[歷史學]倫敦大學帝國學院igem項目之 學習筆記

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1、倫敦大學帝國學院igem項目之 學習筆記 一：荒漠化 土壤侵蝕和荒漠化是全球范圍內(nèi)的問題。導致耕地的損失，經(jīng)濟困難和環(huán)境退化。我們的項目側(cè)重于解決這些嚴重問題的工程菌，以提高植物根系生長。我們正計劃來實現(xiàn)我們的細菌帶入一個種皮，以幫助重新植被的土地侵蝕的風險。樹木和植物有助于保持土壤和防止水土流失，導致荒漠化。 荒漠化是下降的，其中包括干旱，半干旱和亞濕潤干旱地區(qū)的干旱地區(qū)。干旱地區(qū)近40％的地球陸地約兩個億人，其中大部分生活在發(fā)展中國家。旱地土壤維持一個脆弱的生態(tài)系統(tǒng)，適應罕見的降水和劇烈的溫度變化。過度開發(fā)旱地種植和原料用途的土壤呈現(xiàn)無益的，強迫遷移的社區(qū)搜索肥沃的土地，離開貧瘠

2、的土地裸露，容易受到侵蝕力。在許多發(fā)展中國家的糧食供給缺乏強制的土地短期收益，以及砍伐森林，耕地不斷培養(yǎng)。 影響：土壤侵蝕影響的氣候和生物多樣性，往往會導致不可逆的荒漠化。羅茨提高土壤的穩(wěn)定性和防止水土流失 。此外，樹木提供掩護和保護附近的動物和植物。在容易發(fā)生水土流失的區(qū)域，這是特別重要的，因為降雨往往是罕見的，但是當它發(fā)生，它往往是非常激烈的，很容易造成表土被沖走。 二：植物路線 趨化性是根據(jù)吸引或排斥的化學品的細菌的運動。根系分泌多種化合物，大腸桿菌 大腸桿菌不會被吸引到自然。因此，我們設計了一種化學感受器到我們的底盤，可以感知蘋果酸鹽，一個共同的根滲出物中，以便它可以向根游泳。此

3、外，E. 大腸桿菌都在積極采取了由植物的根，這將使成根，我們的系統(tǒng)，有針對性的IAA交付。 主要由細菌運動對植物根系的植物路由模塊。細菌運動的根源，微生物到自己的根。事實上，細菌，它們被用來對營養(yǎng)物質(zhì)的植物，在植物的根，是一個新的發(fā)現(xiàn)，去年只當Paungfoo Lonhienne等 。非致病性大腸埃希氏菌的吸收到根的擬南芥（豆瓣）和番茄（番茄植物）。他們已經(jīng)成功地復制了這些調(diào)查結(jié)果。為他們的項目，這是特別有趣的，將暴露于作為植物內(nèi)的根細胞，這顯著影響的細菌濃度的IAA需要產(chǎn)生的，以實現(xiàn)最佳的根生長的細菌的生長素。此外，植物路線有可能被用來作為一個平臺，提供化合物，自然不會發(fā)生在工廠，

4、沒有基因改造植物本身的根。 （1）細菌趨 他們的主要底盤，濕實驗室的實驗是大腸埃希氏菌。趨化性E. 大腸桿菌是有據(jù)可查的。這些細菌可以執(zhí)行兩種類型的運動，翻滾和光滑游泳。兩者之間的差異被確定由鞭毛運動。在翻滾運動，鞭毛順時針移動。這是崔泰源-P和FLIM的，一體的鞭毛相關蛋白之間的復合物的形成引起的。在平滑游泳，鞭毛逆時針移動。崔泰源未磷酸化，并因此，不能與鞭毛蛋白，導致在相反的方向旋轉(zhuǎn)的鞭毛。 平滑游泳是運動，進行細菌對引誘或遠離劑。平滑游泳是控制趨化蛋白的信號轉(zhuǎn)導通路，使一些示范。 圖1：大腸桿菌細胞表達superfolder GFP（sfGFP）的擬南芥根的植物與細菌培養(yǎng)過

5、夜后利用共聚焦顯微鏡可以看到里面。根在PBS中洗滌，成像前，以避免“假陽性”的根的外側(cè)附著的細菌。根內(nèi)的細菌對于一個很酷的3D視頻，看看我們的結(jié)果頁。（數(shù)據(jù)和影像帝國IGEM 2011）。 （2）產(chǎn)品規(guī)格 1。應積極邁向根的細菌。 為了做到這一點，需要的細菌是能夠感應到一個共同的根滲出物。我們選擇了重新布線E. 大腸桿菌的趨化通路朝著L（ - ）的蘋果酸（也簡稱為蘋果酸），檸檬酸循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的化合物。它是由分泌的根在低濃度。 2。根吸收的細菌進入。 吸收細菌進入根，接著所分泌的天然化學物質(zhì)提出了一個新的平臺，為修改而基因改造植物基因組的植物。 3。在我們的機箱的外源基因的高效表達。

6、 由于我們是從土壤細菌的基因?qū)氲紼. 大腸桿菌我們必須考慮到影響密碼子偏性，可以發(fā)揮我們的結(jié)構的表達。因此，我們必須確保我們的結(jié)構并不受這種現(xiàn)象的表達。 （3）設計 目標是確保制定的規(guī)格。 1。這種細菌應該感覺到蘋果酸，積極邁向根。 雖然蘋果酸敏感的傳感器不自然地發(fā)生在E. 大腸桿菌，他們已經(jīng)確定了其他一些細菌的種類，包括土壤中的微生物銅綠假單胞菌 PA01株和惡臭假單胞菌 KT2440株。PA2652是一個敏感的蘋果酸的化學感受器中發(fā)現(xiàn)P. 銅綠微囊藻和MCP是一種受體，發(fā)現(xiàn)P. 惡臭響應一些TCA循環(huán)的中間體，包括蘋果酸的[1] [2] 。銅綠假單胞菌和P.趨化的分子機制 惡臭

7、不同的大腸桿菌 大腸桿菌。然而，有高度的結(jié)構相似性的蛋白質(zhì)，使在這些生物體的趨化性途徑之間。因此，這是合理的假設，PA2652或MCPS域的將互動與本地的趨化途徑E. 大腸桿菌，細菌將能夠執(zhí)行引入受體結(jié)合的趨化反應后，蘋果酸鹽。 2。他們的底盤中的高效表達。 他們用他們的密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化PA2652結(jié)構（BBa_K515102）表達的E. 大腸桿菌。 3。構建體必須是如模塊化盡可能。 表達的蘋果酸的化學感受器的基因結(jié)構并不復雜。然而，他們是模塊化的。目前的結(jié)構，表達組成型啟動子J23100受。這是的組成啟動的零件注冊表中最強的之一。我們選擇了這個，因為它是更容易的一個結(jié)構調(diào)整的表達，

