臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 芍藥苷通過調(diào)節(jié)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞VE-Cadherin保護(hù)膿毒癥心肌的作用及機制研究

《臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 芍藥苷通過調(diào)節(jié)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞VE-Cadherin保護(hù)膿毒癥心肌的作用及機制研究》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 芍藥苷通過調(diào)節(jié)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞VE-Cadherin保護(hù)膿毒癥心肌的作用及機制研究（10頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、一. 材料與方法 10.基因測序 為了分析LPS感染過程中，芍藥苷對心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RCMECs）基因表達(dá)的影響，我們將處理后的細(xì)胞進(jìn)行了基因測序（RNA-seq）。將細(xì)胞分為實驗組（40uM芍藥苷預(yù)處理4h+LPS組）和對照組（LPS處理組），每組3個生物學(xué)重復(fù)。對兩組數(shù)據(jù)依次進(jìn)行了數(shù)據(jù)質(zhì)量評估、樣本相關(guān)性分析、對比參考基因組、表達(dá)定量、差異基因表達(dá)、差異基因功能分析、差異基因信號通路分析等。 在數(shù)據(jù)品質(zhì)的評價方面，本試驗從測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)、單堿基序列質(zhì)量、序列GC含量及序列長度分布情況等方面對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。相關(guān)性分析是考察變量與其他變量相關(guān)性的一種方法，通過多元統(tǒng)計分析相關(guān)變量

2、是否以某種特定的方式聚集到一起。本試驗中通過計算樣本之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson Correlation Coefficient）來分析樣本間的相關(guān)程度，利用樣本相關(guān)性圖可視化相關(guān)性系數(shù)矩陣來展示樣本相關(guān)性。 按照美國Illumina生物技術(shù)公司RNA-seq樣本制備試劑盒（mRNA-Seq sample preparation kit）說明構(gòu)建cDNA文庫。對照大鼠的基因組信息和完整的轉(zhuǎn)錄組的信息，將測序出的序列（reads）比對到參考基因組上，進(jìn)而對基因或轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋和定量。利用DESeq2對兩組進(jìn)行比較，得到顯著性P值，padjust值（P值校正后的數(shù)值）和基因間的差異倍數(shù)（

3、Fold-change）；將兩個處理組進(jìn)行比較，選取p-value（P值）<0.05且表達(dá)量差異倍數(shù)在1.2倍以上及0.83333倍數(shù)以下的定義為差異表達(dá)基因。其中差異倍數(shù)大于1.2且p-value<0.05的為上調(diào)基因，差異倍數(shù)小于0.83333并且p-value<0.05的為下調(diào)基因。利用Ballgown對兩組進(jìn)行比較，得到顯著性P值，Q值（多重假設(shè)檢驗校正后的P值）和轉(zhuǎn)錄本間的差異倍數(shù)。本分析中將兩組進(jìn)行比較，進(jìn)行差異轉(zhuǎn)錄本篩選，選取p-value<0.05和差異倍數(shù)大于1.2倍及小于0.83333倍定義為差異轉(zhuǎn)錄本。其中差異倍數(shù)大于1.2并且p-value<0.05的為上調(diào)轉(zhuǎn)錄本，差異

4、倍數(shù)小于0.83333并且p-value<0.05的為下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。 Gene Ontology數(shù)據(jù)庫（GO數(shù)據(jù)庫）是基因本體學(xué)數(shù)據(jù)庫的簡稱，該庫采用分層的方式對基因及其編碼的蛋白功能進(jìn)行系統(tǒng)闡述。Go分析是建議在該數(shù)據(jù)庫的分析，并將基因功能分為：分子功能（molecular function）、生物學(xué)過程（biological process）和細(xì)胞成分（cellular component）三個類別。KEGG（kyoto encyclopedia genes and genomes）數(shù)據(jù)庫是系統(tǒng)分析基因功能、基因產(chǎn)物功能及相互關(guān)系等的數(shù)據(jù)庫，Pathway分析基于KEGG數(shù)據(jù)庫，針對差異基

