[DOC] 一株從銀杏內(nèi)種皮分離的細(xì)菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)過(guò)氧化氫酶研究

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1、一株從銀杏內(nèi)種皮分離的細(xì)菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)過(guò)氧化氫酶研究 北麈業(yè)掌揠2O11,20(9):174—179 ActaAgriculturaeBoreali—occidentalisSinica 一 株從銀杏內(nèi)種皮分離的細(xì)菌的鑒定 及其發(fā)酵產(chǎn)過(guò)氧化氫酶研究 李婷婷,蔡宇杰,廖祥 (1.江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 儒,尹靜,張大兵. 214122;2.江蘇漢邦科技有限公司,江蘇淮安223001) 摘要:應(yīng)用形態(tài)學(xué),生理生化和16SrRNA基因序列分析方法,鑒定從銀杏內(nèi)種皮分離得到的一株細(xì)菌;并 利用液態(tài)發(fā)酵法探討碳,氮源等對(duì)該菌產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的影響.

2、結(jié)果顯示,該菌可歸人沙雷氏菌屬,其最適碳源 為葡萄糖,最適氮源為玉米漿粉;胞內(nèi)產(chǎn)過(guò)氧化氫酶為低溫過(guò)氧化氫酶,產(chǎn)量可達(dá)8062.22U/mL發(fā)酵液 關(guān)鍵詞:過(guò)氧化氫酶;細(xì)菌鑒定;發(fā)酵;SerratiamarcescensSYBCTO2 中圖分類(lèi)號(hào):Q93文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1004—1389(2011)09—0174—06 IdentificationofaBacteriumIsolatedfromtheEndopleuraofGinkgo bilobaL.andItsFermentationforCatalaseProduction LITingting,CAIYujie,LI

3、AOXiangru,YINJingandZHANGDabing (1.TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity WuxiJiangsu214122,China;2.JiangsuHanbonScience&TechnologyCo.Ltd,Huai’anJiangsu223001,China) Abstract:Morphologicalaspects,physiologicalandbiochemicalcharac

4、tersand16SrRNAsequencea— nalysiswereusedtoidentifythebacteriumisolatedfromtheendopleuraofGinkgobilobaL.andliquid statefermentationwasutilizedtoevaluatetheeffectofcarbonandnitrogenresourcesandotherfactor onitscatalaseproduction.Thedatashowedthatthebacteriumisolatedwasbelongedtothegenus Serratiaan

5、ddesignatedasSerratiamarcescensSYBCT02,theoptimalcarbonandnitrogenresource wasglucoseandcornsteeppowder,andtheyieldofintrocellularcatalasewascoldadaptedcatalase andcouldreach8062.22U/mL. Keywords:Catalase;Bacteriumidentification;Fermentation;SerratiamarcescensSYBCT02 隨著社會(huì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng),過(guò)氧化氫在 紙漿漂白,紡織

6、和食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)得 到廣泛認(rèn)同_1].但過(guò)氧化氫本身對(duì)生物也有極 大危害,因此如何分解工業(yè)加工中過(guò)多的過(guò)氧化 氫已經(jīng)受到世界各國(guó)的關(guān)注.過(guò)氧化氫酶高效, 專(zhuān)一催化過(guò)氧化氫分解為氧氣和水,但其在環(huán)境 保護(hù)中的應(yīng)用受到其生產(chǎn)原料和成本的極大限 制.過(guò)氧化氫酶廣泛存在于不同生物的細(xì)胞 中3],依據(jù)其酶學(xué)特性,可將細(xì)菌的過(guò)氧化氫酶分 為3種E:含血紅素的單功能過(guò)氧化氫酶,含血紅 素的雙功能過(guò)氧化氫酶,和不含血紅素的過(guò)氧化 氫酶.已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多好氧或兼性好氧細(xì)菌有較高 的產(chǎn)過(guò)氧化氫酶能力,如Escherichiacoli_5],Ba— cillussubtilis,Str

7、eptomycescoelicolorE7-8],根 瘤菌],Azotobactervinelandiil1等.也有研究 報(bào)道,從嗜鹽l_】,嗜熱口..和嗜冷微生物l1.I_中 可分離得到一些酶學(xué)性質(zhì)獨(dú)特的過(guò)氧化氫酶. 尤其是低溫過(guò)氧化氫酶,可用于低溫下催化 環(huán)境中過(guò)氧化氫降解,有利于節(jié)約能源.但低溫 酶往往穩(wěn)定性差,低溫酶產(chǎn)生菌多為嗜冷菌,其生 收稿日期:2010—10—12修回日期:2010—12—05 基金項(xiàng)目:國(guó)家”863”計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA101501). 第一作者:李婷婷,女,碩士研究生,研究方向?yàn)樯锎蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu),功能與制備. 通訊作者:廖祥儒,博士,教授