8、而不是調(diào)整它的啟動子。要表達的遺傳結(jié)構調(diào)整，我們已經(jīng)推出了15個基點絕緣體序列，可以方便的啟動子通過PCR使用的互換性和微調(diào)的表達水平。確保啟動子替換時不改變的核糖體結(jié)合位點的TIR（翻譯起始速率）。PA2652和MCP翻譯起始率，分別為42010和44050。 4。根吸收的細菌進入。 根系的吸收都E. 大腸桿菌和面包師的酵母釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中可以觀察到的模式生物擬南芥，并在番茄植株。這是一個自然發(fā)生的過程，（雖然它在土壤中，則仍有待觀察），我們并不需要把額外的基因，我們的設計吸收發(fā)生。 （4）模型 1）簡介 趨化性上升趨化因子（如在我們的

9、項目中的蘋果酸）的濃度梯度和遠離的驅(qū)蟲劑是細菌的運動（例如毒物）。E. 大腸桿菌是太小的，檢測到任何在其兩個端部之間的濃度梯度。這些細菌周圍的環(huán)境重新取樣，每隔3-4秒，無論是翻滾導致細胞或運行。趨化因子短暫的“翻滾”（或偏見）的概率增加。這之后，由感官的適應過程，返回到基線偏置，使細胞進一步的濃度變化來檢測和響應。在趨化因子濃度的變化在空間上均勻的環(huán)境中增加一小步的響應時間從1秒到2-4秒。改變的飽和水平的趨化可以增加響應時間到幾分鐘。 每一個化學感受器上的細菌周質(zhì)結(jié)合結(jié)構域和一個胞內(nèi)信號結(jié)構域通信的鞭毛馬達通過CHEA，崔泰源，和Chez蛋白的磷酸化繼電器順序。趨化通路建模的結(jié)果，將決定

10、的閾值用于細菌檢測的趨化因子的濃度和飽和細菌趨化檢測成為在哪一級，降低細菌的趨化反應的效率。 2）模型的趨化途徑 2.1目的 使用MATLAB模型的趨化作用的途徑和8μM化學感受器，從而確定檢測閾值和飽和度水平的趨化因子的細菌。因為它被認為應放置在靠近最佳生長的種子（<0.25厘米[4] ）的生長素。因此，這是至關重要的，以確定是否我們的細菌能夠保持密切的種子。 2.2說明 圖1 [1] ：趨化的信令組件和途徑 E. 大腸桿菌。 E.在趨化途徑 圖1表明在大腸桿菌?；瘜W感受器，形成穩(wěn)定的三元復合物與謝和咀嚼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的信號控制鞭毛馬達的旋轉(zhuǎn)方向[5] 。的信令組的貨幣是在磷酰（

11、對），它是由的崔泰源和CHEB的效應蛋白可通過自身磷酸化CHEA [1]的形式。崔泰源p啟動鞭毛響應通過與電機提升運行 [1]的概率相互作用。海布p是一個感覺適應電路的一部分，終止運動反應[1] 。因此，研究海布和崔泰源的甲基化和磷酸化水平的了解一個單細胞的趨化是很重要的。斯皮羅等人的模型的基礎上。（1997）[1]被用來研究的濃度是如何隨時間變化的趨化通路中的蛋白質(zhì)。 此外，鏈接崔泰源p濃度與運動類型的（運行與翻滾）的數(shù)量被稱為偏置。它被定義為上運行花費的時間相對于總的運動時間的幾分之一。的相對濃度的崔泰源p的轉(zhuǎn)換成馬達偏置使用希爾函數(shù)（公式1）。 2.3結(jié)果與討論 基于斯皮羅模型

12、 ，甲基化水平崔泰源和CHEB的受體和磷酸化水平（圖2）進行了研究。此外，我們研究的運行/干衣決策，這是基于相對受體占用的依賴。這意味著，僅依賴于任何特定的化學感受器的概率被占用趨化外部concetration的，但不是總數(shù)量的化學感受器。即使不依賴閾值和飽和度水平的化學感受上的趨化因子的濃度（圖3） 。不同數(shù)量的受體肯定會允許進行更加細致的適應，因此選擇了最強的啟動子為最佳的靈敏度。 圖2（a）：崔泰源圖2的磷酸化水平，（二）：磷酸化的CHEB 圖2（c）：甲基化水平美洲蜚蠊下顎，圖2（d）：在不同的運行狀態(tài)的概率中的細菌在崔泰源p圖2（a）（B）（C）的水平表示的閾值檢測的濃度是10 -

13、8 M，并且飽和濃度為10 -5 M。（建模的基礎上螺等人[1]，代碼進行了修改，帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 圖3：與趨化因子濃度的化學感應檢測閾值和飽和度水平。此圖清楚地表明，不依賴閾值和飽和度水平的化學感受上的趨化因子的濃度。 3）模擬的細菌人口的趨化 3.1目標 趨化實驗和自然條件下的細菌種群動態(tài)模擬。實驗室條件下的模型將有助于的濕實驗室團隊在他們的實驗設計。該模型的現(xiàn)實土壤條件會通知我們的項目如何以及在何處，我們可以把我們的細菌。 在實驗條件下，趨化擴散，不斷從源頭上。然而，在現(xiàn)實的土壤，根產(chǎn)生蘋果酸所有的時間。因此，我們假設，分布的趨化以外的種子是穩(wěn)定的

14、，與時間無關的。因此，細菌群體趨化建模將建成的趨化因子分布與不同的模式。 3.2說明 這部分的造型專注于創(chuàng)建一個模型的細菌人口趨化運動。在趨化，化學感受器感受到的趨化因子的濃度增加，然后發(fā)送一個信號，即抑制翻滾。同時，變得越來越甲基受體。相反，在趨化因子的濃度減少翻滾頻率增加，并導致受體的去甲基化。翻滾頻率大約為1赫茲時，鞭毛運動是公正的，并降低到幾乎為零的細菌向上移動的趨化梯度[5] 。為了準確地建立模型，作如下假設的基礎上文獻： 1）定向運動相位期間，平均血流速度在哪些E. 大腸桿菌移動為24.1微米/秒[7] 。鑒于在翻滾階段，是不顯著的速度慢，可以忽略不計。 2） E. 大

