 前 增 菌 （ 續(xù) ） 2 對(duì) 所 有 樣 品 均 進(jìn) 行 8 -1 8 h前 增 菌 原

16、 國(guó) 標(biāo) 只 對(duì) 凍 肉 、 乳 品 、 蛋 品 等 加 工 食 品 進(jìn)行 前 增 菌 ， FDA、 AOAC、 ISO、 Canada MFHPB、CCFRA等 組 織 或 國(guó) 家 對(duì) 所 有 樣 品 都 進(jìn) 行 前 增 菌 。 前 增 菌 （ 續(xù) ）3 修 改 了 樣 品 處 理 方 式 增 加 拍 擊 式 均 質(zhì) 器 ， 均 質(zhì) 袋 可 直 接 培 養(yǎng) 。4 增 加 調(diào) 整 pH值 選 擇 性 增 菌1 使 用 “ TTB、 SC”， 取 消 “ MM” 原 國(guó) 標(biāo) ： “ MM或 TTB、 SC AOAC： TT、 SC FDA： RV、 TT ISO： RV、 SC 選 擇 性 增

17、菌 的 目 的 是 最 大 可 能 的 檢 出 沙 門 氏 菌 ， 原 則 上 必 須 使用 兩 種 選 擇 性 分 離 增 菌 液 ， 一 種 是 抑 制 除 沙 門 氏 菌 以 外 其 腸 道菌 的 生 長(zhǎng) ， 一 種 是 在 不 影 響 其 他 腸 道 菌 生 長(zhǎng) 的 情 況 下 促 進(jìn) 沙 門氏 菌 的 生 長(zhǎng) 。 分 離 培 養(yǎng) 基使 用 BS、 XLD、 HE、 科 瑪 嘉 顯 色 培 養(yǎng) 基 原 國(guó) 標(biāo) ： BS、 DHL（ 或 HE、 WS、 SS） FDA： BS、 XLD、 HE AOAC： BS、 XLD、 HE ISO： phenol red brilliant gre

18、en瓊 脂 、 BS或 HE 為 了 最 大 可 能 的 檢 出 沙 門 氏 菌 ， 原 則 上 必須 使 用 兩 種 以 上 選 擇 性 分 離 培 養(yǎng) 基 。 分 離 培 養(yǎng) 基 回 收 率 測(cè) 定 （ %）I-SS 65.3 I-SS-M 81.0 C-SS 52.0 I-H E 83.2 C-H E 80.0 I-XLD 83.0 C-XLD 86.2 I-BS 106.6 C-BS 77.7 CH RO 68.4 C-DH L 98.4 C-WS 71.6 TSA（ 對(duì) 照 ） 100.0 I： 進(jìn) 口C： 國(guó) 產(chǎn) 典 型 菌 落 -BS C-BS I-BS 典 型 菌 落 -HE

19、C-HE I-HE 典 型 菌 落 -XLD I-XLD C-XLD（ 變 形 菌 落 -錯(cuò) 誤 ） 典 型 菌 落 -CHRO 樣 品 +BPW+SC+CHRO 樣 品+BPW+TTB+CHRO 樣 品+BPW+MM+CHRO 生 化 鑒 定1 ） 采 納 API 2 0 E或 Vitek GNI為 傳 統(tǒng) 生化 鑒 定 方 法 的 選 擇 性 替 代 方 法 ” 。 生 化 鑒 定 (續(xù) )2 ） 生 化 鑒 定 項(xiàng) 目 進(jìn) 行 調(diào) 整 原 國(guó) 標(biāo) 中 生 化 鑒 定 是 將 可 疑 菌 落 同 時(shí) 接 種 于 三 糖 鐵 （ TSI）瓊 脂 、 蛋 白 胨 水 (供 做 靛 基 質(zhì) 試

20、驗(yàn) )、 尿 素 瓊 脂 (pH7 .2 )、 氰 化 鉀 (KCN) 培 養(yǎng) 基 和 賴 氨 酸 脫 羧 酶 試 驗(yàn) 培 養(yǎng) 基 ； 現(xiàn) 修 改 為 ： 在 接 種 TSI瓊 脂 和 賴 氨 酸 脫 羧 酶 試 驗(yàn) 培 養(yǎng) 基 的 同 時(shí) 增 加一 項(xiàng) 營(yíng) 養(yǎng) 瓊 脂 （ NA） ， 經(jīng) TSI瓊 脂 和 賴 氨 酸 脫 羧 酶 試 驗(yàn) 培 養(yǎng) 基 的 選 擇 后 ，可 篩 掉 大 部 分 非 沙 門 氏 菌 株 ， 大 大 減 少 了 工 作 量 ， 同 時(shí) 也 滿 足 了 API 2 0 E或 Vitek GNI鑒 定 的 需 要 。 生 化 鑒 定 （ 續(xù) ）2 ） 生 化 鑒 定 項(xiàng)

21、 目 進(jìn) 行 調(diào) 整 （ 續(xù) ） 為 保 持 與 原 標(biāo) 準(zhǔn) 的 一 致 性 ， 本 標(biāo) 準(zhǔn) 也 保留 了 可 以 同 時(shí) 直 接 接 種 蛋 白 胨 水 (供 做 靛 基質(zhì) 試 驗(yàn) )、 尿 素 瓊 脂 (pH7 .2 )、 KCN 培 養(yǎng) 基 的內(nèi) 容 。 本 部 分 還 增 加 了 對(duì) 疑 似 菌 落 進(jìn) 行 留樣 確 認(rèn) 的 部 分 ， 以 備 必 要 時(shí) 復(fù) 查 ， 這 對(duì) 生化 鑒 定 不 確 定 的 菌 落 進(jìn) 行 進(jìn) 一 步 驗(yàn) 證 是 非常 必 要 的 。 API 2 0 E第 1位 數(shù) 第 2位 數(shù) 第 3位 數(shù) 第 4位 數(shù) 第 5位 數(shù) 第 6位 數(shù) 第 7位 數(shù) 結(jié)果