8、,博士生導(dǎo)師. 期李婷婷等:一株從銀杏內(nèi)種皮分離的細(xì)菌的鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)過(guò)氧化氫酶研究 長(zhǎng)緩慢,低溫酶異源表達(dá)也較困難[1.本試驗(yàn)從 銀杏內(nèi)種皮分離得到一株高產(chǎn)低溫過(guò)氧化氫酶的 嗜溫細(xì)菌,并對(duì)其進(jìn)行鑒定,初步研究其發(fā)酵產(chǎn)酶 情況和粗酶性質(zhì). 1材料與方法 1.1菌株分離 銀杏種子經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為7O乙醇浸泡1rain 后,用無(wú)菌小鉗打開(kāi)后取內(nèi)種皮呈紅色的種子;用 無(wú)菌的鑷子剝?nèi)〖t色內(nèi)種皮,置于含25mLLB 培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaC1 10g/L,pH7.O)的三角瓶中,在30oC200r/rain 下震蕩培養(yǎng)20h.將培養(yǎng)物稀釋1O.倍,涂布于

9、LB平板,挑取單菌落再劃線(xiàn)于LB平板,挑取單 菌落保存于LB斜面培養(yǎng)基中備用. 1.2形態(tài)學(xué)和生理生化特征鑒定 將篩選到的菌株劃線(xiàn)于LB固體培養(yǎng)基, 3O℃培養(yǎng)1～2d,觀(guān)察單菌落形態(tài).并在電子顯 微鏡下觀(guān)察菌株的細(xì)胞形態(tài).參照文獻(xiàn)[17]和 E18]中的方法進(jìn)行生理生化鑒定.脂肪酸組成采 用HPLC法進(jìn)行分析. 1.316SrRNA的PCR擴(kuò)增及分析 細(xì)菌總DNA的提取見(jiàn)參考文獻(xiàn)[19].以細(xì) 菌DNA為模板,519F:5一CAGCAGCCGCGG— TAATAC一3和519R:5一CGATTACTAGCG— ATTCC一3Do],分別進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件 為:

10、95℃預(yù)變性4min,94℃變性1min,52℃退 火1rain,72℃延伸復(fù)性90S,35個(gè)循環(huán)后于 72℃繼續(xù)延伸6rain,12℃保溫10rain.PCR產(chǎn) 物測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完 成.將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast后交送 GenBank,與其中已有序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析. 1.4發(fā)酵產(chǎn)酶 1.4.1種子培養(yǎng)250mL的三角瓶裝液量為 50mL,從平板接人一環(huán)菌,30℃下于旋轉(zhuǎn)式搖床 200r/min搖瓶培養(yǎng)8h. 1.4.2發(fā)酵產(chǎn)酶在250mL的三角瓶裝液 50mL,接人培養(yǎng)8h的種子菌懸液,接種體積分 數(shù)為1O,旋轉(zhuǎn)式搖床200r/ra

11、in搖瓶發(fā)酵,不同 培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10h. 1.4.3酶的制備取一定量發(fā)酵液在108OOg 條件下冷凍離心15rain,菌泥以50mmol/L的 K2HPO—KHzPO緩沖液(pH7.O)洗滌2次,以 適量相同的緩沖液重懸后置冰浴預(yù)冷.超聲波破 碎(工作1S,停3S,總工作時(shí)間為10rain,功率為 300w),在15000g冷凍離心20min,上清液即 為胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶粗酶液. 1.5過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定 參考錢(qián)斯亮等[21]的方法,酶活力定義為 1rain分解1bLmolH2O所需酶量為1個(gè)酶活力 單位(U). 1.6數(shù)據(jù)分析 采用軟件SSPS12.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

12、,所有數(shù) 據(jù)來(lái)自最少3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn),并各有至少3個(gè)重復(fù). 2結(jié)果與分析 2.1菌落和細(xì)菌形態(tài) 菌株在LB固體培養(yǎng)基上3O℃培養(yǎng)1d后出 現(xiàn)紅色菌落,2d后菌落顏色加深,呈深紅色,菌 落直徑約4mm,不透明,圓形,中間稍隆起,粘 稠,邊緣整齊光滑.培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)掃描電鏡觀(guān)察, 細(xì)胞呈短桿狀,長(zhǎng)約1.5m,直徑約0.5m,端 圓(圖1).其菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)符合沙雷氏菌 屬的特征. 2.2菌株的生理生化鑒定結(jié)果 由表1可知,該菌為革蘭氏陰性,VP反應(yīng)陽(yáng) 性,接觸酶反應(yīng)陽(yáng)性,能發(fā)酵多種糖類(lèi)產(chǎn)酸,其大 部分生理生化特性與格氏沙雷氏菌(Serratia marcescens)最