15、腸桿菌通常需要作為其基礎上決定是否集中度有所提高或過去的第二。因此，在我們的模型中的細菌將能夠比較濃度的趨化因子在t秒，在t-1秒。 3）在我們的模型中，我們忽略了，E. 大腸桿菌不行駛在一條直線上在運行過程中，而是采取曲線路徑由于不平等的射擊鞭毛。 4）我們的模型沒有考慮細菌的生長，或由于法定人數(shù)感應到一個小面積的細菌聚集的傾向。 在此模型中，細菌應該是能夠比較在當前時間點的過去的第二處的濃度的趨化因子的濃度。如果濃度的降低（即 T1 -C T2 ≤0），細菌就會跌倒的頻率為1 Hz。如果增加的濃度（C t1的 -C t2的 > 0），翻滾頻率減小，因此翻滾的概率減小。參考中的式（1

16、0）[6]，我們知道，當C t1的 -C t2的 > 0，翻滾隨著chemostatic常數(shù)，細菌速度，濃度差之間相鄰的時間點和角度之間的指數(shù)函數(shù)的概率的兩個時間點。[8]因此，我們可以凝聚上面的描述，下面的語句： 3.3結(jié)果與討論 3.3.1 Baterial趨化實驗室 在實驗室條件下，趨化因子從源頭上不斷擴散，因此，趨化因子隨時間變化的分布格局。的誤差函數(shù)（方程2）在這種情況下，被用來描述的非穩(wěn)定狀態(tài)下的趨化分布。 對于趨化的濕實驗室的實驗，用戶界面設計的實驗方法來驗證其可行性。最初，一個實驗的目的是作為放置一定數(shù)量的細菌的6厘米距離與不同濃度的趨化源。放置100個細菌

17、的趨化性的模擬的6厘米遠離5 mM的蘋果酸源示出在下面的電影。而這MATLAB程序具有一個圖形用戶界面（GUI）（圖4），它可用于由濕實驗室學生簡單的輸入?yún)?shù)和生成靜態(tài)的圖形或動畫。 圖4： MATLAB的圖形用戶界面，（帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 上面的視頻顯示，趨化需要14000秒擴散到菌落。在這段時間內(nèi)的細菌會被復制到所有的板。因此，從建模，可以推斷，這些實驗結(jié)果可能無法清楚地表明趨化性（看到的結(jié)果，在我們的濕實驗室）。因此，設計了新的實驗設置，作為趨化因子被保持在毛細管和以及與細菌懸浮液放入;誘食擴散入井設置濃度梯度。細菌游泳的濃度梯度，給定的時間后進入毛細管，毛

18、細管被除去，并在毛細管中的細菌數(shù)進行計數(shù)。表明在圖5示出在整個實驗設計。這種新的模式整合，完善我們的實驗結(jié)果。這進一步細化又是通知的設計，我們的分析，這將導致更準確的數(shù)據(jù)，從而創(chuàng)造出精致的植物檢疫路由模塊之間的循環(huán)的建模和濕實驗室。 圖5：演示實驗裝置的毛細管分析。（圖由倫敦帝國學院2011年iGEM比賽的球隊。） 毛細管和趨化因子的分布狀況是不同的。因此，兩種趨化因子分布狀況進行了推導，推導的詳細信息，請在這里下載。示出的單核細胞趨化在阱的分布，在毛細管內(nèi)的分布方程中所示的等式3和等式4。 同樣地，一個用戶接口的設計，使?jié)駥嶒炇覍W生不同的輸入?yún)?shù)（圖6）。以下的視頻顯示

19、的模擬與1000個細菌，用直徑為1mm的填充用1mM的趨化chemotaxing朝向毛細管。圖。圖7示出了在每個時間點在毛細管中的細菌數(shù)量。該模型表明，在毛細管中積累的細菌，是在3600秒的最大數(shù)目。因此，我們的模型表明，的濕實驗室的學生應執(zhí)行本實驗為60分鐘，然后收集數(shù)據(jù)。 圖6： Matlab的圖形用戶界面，為我們的趨化毛細管分析。（帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 圖7：細菌的數(shù)量在毛細管與時間（帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 3.3.2在土壤中的細菌趨 在現(xiàn)實的土壤，蘋果酸鹽用作趨化。馬拉特是不斷從根尖分泌3 mM的[9]的濃度。在這種情況下，蘋果酸源

20、總是補充由于持續(xù)分泌從根和分配方式可以被認為是穩(wěn)定的（即與時間無關）。的穩(wěn)定狀態(tài)Keler的謝格爾模型是用來證明這個分布（公式5）。 真正的蘋果酸在土壤中的分布顯示在圖5。細菌趨藥性的路徑，當將細菌在穩(wěn)態(tài)蘋果酸分布在不同的位置上時，表明在圖5。 圖8（a）：的蘋果酸鹽的距離（1D），圖8（b）：蘋果酸鹽用半徑（2D）中的分布的分布，圖8（b）示出的位置的閾值檢測的濃度（1e的-8 M的半徑= 0.028 m）和飽和濃度（是1e-5 M的半徑= 0.012）。 圖9：與細菌的趨化性放置在不同的起始位置。 藍：210 5秒趨化開始于半徑= 0.015米（之間0.012 m和0.028

21、米的），綠色：210 5秒趨化開始于半徑=0.008米，這是小于0.012。這表明的細菌的趨化反應是低效的，當它們被放置在從根尖端0.0028米0.0012米。綠線表示，這種細菌可保持接近的種子，當它被放置在遠離根尖的距離小于0.012米。因此，該模型表明，這種細菌被放置在一個距離小于0.012米，在我們的項目實施。 最后，用于細菌檢測的閾值的趨化因子的濃度是110 -8 M和細菌趨化檢測變得飽和水平是110 -5 M。我們還表明，檢測閾值和飽和度水平是趨化因子受體的數(shù)量無關，然而，為了使最大靈敏度，最強的啟動子應該選擇植物路由模塊。此外，與蘋果酸濃度等于3 mM的，閾值檢測的濃度是在從根0