22、判定ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RGA SAC MEL AMY ARA OX1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 反 應(yīng)結(jié) 果 - + + + + + - - - - - + + + + + - + - + - 沙門菌應(yīng) 得樹 枝 0 2 4 1 2 4 0 0 0 0 0 4 1 2 4 1 0 4 0 2 0組 合編 碼 6 7 0 4 7 5 2 API 2 0 E 沙 門 氏 菌 2 0 E鑒 定 結(jié) 果 API 2 0 E布 氏 檸 檬 酸 桿 菌

23、 2 0 E鑒 定 結(jié) 果 API 2 0 E 河 生 腸 桿 菌 2 0 E鑒 定 結(jié) 果 VITEK GEN+ 應(yīng) 用 一 系 列 小 的 多 孔 的 聚 苯 乙 烯 卡 片 進(jìn) 行 測(cè) 試 ， 卡 片 含 有干 燥 的 抗 菌 藥 物 和 生 化 基 質(zhì) 。 先 制 備 一 定 濃 度 的 欲 鑒 定 菌 株的 菌 懸 液 ， 然 后 將 菌 懸 液 接 種 到 各 種 細(xì) 菌 的 小 卡 上 ， 將 其 放入 具 有 讀 數(shù) 功 能 的 孵 箱 內(nèi) ， 每 隔 一 定 時(shí) 間 ， 儀 器 會(huì) 自 動(dòng) 檢 測(cè)培 養(yǎng) 基 的 發(fā) 酵 情 況 ， 并 換 算 成 能 被 計(jì) 算 機(jī) 所 接

24、受 的 生 物 編 碼 。最 后 由 計(jì) 算 機(jī) 判 定 ， 打 印 出 鑒 定 結(jié) 果 。 VITEK 血 清 學(xué) 鑒 定 1 血 清 學(xué) 鑒 定 中 的 菌 體 分 群 為 選 擇 性 試 驗(yàn) 項(xiàng) 目 原 國(guó) 標(biāo) 進(jìn) 行 O抗 原 、 H抗 原 鑒 定 及 菌 體 分 群 ； FDA、 AOAC進(jìn) 行 O抗 原 、 H抗 原 鑒 定 ， 菌 體 分 群 為 選 擇 性 ； ISO進(jìn) 行 O抗 原 、 H抗 原 鑒 定 。 報(bào) 告 綜 合 以 上 生 化 試 驗(yàn) 和 血 清 學(xué) 鑒 定 的 結(jié)果 ,報(bào) 告 2 5 g樣 品 中 檢 出 或 未 檢 出 沙 門 氏 菌 。 注 意 事 項(xiàng)選 擇

25、 性 增 菌 液 的 配 置分 離 培 養(yǎng) 基 的 質(zhì) 控疑 似 菌 落 的 挑 選API 2 0 E 結(jié) 果 判 讀血 清 質(zhì) 量 沙 門 菌 儀 器 檢 測(cè) 法 VIDAS（ 生 物 梅 里 埃 公 司 ） BAX （ 杜 邦 公 司 ） 沙 門 菌 儀 器 檢 測(cè) 法 VIDAS 應(yīng) 用 酶 聯(lián) 免 疫 技 術(shù) 制 造 的 全 自 動(dòng) 免 疫 分析 儀 ， 用 熒 光 分 析 技 術(shù) 通 過 固 相 吸 附 器 ，用 已 知 抗 體 來 捕 捉 目 標(biāo) 生 物 體 ， 然 后 以 帶熒 光 的 酶 聯(lián) 抗 體 再 次 結(jié) 合 ， 經(jīng) 充 分 沖 洗 ，通 過 激 發(fā) 光 源 檢 測(cè) ，

26、即 能 自 動(dòng) 讀 出 發(fā) 光 的陽 性 標(biāo) 本 ， 其 優(yōu) 點(diǎn) 是 檢 測(cè) 靈 敏 度 高 ， 速 度快 ， 可 以 在 4 8 小 時(shí) 的 時(shí) 間 內(nèi) 快 速 鑒 定 沙 門氏 菌 、 大 腸 桿 菌 O1 5 7 ： H7 、 單 核 李 斯 特 菌 ，空 腸 彎 曲 桿 菌 和 葡 萄 球 菌 腸 毒 素 等 。 VIDAS 沙 門 菌 儀 器 檢 測(cè) 法 DUPONT Qualicon BAX System 應(yīng) 用 DNA分 子 核 酸 探 針 或 基 因 探 針 技 術(shù)制 造 的 全 自 動(dòng) PCR分 析 儀 。 將 已 知 核 苷 酸 序列 DNA片 段 用 同 位 素 或 其 他 方 法 標(biāo) 記 ， 加 入已 變 性 的 被 檢 DNA樣 品 中 ， 在 一 定 條 件 下 即可 與 該 樣 品 中 有 同 源 序 列 的 DNA區(qū) 段 形 成 雜交 雙 鏈 ， 從 而 達(dá) 到 鑒 定 樣 品 中 DNA的 目 的 。 DUPONT Qualicon BAX System