13、為接近,但與粘質(zhì)沙雷氏菌也很相 近;而其利用蔗糖,乳糖產(chǎn)酸時(shí),與格氏沙雷氏菌 略有不同. 由表2可知,該菌的主要脂肪酸為16:0 (17.19),10:030H(15.51),17:0cyclo (11.76),14:030H/16:1ISOI(10.77)和 圖1SerratiamarcescensSYBCT02 菌株的電鏡照片 Fig.1Electronicmicroscopediagramofthestrain SerratiamarcescensSYBCT02 ? 176?西北農(nóng)業(yè)2O卷 表1SerratiamarcescensSYBCT02菌株的生理生化特征

14、 Table1ThephysiologicalandbiochemicalcharactersofthestrainSerratiamarcescensSYBCT02 注:+為陽(yáng)性,一為陰性,d為棕色(弱陽(yáng)性). Note:+meanspositive,一meansnegative,dmeansbrown(weakpositive) 一 種未知成分(11.O1),與鑒定的其他沙雷氏菌 均不相同,因此將其命名為SerratiaSYBCT02. 2.3分子鑒定 提取總DNA,以PrimerA和PrimerB為引 物擴(kuò)增菌株SerratiaSYBCT02的16SrRNA基 因部分片

15、段.測(cè)序結(jié)果顯示,序列與Serratia marcescens的16SrRNA基因的相似性超過(guò) 99.根據(jù)S.marcescens的16SrRNA基因序 列設(shè)計(jì)引物Primer01和Primer02,PCR擴(kuò)增獲 得1505個(gè)堿基的基本完整序列,利用Blast軟件 將該序列(待提交GenBank)與GenBank中收集 的所有細(xì)菌基因進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示Serratia SYBCT02的16SrRNA基因序列與Serratia marcescensstrainA3的16SrRNA基因序列相似 性最高,為99.9,結(jié)合生理生化等特性,確定 SerratiaSYBCT02屬于Se

16、rratiamarcescens,因 此最終定名為SerratiamarcescensSYBCT02. 2.4碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的影響 分別以等摩爾碳的淀粉,葡萄糖,果糖,麥芽 糖,乳糖和蔗糖為碳源,以蛋白胨為氮源發(fā)酵,菌 株產(chǎn)過(guò)氧化氫酶水平不盡相同(圖2).其中以葡 萄糖為碳源時(shí)最有利于該菌產(chǎn)過(guò)氧化氫酶,其次 為蔗糖,再就是麥芽糖和果糖,作用最小的是淀粉 和乳糖. 2.5氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的影響 以葡萄糖為碳源,分別以等摩爾氮的蛋白胨, 酵母膏,牛肉膏,玉米漿粉,豆粕,尿素和茶籽粕為 氮源發(fā)酵,菌株產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的情況如圖3所示. 結(jié)果表明,玉米漿粉最有利于該

17、菌產(chǎn)過(guò)氧化氫酶, 其次為蛋白胨和酵母膏,再者為牛肉膏,尿素,茶 籽粕不利于產(chǎn)酶. 2.6溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 以葡萄糖和玉米漿粉分別為碳源和氮源的培 養(yǎng)基,在不同溫度下震蕩培養(yǎng)10h,菌株發(fā)酵產(chǎn)過(guò) 氧化氫酶的情況見(jiàn)圖4.圖4說(shuō)明該菌產(chǎn)過(guò)氧化 氫酶的最適溫度為33℃,與其最適生長(zhǎng)溫度相近. l23456 碳源Carbonsources 1.淀粉Starch;2.葡萄糖Glucose;3.果糖Fructose;4.麥芽 糖Maltose;5.乳糖Lactose;6.蔗糖Sucrose 圖2碳源對(duì)SerratiamarcescensSYBCT02 產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的影響 Fi

18、g.2Ef~ctofcarbonresourcesONcatalascidtype 脂肪酸相對(duì)含量/ Relativecontentofacid SYBC08SYBCT02 注:SYBC08為SerratiamarcescensSYBC08,保存于中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所國(guó)家菌種保藏中心,編號(hào)為CGMCC3449. Note:SYBCT08isSerratiamarcescensSYBC08,preservedin ChinaGeneralMicr0bi0l0gicalCultureCollectionCenter,andits nesoncatalaseproductiono