22、.028米的距離，和飽和濃度達到0.012米（1.2厘米）遠離根。從建模的細菌種群的趨化性，我們觀察到根的趨化性是緩慢的，如果該細菌最初放置在兩者之間0.012 m和0.028米的，同時，放置從根0.012米內(nèi)細菌時，細菌很可能穩(wěn)定和保持密切的根。穩(wěn)定的細菌本地化，（1.2厘米）的距離是大于0.25厘米（營養(yǎng)物質(zhì)可以有效地根的距離），因此，建議的細菌，我們的種皮的實施，應放置在或接近0.25厘米遠離根。 二：生長素 （1） 概觀 生長素，或吲哚-3 -乙酸（IAA），是一種植物生長的激素，它是通過幾個土壤細菌。我們已經(jīng)采取的基因編碼，從假單胞菌savastanoi IAA生產(chǎn)的途徑，并表

23、示他們在大腸埃希氏菌。植物路由模塊對根和吸收趨化之后，IAA表達，目的是提高土壤的穩(wěn)定性，促進根系生長其也被稱為是一個充分研究的負責響應于生物和非生物脅迫的用于植物生長的植物激素。通常，類似的α-萘乙酸（αNAA）和2,4 - 二氯苯氧乙酸（2,4-D）的合成生長素作為除草劑的使用。在過去的50年來，由于他們的高效率和廉價的成本，他們已經(jīng)在作為除草劑的用途。 雖然生長素是一種促生長的激素，它可以在高濃度下對植物的代謝負擔，因此，毒性。合成生長素是非常穩(wěn)定，在土壤中能堅持幾個星期，這就是為什么他們是非常有效的除草劑。IAA，在另一方面，是化學不穩(wěn)定的，并可以很容易地由植物代謝。因此，如果我們在

24、我們的底盤生產(chǎn)IAA，它應該促進而不是阻礙植物根系的生長。仍然是一種風險，即IAA可以仿照在硅片告知生長素隨心模塊的設計，其合成前在高濃度，因此，基因表達水平的植物是有毒的。我們的目標是產(chǎn)生IAA E. 大腸桿菌中以受控的方式，以便它永遠不會到達的毒性閾值。在整個項目，該模塊將負責影響根系生長，形成復雜的根網(wǎng)絡，可以有效地保持土壤，防止其侵蝕的目的。 圖1。的化學結(jié)構，合成的和天然的生長素。（圖片由先正達提供）。 （2）產(chǎn)品規(guī)格 1。一個簡單的的IAA生產(chǎn)的途徑，可以表現(xiàn)在我們的底盤。 IAA是一種植物激素，促進植物生長的細菌快遞（PGP） IAA的植物對營養(yǎng)物質(zhì)的交換。有幾種不同

25、的途徑可以制作IAA（圖1）。我們決定使用的IAM的途徑，因為它已被證明在E.工作 大腸桿菌，并且由的只有兩種酶。 2。片段序列設計適合聚合酶延伸組件的方法，以最低的成本。 我們決定用聚合酶延伸，而不是標準限制連接的組件的裝配，因為它將使我們能夠訂購多個片段的序列。這將保持低于1000 bp的訂單，也降低了生產(chǎn)時間。此外，像吉布森和CPEC的方法，使我們能夠建立包含多個組件的結(jié)構，在一個反應??，而不是不必結(jié)扎每個BioBrick順序的。 3。實現(xiàn)足夠的IAA的表達水平在我們的底盤，在我們的工廠模式，以提高根系的生長。 IAA在我們的底盤表達的目的是提高植物根系的生長，并最終提高土壤的

26、穩(wěn)定性。因此，我們需要的IAA濃度的影響根系生長模擬和測試，以確定最佳的濃度不引起毒性。 4。調(diào)整的IAA生產(chǎn)水平啟動子不影響RBS強度的情況下切換。 要促進未來調(diào)整的表達，我們在設計結(jié)構時，蘇格蘭皇家銀行是不會受到影響的發(fā)起人。為了做到這一點，我們增加了15個基點絕緣體它們之間的序列。 5。建立一個結(jié)構，密碼子優(yōu)化為E. 大腸桿菌和B?？莶菅挎邨U菌。 我們使用的是E. 大腸桿菌作為我們的機箱，因為人類實踐問題，周圍環(huán)境中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的蔓延。此外，它已被證明，大腸桿菌 大腸桿菌是采取了積極的擬南芥 [2] 。然而，在未來，我們希望有可能建立相同的

27、構造B. 枯草芽孢桿菌，一個突出的土壤中的孢子形成的細菌。 圖1。有幾種不同的IAA的生產(chǎn)途徑。該IAM通路是一個兩步驟的途徑，從前驅(qū)體色氨酸生成吲哚-3 -乙酸（IAA）。IAA色氨酸單加氧酶（IAAM），催化氧化羧化的L-色氨酸為吲哚-3 -乙酰胺水解為吲哚-3 -乙酸和氨的吲哚乙酰胺水解酶（IAAH）[1] 。 （3）設計 他們心中的規(guī)格，我們通過文獻搜索和咨詢專家告知我們的IAA表達結(jié)構的設計。 1。該IAM通路是一個簡單的IAA的制造途徑與只有一個中間。 他們選擇，使用IAM（吲哚乙酰胺）的途徑，來源于假單胞菌savastanoi。此途徑只涉及兩種酶產(chǎn)生IAA（iaaM和戰(zhàn)

28、勝饑餓國際聯(lián)盟），因此最大限度地減少碎片的數(shù)量，我們需要在我們的結(jié)構組裝。 2。設計適合于基于聚合酶延伸組裝的基因序列。 由于他們有兩個比較大的酶（約61 kDa和47 kDa的），他們決定每一個分裂成兩個片段，以加快其合成。他們設計了50 bp的重疊區(qū)域的端部的每一個的四個片段，以便能夠快速基于聚合酶延伸的組裝成標準pSB1C3矢量。 3。實現(xiàn)足夠的IAA的表達水平在我們的底盤，以提高我們的模式植物的根系生長。 我們將iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟基因的控制下的Pveg2啟動。我們選擇該啟動子，因為它是功能E. 大腸桿菌和B?？莶菅挎邨U菌。 4。是絕緣體序列設計，使啟動開關。 為了使

29、調(diào)整的IAA生產(chǎn)，使用不同強度的推動者，我們正在設計一個絕緣體序列前面iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟，不影響RBS實力的情況下啟動開關，以方便使用PCR的核糖體結(jié)合位點。 5。聯(lián)合密碼子優(yōu)化E. 大腸桿菌和B。枯草芽孢桿菌 他們做了一個密碼子優(yōu)化軟件，優(yōu)化兩款機箱都提供靈活性，在未來的iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟序列，盡管我們目前使用的E. 大腸桿菌作為我們的底盤。 （4）模型 1）簡介 足夠的生產(chǎn)能有效地促進植物根系生長的植物激素或轉(zhuǎn)基因（GM）大腸埃希氏菌吲哚-3 -乙酸（IAA） 。但是，IAA是對植物有毒的，如果它的濃度過高。因此，重要的是IAA表達水平能夠預測一個給定的子，然后調(diào)

30、整子強度，以保證我們的大腸桿菌最佳的IAA 增加根系生長。 IAA增加根系生長，根長和分支數(shù)量方面。為了研究不同濃度的IAA影響根系的生長模式，建模工具，用濕實驗室檢測結(jié)果，結(jié)合預測和可視化擬南芥根系生長。 2）IAA合成模擬 2.1目的 一個單一的E.確定IAA表達水平 大腸桿菌細胞與IAA啟動子強度4.536 RNA /分鐘/μg的底物DNA，然后預測要放置在種子涂層，誘導最佳的根生長的細菌數(shù)量。 2.2說明 遺傳工程的IAA途徑涉及兩個基因，iaaM和IAAH，這兩者都是組成型表達。IAAM基因編碼色氨酸2 -單加氧酶（T-2-monase），色氨酸（Trp）的吲哚-3

31、 -乙酰胺的催化轉(zhuǎn)換（IAM），然后將其水解以釋放吲哚-3 -乙酸（IAA）由水解酶IAAH [3] 。在同一時間，合成的IAM和IAA將競爭性地抑制色氨酸2 -單加氧酶的酶活性，從 ??而誘導的IAA的表達上的負反饋環(huán)路。圖1中示出在該途徑所涉及的酶促反應。 圖1：IAA合成途徑。（圖由倫敦帝國學院的iGEM比賽的隊）。 此外，從美國科羅拉多大學的研究進行了數(shù)學生物學研究組的基礎上[4] ，色氨酸也是負面的控制內(nèi)的細菌。因此，色氨酸合成途徑應納入上述模型。此外，為了減少的數(shù)目的參數(shù)，如在圖1中的參數(shù)大多數(shù)是不提供給我們，在IAA通路然后分為兩個米氏米氏方程，與色氨酸的途徑和組成型

32、基因表達的T相結(jié)合的簡化-2-monase和IAAH。整個色氨酸IAA通路模型[5]中描述的公式1 ，和參數(shù)定義在下面的參數(shù)部分。 在這個模型中，我們提出以下假設： （1）他們忽視了很短的時間延遲，由于TRP-T-2-monase（底物酶（ES）復雜的），IAM-戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟（ES的復雜），IAM-T-2-monase（抑制酶的合成（ EI）配合物）和IAA-T-2-monase（抑制劑的酶（EI）絡合物），并假定這些物種幾乎在瞬間達到其平衡。 （2）IAA的降解率在黑暗中細菌的生長速度相比是非常低的。因此，我們使用了細菌的生長速率，在這個模型中的IAA降解率。 在建模的IAA通路

33、（3），我們發(fā)現(xiàn)，IAA合成的速率確定的物種是（I??AM），而不是酶IAAH，因為生產(chǎn)的IAM被抑制本身和IAA。 2.3結(jié)果與討論 1。每個蛋白物種的濃度是如何隨時間變化。 2。各物種的酶促反應，與O F = 1.5410 -4 μM，M F = 3.7810 -4 μM，E = 0.378μM，色氨酸= 4.1μM和所有其他= 0的初始濃度的模擬[4]。 此外，圖2示出，IAA的表達水平為72.35μM，這意味著每個細菌生產(chǎn)的7.2410 -14微摩爾每細菌在穩(wěn)定狀態(tài)下與細菌的體積等于10 -15分米3。從潮濕的實驗室實驗中，我們知道，IAA以促進根系生長的最佳濃度為0.1 nm

34、，和擬南芥種子的體積約等于3.610 -9米3 [7] 。因此，需要存在于種皮，以最大限度地提高根根系生長的細菌數(shù)為4.9710 6。 詳細的計算中列出如下： 1。一個單一的細菌所產(chǎn)生的摩爾數(shù)是72.35微米* 10 -18米3（7.235 * 10 -17微摩爾）。 2。的IAA的摩爾數(shù)，需要在一個種皮是3.6 * 10 -9米3 * 0.1 nmol。 3。細菌的數(shù)量需要是發(fā)生在一個種皮（3.6 * 10 -10微摩爾）/（7.23510 -17）= 4.9710 6。 圖2（a）：（的IAM）隨時間的演變。圖2（b）：的IAA對時間的演變。 總之，我們獲得的IAA濃度的，I

35、AA DNA結(jié)構（72.25μM）產(chǎn)生的。從這個值，我們計算出的細菌數(shù)量，將需要輸入理想的生長條件，而忽略死亡和分裂的細菌，這被認為是4.97x10 6 細菌擬南芥的根目錄下。此值由于在不同的植物種子大小的變化而變化。由于細菌細胞可從該植物中丟失，不是所有的細菌從種皮進入工廠，在種皮所需的細菌的數(shù)目將是高于此。此外，在接下來的部分根系生長模型幫助我們想象的根系生長。 3）IAA的吸收和根系的生長 3.1目標 1創(chuàng)建一個圖形程序來演示的擬南芥根系的生長過程，Lindenmayer系統(tǒng)和植物生理學的原則的基礎上。 2使用Matlab數(shù)據(jù)擬合工具來開發(fā)IAA濃度和增長速度的分行數(shù)目之間的關系

36、。 3.2說明 我們使用計算的工具，visulise根系生長的現(xiàn)象，（主要根長，分枝，根系密度等）在不同的enviromental條件下，特別是根序和根長。根為了描述一個根系統(tǒng)的分支“代”，被定義為一個零階根的根不分枝。根系生長取決于環(huán)境因素的影響，比如引力和土壤的非均質(zhì)性。 3.2.1向性 一個根系統(tǒng)啟動的零階根單根的尖端。然后根遠離植物的莖生長在一個錐形的方式[10] 。 根系生長取決于環(huán)境因素的影響，比如引力和土壤的非均質(zhì)性。因此，兩個更多的變量被定義為描述植物適應 - 多么強大的根每平方厘米的增長方向的變化 - 一個更大的值表示更偏轉(zhuǎn)的根和更扭曲的根系統(tǒng) - 試驗的次數(shù)