19、f SerratiamarcescensSYBCT02 10000 8000 6000 4000 2000 0 溫度/℃Temperature 圖4溫度對(duì)SerratiamarcescensSYBCT02 產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的影響 Fig.4Effectoftemperatureoncatalaseproduction ofSerratiamarcescensSYBCT02 12O 100 s. 棼60靛 薯t Micrococcuslysodeiktious Penicilliumvariabile Aspergillusniger Saccharomyc

20、escerevisiae Pseudomonad Vibriorumoiensis 嗜熱子囊菌 TherlnoaSCU$aurantiacus 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所ChinaGeneralMierobio— logicalCultureCollectionCenter 江南大學(xué) JiangnanUniversity 蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 SchoolofLifeSciences,SuzhouUniversity 意大利Basilicata大學(xué) ItalyBasilicataUniversity 波蘭,MariaCurie—Sklodowska大學(xué) MariaCur

21、ie—SklodowskaUniversity 印度,中央食品技術(shù)研究院 India,CentralInstituteofFoodTechnology 瑞典,HeinoKuusk Sweden,HeinoKuusk 日本,早稻田大學(xué) Japan,WasedaUniversity 江南大學(xué)JiangnanUniversity 14OU/mL 185U/mL 292U/mL 735U/mL 78U/mL 104U/g 161U/mL 321U/mg 2762U/mL Shakingflaskfermentation 發(fā)酵罐 Fermenter 搖瓶 Sha

22、kingflaskfermentation 發(fā)酵罐 Fermenter 發(fā)酵罐 Fermenter 發(fā)酵罐 Fermenter 搖瓶 Shakingflaskfermentation 搖瓶 Shakingflaskfermentation 發(fā)酵罐 Fermenter 注:*表示每克濕菌體,**表示每毫克細(xì)胞. Note:*meanscellstrainpergram,**meansceilspermilligram. 2.7粗酶的特性分析 由圖5,6可見(jiàn),該菌過(guò)氧化氫酶最適pH為 9,最適溫度為5O℃在0℃時(shí)酶活為最適溫度 的64.85,說(shuō)明應(yīng)有低溫過(guò)氧化氫

23、酶的存在. 童 羹 溫度/℃Temperature 圖6溫度對(duì)SerratiamarcescensSYBCT02 過(guò)氧化氫酶活性的影響 Fig.6Effectoftemperatureoncatalaseactivity ofSerratiamarcescensSYBCT02 3討論 通過(guò)形態(tài)鑒定,生理生化特性比較和16S rRNA基因序列分析,從銀杏內(nèi)種皮分離得到的 細(xì)菌SYBCT02既不同于格氏沙雷氏菌,也不同 于現(xiàn)有的粘質(zhì)沙雷氏菌菌株,鑒于其16SrRNA 基因序列明顯接近粘質(zhì)沙雷氏菌,將其歸屬于沙 雷氏菌屬的粘質(zhì)沙雷氏菌,定名為Serratia marce

24、scensSYBCT02. 從發(fā)酵產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的情況來(lái)看,菌株Ser— ratiamarcescensSYBCT02的最佳碳氮源分別為 葡萄糖和玉米漿粉,最適溫度為33℃.在碳源和 氮源分別為葡萄糖及玉米漿粉時(shí),產(chǎn)酶可達(dá)到 8062.22U/mI,比活力達(dá)613.24U/mg,與國(guó)內(nèi) 外產(chǎn)過(guò)氧化氫酶菌株相比有一定優(yōu)勢(shì)E(表3). 從粗酶的性質(zhì)來(lái)看,該菌所產(chǎn)過(guò)氧化氫酶為 堿性過(guò)氧化氫酶,基于其在0℃時(shí)仍能保持最適 溫度時(shí)的64.85,該菌應(yīng)該能夠產(chǎn)生低溫過(guò)氧 化氫酶,相比于國(guó)內(nèi)外大多數(shù)過(guò)氧化氫酶菌株, 更具備工業(yè)價(jià)值.因此,Serratiamarcescens SYBCT

25、02屬于能夠產(chǎn)低溫過(guò)氧化氫酶的嗜溫 菌.至于該菌產(chǎn)過(guò)氧化氫酶的發(fā)酵調(diào)控,所產(chǎn)酶 的酶學(xué)性質(zhì)及分子特征等還有待進(jìn)一步研究. 參考文獻(xiàn): Eli劉冰,梁嬋娟.生物過(guò)氧化氫酶研究進(jìn)展EJ].中國(guó)農(nóng)學(xué)通 報(bào),2005,21(5):223—224. /-23ZamockyM.FurtmullerPG,Obinc.Evolutionofcatalases frombacteriatohumansEJ].Antioxidant8LRedoxSigna— ling,2008,10:1527—1548. E33LoshehaginOV.KovalenkoRI.Possibleroleofcat

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