37、，其根部，以找到最佳的角度α和β的旋轉(zhuǎn) 的向下運動 - N可以是任意實數(shù)。如果N = 1.5，如果，N可以是1或2的裝置。 圖3：不同的N值和σ的根系統(tǒng)之間的差異。（建模根據(jù)丹尼爾萊特納等人BOKU和代碼的修改，由倫敦帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 3.2.2 Lindenmayer系統(tǒng)和根系的生長模型 L-系統(tǒng)是一個平行的重寫系統(tǒng)，即一個正式的語法的一個變體，最有名的用于模擬植物發(fā)育過程中的生長，但也能夠模擬各種生物體的形態(tài)，由于兩個主要性能：遞歸和自相似性[11] 。植物模型和自然的有機形態(tài)很容易定義，如通過增加遞歸級別的形式慢慢“長大”，并變得更加復雜。 使

38、用L-系統(tǒng)，用于產(chǎn)生圖形圖像的要求，在模型中的符號是指在計算機屏幕上的圖的元素。解釋每不變的L-系統(tǒng)模型的龜命令。 3.2.3根系生長; 造型的IAA攝取的預測答案的問題，如： “什么是初生根的生長率是多少？” “什么是根系統(tǒng)一段時間后的樣子嗎？” “如何擬南芥不同IAA濃度？“ 我們修改一個MATLAB程序開發(fā)丹尼爾萊特納的研究小組[6]展示的3D根系統(tǒng)的基礎上的原則林登梅耶系統(tǒng)（龜?shù)拿睿?，并在根增長模型工具箱由丹尼爾萊特納等人從BOKU（Universitt獻給Bodenkultur維也納開發(fā)維也納的自然資源和生命科學大學）[12] 。 3.2.4數(shù)據(jù)擬合 我們采取

39、了從文獻的增長速度參數(shù)，我們的濕實驗室的原始數(shù)據(jù)，為我們的項目提供更準確，更合適的參數(shù)進行了分析。擬南芥植物種植和根的長度和數(shù)量的分支記錄每兩天從第0天到第9天。根長，每天根系生長速率和分支數(shù)量繪制了時間和IAA濃度。 3.3結(jié)果與討論 3.3.1根系統(tǒng)的可視化 從文獻中的值給外部IAA濃度之間的關系，和根的伸長為510 -5 mol / L的→200μm的伸長率在30分鐘內(nèi)。因此，生長速度的建模參數(shù)是9.6 * 10 -3 m /天。 我們觀察到真正的根的生長模式和修改我們的模擬，以提供更可靠，更準確的預測根的生長。擬南芥中有一個主根與零階和它厚比分行。擬南芥一般長到20-30厘米

40、的深度內(nèi)的土壤和分支只有一次。如下所示的3D畫面預測的根的生長具有不同伸長率（與IAA = 0.96厘米/天;未經(jīng)IAA = 0.46厘米/天[10] ）。它們可與一個真正的根系統(tǒng)的照片。 圖4：擬南芥根系統(tǒng)的3D visalisation。的曲線圖圖4（a）（b）表示不同IAA濃度作為我們的模擬結(jié)果中的生長時間為20天的條件下與的擬南芥根系統(tǒng)中示范。圖4（c）（d）是真正的擬南芥植物的文獻和我們的濕實驗室的實際照片。（建模根據(jù)丹尼爾萊特納等人BOKU和代碼的修改，由倫敦帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 （4）裝配 圖。1：大會戰(zhàn)略為我們的生長素隨心結(jié)構。（圖由倫敦帝國

41、學院2011年iGEM比賽的球隊）。 我們下令iaaM和IAAH作為兩個片段的編碼序列，以減少成本和時間（片段1，2，3和4）。我們不希望使用PCR擴增的片段，以避免引入到我們的最終構建的突變，因此我們將我們的MlyI限制性內(nèi)切酶的合成序列兩側(cè)的鈍的一端切點。說穿了，Mly1（II型限制性內(nèi)切酶）削減5個堿基的識別位點距離。此屬性允許我們只切出各片段的編碼序列。每一個消化的片段，然后凝膠提取準備組裝。 pSB1C3載體的骨架載體的同時反PCRd放大所需的重疊。 我們計劃相結(jié)合的四個片段到pSB1C3載體由吉布森裝配，不幸的是，我們的嘗試都失敗了，我們推測，這是由于骨架載體上的同源性，

42、使其重新退火。 我們恢復到CPEC組裝結(jié)構，一種方法，需要更廣泛地使用PCR比吉布森。這就是說，通過引入MlyI的酶切位點，我們的人數(shù)減少一半所需要的PCR步驟，從而減少了潛在的突變率。 循環(huán)聚合酶延伸克隆（CPEC）是一個獨立的引物PCR裝配技術，它依賴于各部分之間的重疊序列進行組裝。有了一個變性步驟中，雙鏈DNA的熔融，允許兼容的單鏈的兩端各部分加入。出于這個原因，它是必不可少的，該部件被設計為同源的端部（被設計我們所使用的片段用50 bp的重疊）。退火后的重疊端，然后作為引物，聚合酶延伸的部分加入到一個無縫的構造。 CPEC的第一次嘗試是成功的。DNA由E. 大腸桿菌 DH5α中菌

43、落的組裝構造轉(zhuǎn)化miniprepped并發(fā)送到歐陸用于測序。序列進行了驗證，所以我們進行特征IAA生產(chǎn)建設。 圖。2：組裝結(jié)構限制切割骨干前綴和后綴分別用EcoRI和PstI消化，使我們能夠確定如果插入是正確的大小。1巷包含1 KB +梯作為參考。泳道2，泳道3 PstI和第4泳道都用EcoRI消化。將得到的帶的大小是約4 kb的與組裝的四個片段的大小。（數(shù)據(jù)由倫敦帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 圖。3：甲最終生長素隨心構造示意圖。點擊每個部分被定向到零件注冊表的相關頁面。（圖由倫敦帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 三：基因衛(wèi)士 遏制是一個嚴重的問題，關于釋放

44、到環(huán)境中的轉(zhuǎn)基因生物（轉(zhuǎn)基因生物）。為了防止基因水平轉(zhuǎn)移的基因表達我們的底盤，我們已經(jīng)開發(fā)出一種系統(tǒng)的基礎上，編碼holin，反holin和溶素的基因。我們是工程的抗holin到我們的底盤，在那里它的作用作為抗毒素，和holin和細胞內(nèi)溶素的質(zhì)粒DNA上的基因組中。在與土壤細菌的水平基因轉(zhuǎn)移事件，holin和細胞內(nèi)溶素將不含抗holin轉(zhuǎn)移，使受體細胞非可行的和有效含有生長素Xpress和植物路線基因在我們的機箱的。 （1）概觀 對于人類實踐告訴我們項目的設計，我們決定拿出新的解決方案，以轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境釋放的風險降到最低。我們試圖想超越遏制“殺死開關”機制，并提出了這樣的問題：“什么最壞

45、的情況下，如果我們要釋放我們到野外的轉(zhuǎn)基因？“ 和“如何避免這些問題呢？”。 轉(zhuǎn)基因生物釋放的最棘手的后果之一是水平基因轉(zhuǎn)移的非天然質(zhì)粒DNA，以現(xiàn)有的土壤細菌，經(jīng)常發(fā)生的過程。 基因Guard是一種新的機制，以防止轉(zhuǎn)基因生物的遺傳物質(zhì)的交流，以防止自然發(fā)生的微生物基因的水平轉(zhuǎn)移，因此一個可行的解決方案。它將使用一個毒素/抗毒素系統(tǒng)，其中反holin被整合到基因組中，我們的機箱中，將防止holin上的質(zhì)粒編碼的內(nèi)溶素，以裂解細胞。然而，如果該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到任何其他細菌的物種，是不是我們改造細菌，它會引起細胞裂解，從而防止包含在我們的GMO的遺傳信息的傳播。 該模塊的組裝和測試的同時，我們嘗

46、試與土壤中的細菌，看到多久，他們保留了GFP表達E.獲得的熒光 通過水平基因轉(zhuǎn)移的大腸桿菌。 對于我們?nèi)祟悓嵺`的方法對轉(zhuǎn)基因釋放的更多信息 （2）產(chǎn)品規(guī)格 1。防止任何其他細胞，是不是我們自己的GMO非可行的水平基因轉(zhuǎn)移 水平基因轉(zhuǎn)移（圖1）是主要的問題，我們能想到的，當它來釋放轉(zhuǎn)基因生物在現(xiàn)場測試，后來在項目的實施階段。這是一個共同的問題，即使在轉(zhuǎn)基因作物，轉(zhuǎn)基因生物和自然生物之間的異花授粉是恒定的憂慮。在細菌中，基因通常轉(zhuǎn)移到其他物種通過共軛或通過從溶解的轉(zhuǎn)基因生物的遺傳物質(zhì)的攝取。由于遺傳物質(zhì)仍然可以采取其他物種的裂解后我們的轉(zhuǎn)基因生物，其中一個使用一個輸入誘導裂解是一個傳統(tǒng)的殺

47、開關不是一個可行的和安全的選項。因此，我們認為，設備必須是內(nèi)的遺傳物質(zhì)本身，而不是自然產(chǎn)生的細菌引起的反應。 展望殺死在過去已經(jīng)使用的開關，我們發(fā)現(xiàn)的T4 holin-溶素系統(tǒng)。如果我們要添加這些基因的質(zhì)粒，我們可能引起的任何有機體，我們已經(jīng)采取了質(zhì)粒的直接裂解。 圖1。水平基因轉(zhuǎn)移（格雷斯金，2006年[1] ） 2。該模塊必須不受到傷害的我們自己的轉(zhuǎn)基因 T4噬菌體必須能夠延緩其主機之前，它是可以復制和裝配的許多副本本身的裂解。為了做到這一點也有T4噬菌體的蛋白質(zhì)稱為抗holin結(jié)合從而防止細胞裂解的holin。本質(zhì)上，該系統(tǒng)的工作原理作為定時器給噬菌體足夠的時間來復制。

48、 通過使用反holin的從這個系統(tǒng)中，我們可以防止我們自己的細胞裂解。然而，我們不能有它的質(zhì)粒否則仍可能有兩個質(zhì)粒的有機體的可能性。因此，我們必須錨定的基因組內(nèi)。為了做到這一點，我們需要用CRIM質(zhì)粒。CRIM（復制的條件，整合和模塊化）質(zhì)?？梢约稍趩我坏母北镜交蚪M的E. 大腸桿菌。 3。表達的設備不會有太大的代謝負擔 由于我們的最終系統(tǒng)將使用植物路線和生長素隨心模塊的，我們必須考慮，修改后的細菌就已經(jīng)是下一個巨大的代謝負擔。因此，使用必要的最低限度的資源基因警衛(wèi)促進趨化對蘋果酸和IAA生產(chǎn)由我們的系統(tǒng)將是有益的。 4。必須能夠來測試系統(tǒng)是否 要做到這一點，我們必須使用報告基因。

49、最常見的報告基因的熒光蛋白RFP和GFP等。由于質(zhì)粒CRIM，已經(jīng)有sfGFP，我們將使用，測試表達反holin。為了測試是否該質(zhì)粒是功能，我們將結(jié)合RFP到質(zhì)粒。我們希望能夠看到一個天然的細菌質(zhì)粒熒光紅色寬視場顯微鏡前裂解。 （3）設計 目標是確保制定的規(guī)格，被認為是基因衛(wèi)隊的設計。 1。防止任何其他細胞，是不是我們自己的GMO非可行的水平基因轉(zhuǎn)移 T4細胞內(nèi)溶素和T4 holin的是反PCRd從BBa_K112808。然而，我們必須確保接收這些基因的細胞裂解。為了確定所使用的啟動，我們模擬整個系統(tǒng)。既然有這么多的holin和溶素（高拷貝質(zhì)粒）等少數(shù)幾個副本的holin基因（基因組）

50、的副本，我們決定J23103子相對于J23100子，我們可以選擇正確的強度。但是，我們也有這個弱的啟動子型號是否有足夠的接收質(zhì)粒的細胞裂解。根據(jù)我們的模型，任何接收我們的holin的和溶素基因的細胞裂解。 2。該模塊必須不受到傷害的我們自己的轉(zhuǎn)基因 此模塊主要依賴于模型在設計過程中。我們必須考慮到一個事實，即質(zhì)粒的拷貝數(shù)和基因組中的拷貝數(shù)是可變的設計時，毒素和抗毒素成分。我們發(fā)現(xiàn)，該啟動子的holin-細胞內(nèi)溶素的質(zhì)粒具有弱于的holin構建體中的基因組是有效的是40-400倍。該比率應采取考慮到的基因的拷貝數(shù)之間的可變性，并確保不存在的至少一個為每一個反holin分子產(chǎn)生holin分子。

51、 可以肯定的是，我們修改后的細菌會存活holin的和溶素的生產(chǎn)，我們選擇了J23103的啟動子具有一定的實力在低端的啟動子強度范圍。這提供了以下兩種結(jié)構的設計： 3。表達的設備不會有太大的代謝負擔 雖然這個規(guī)范是非常重要的，它沒有在這個版本的模塊的設計中發(fā)揮了巨大的作用。這是因為，就目前而言，生長素是一種概念證明系統(tǒng)。一旦它已經(jīng)表明，基因Guard是一個可行的遏制方法，我們將修改的構造，以實現(xiàn)具有抗holin滅活holin，而不是對細胞是一個很大的負擔之間的理想平衡。 4。能夠測試系統(tǒng)的工作原理 為了做到這一點，我們決定附加RFP作為holin根據(jù)相同的啟動子和細胞內(nèi)溶素的基因的編碼

52、序列。這將使我們能夠輕松，直觀的測試細胞是否包含我們的質(zhì)粒。至于holin構建體，CRIM質(zhì)粒已經(jīng)包含一個sfGFP的序列。 將能夠區(qū)分我們完成的構建從每一個其他的細胞，由于其卡那霉素和氨芐青霉素抗性，以及其生產(chǎn)的RFP和sfGFP。因此，我們將能夠看到我們的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到一個單元格不發(fā)出綠色熒光，應該是能夠跟蹤是否溶解或下寬視場顯微鏡。 （4）模型 1）簡介 基因防護裝置包括三種蛋白質(zhì)： 1。 Holin是一種蛋白質(zhì)，形成孔隙的配合物在細菌內(nèi)膜和這些孔允許細胞內(nèi)溶素進入的周質(zhì)空間。 2 溶素是一種酶，能分解細胞壁和誘導細胞裂解。 3。 反holin結(jié)合holin并阻止它的形成毛孔。

53、 我們的系統(tǒng)將holin和細胞內(nèi)溶素的基因一起的草本-路由和生長素隨心基因的質(zhì)粒上，和反holin基因的強啟動子的控制下的基因組上。該生產(chǎn)的抗holin的會阻止細胞裂解的轉(zhuǎn)基因（GM）細菌通過停用holin。如果該質(zhì)粒不含抗holin它的基因組（例如任何野生型土壤細菌）轉(zhuǎn)移到一個不同的細菌，holin和細胞內(nèi)溶素的表達誘導細胞裂解。這將防止擴散的生長素載體，含有植物的路線和生長素隨心基因，自然產(chǎn)生的土壤細菌。 2）目標 此設備的成功的關鍵是正確的比例，這樣的反holin的，可以關閉所有holin，我們修改后的細菌中產(chǎn)生的，并holin的表達水平野生型細菌的holin和反holin的生產(chǎn)是

54、高到足以誘導細胞溶解?？刂苹虮磉_的啟動子強度和核糖體結(jié)合位點（RBS）的實力，造型的基因警衛(wèi)，重要的是要幫助我們選擇適當強度的一個子和蘇格蘭皇家銀行的。 3）說明 基因衛(wèi)兵的建模由兩部分組成，一個是在野生型細菌的holin生產(chǎn)和其他抗holin holin的失活在我們的改性的細菌。因為在我們的系統(tǒng)中的所有的基因組成型表達，我們只考慮穩(wěn)定狀態(tài)。 在野生型土壤細菌的Holin生產(chǎn) 導出一個單一的質(zhì)粒的啟動子強度之間的關系，和RBS強度holin集中在這部分的造型。為了模擬這種情況，作如下假設： 1）基因衛(wèi)隊包含在一個pSB1C3質(zhì)粒含有pUC19中衍生的促進pMB1復制起點（100-3

55、00分子每單元）[5] 。在細菌中的質(zhì)粒的數(shù)量范圍從100到300每個細胞。為了確保子和蘇格蘭皇家銀行是足夠強大的的holin /溶素是有效的，我們低估了質(zhì)粒的土壤細菌為50，盡管他們總是至少有100。因此，我們的系統(tǒng)時，應該工作的質(zhì)粒在土壤細菌的數(shù)目是大于50。 2）該文獻表明，發(fā)生細胞溶解在holin等于1000個分子/細胞的濃度[1]，[5]，[6] ，因此，我們用這樣的細胞裂解在我們的系統(tǒng)中的閾值濃度。 3）由于所使用的結(jié)構表征Pveg子去年包含一個突變中，我們假設， 我們用于抗holin的啟動，Pveg2具有相同的強度，Pveg。 基于這些假設，野生型細菌細胞裂解的動力學模型，

56、用普通的微分方程（ODEs）的holin表達和holin的蛋白質(zhì)（公式1）。在穩(wěn)定狀態(tài)（即 [表達holin ] / DT = 0和d [holin] / DT = 0），重新整理式（1）[holin] = 1000，我們獲得了表達在所示為P holin K表holin的公式2。 Holin抑制基因細菌 在我們的細菌的基因組上的強度的啟動子和RBS控制表達的反holin應該高于與holin一個單一的質(zhì)粒，例如，300的質(zhì)粒的拷貝（最大拷貝數(shù)在一個單一的細菌所產(chǎn)生的所有的holin ）可以被抑制。在我們的系統(tǒng)中，抗-holin到holin結(jié)合形成二聚體，它被定義為失活的holin。由式（

57、3）的機制，我們修改后的細菌。我們定義的啟動子和RBS強度的比率分別為抗-holin和holin為“m”，如公式4中看到。 4）結(jié)果與討論 通過改變比m的公式4中，我們發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因細菌holin濃度下降至零比米≥300（參見圖1）。然后，我們測試了米= 400與反holin啟動子（J23100），我們有與強度13.1皮克核糖核酸/分鐘/μg的底物DNA，其結(jié)果是顯 ??示在圖2中。 圖1：在轉(zhuǎn)基因細菌holin濃度與比m（米=（P 的抗holin ? 抗holin）/（P holin ? holin））。本圖顯示了細胞內(nèi)的濃度holin保持在零，如果m> 300。（模型由英國倫敦帝國學院2011年iGEM比賽的球隊）。 圖2：在m = 400的不同蛋白物種隨時間的演變。所有的holin蛋白在轉(zhuǎn)基因細胞的抑制的holin濃度保持在所有的時間，而holin野生型細菌的濃度達到1000每單元后5000秒的模型由倫敦帝國學院2011年iGEM比賽的球隊。 總之，基因后衛(wèi)的造型告訴他們，啟動子的強度和RBS holin和反holin的強度可任意選擇，只要他們的比率（即 P的反holin K表抗holin）/（holin K表holin的） > 300），以使其一定，的比例值400被選擇為我們的項目。