5、因使用Fisher精確檢驗及卡方檢驗，將目的基因涉及的Pathway進(jìn)行分析，依據(jù)P<0.05選出顯著性的Pathway。 二.結(jié) 果 （八）基因測序結(jié)果 1.兩組樣本基因相關(guān)性分析結(jié)果 我們對基因的表達(dá)量進(jìn)行樣本相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩組之間的基因相關(guān)值在0.99和1附近，證明兩組基因相關(guān)性極高（詳見復(fù)圖7）。 注：L-LPS，S-芍藥苷+LPS；顏色表示相關(guān)程度，顏色越藍(lán)，說明樣本的相關(guān)度越大。 附圖7 兩組樣本基因相關(guān)性分析圖 2.RNA-seq測序聚類分析結(jié)果 我們采取RNA-seq高通量測序技術(shù)對不同處理組（40uM芍藥苷預(yù)處理+LPS組LPS處理組）的RCMECs進(jìn)

6、行分析。測序結(jié)果聚類圖中顯示不同處理組能夠完整分開，兩者對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異較大（詳見附圖8）。 注：L-LPS組，S-芍藥苷+LPS組；橫坐標(biāo)-不同處理組的樣本，縱坐標(biāo)-差異轉(zhuǎn)基因；紅色-差異基因表達(dá)值高，綠色-差異基因表達(dá)值低。 附圖8 RNA -Seq測序的聚類分析圖。 3.兩組樣本差異性基因的篩選結(jié)果 比較得到836個差異基因，其中上調(diào)基因共有137個，下調(diào)基因共有699個。由于差異基因大部分為下調(diào)基因，所以后續(xù)我們主要分析下調(diào)表達(dá)的基因（詳見附圖9）。 注：綠點—下調(diào)基因，紅點—上調(diào)基因，灰點—非顯著性差異的基因。 附圖9 兩組差異基因火山圖 4.差異基因顯著富

7、集的GO 分析 按照功能將細(xì)胞內(nèi)基因分為分子功能（molecular function）、細(xì)胞成分（cellular component）和生物學(xué)過程（biological process）三個類別。因基因較多，故表中僅羅列了部分差異基因（按照-LgP排序最大的各類前20項）。通過分析發(fā)現(xiàn)顯著性差異基因功能主要分布情況為：①分子功能模塊：腫瘤壞死因子受體及其超家族結(jié)合，以及泛素化過程中的酶活性蛋白質(zhì)等，如tumor necrosis factor receptor superfamily binding。②細(xì)胞組分模塊：染色體區(qū)域的改變，細(xì)胞器膜的改變等，如chromosome, centr

8、omeric region。③生物學(xué)過程模塊：主要涉及一些炎癥相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)、信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)等，如regulation of MAP kinase activity（詳見表1-表3）。 表1 兩組RCMECs差異基因的分子功能（Molecular Function） goDescription geneRatio pvalue nucleic acid binding 203/615 3.668E-11 RNA binding 108/615 1.188E-09 carbohydrate derivative binding 122/615 6.267

9、E-08 ubiquitin-protein transferase activity 36/615 4.031E-06 ubiquitin-like protein transferase activity 37/615 4.077E-06 anion binding 134/615 4.55E-05 single-stranded RNA binding 9/615 0.002972 single-stranded DNA binding 10/615 0.0058649 tumor necrosis factor receptor superfamily

10、binding 6/615 0.0059601 enzyme binding 102/615 0.0088383 CXCR3 chemokine receptor binding 2/615 0.0126755 transcription regulator activity 66/615 0.0144157 rRNA binding 7/615 0.0157383 transcription factor binding 31/615 0.0243678 repressing transcription factor binding 6/615 0.0

11、248193 tumor necrosis factor receptor binding 4/615 0.0324218 open form four-way junction DNA binding 1/615 0.0369814 crossed form four-way junction DNA binding 1/615 0.0369814 interleukin-33 binding 1/615 0.0369814 interleukin-13 receptor activity 1/615 0.0369814 表2 兩組RCMECs差異基因細(xì)胞

12、組分（Cellular Component） goDescription geneRatio pvalue intracellular organelle lumen 205/672 4.359E-10 membrane-enclosed lumen 205/672 4.907E-10 non-membrane-bounded organelle 195/672 3.077E-07 intracellular non-membrane-bounded organelle 195/672 3.077E-07 chromosome 61/672 2.066E-0

13、5 nuclear body 46/672 3.613E-05 sex chromosome 8/672 5.906E-05 nucleoplasm part 62/672 7.502E-05 chromosomal part 55/672 7.513E-05 transferase complex 50/672 8.196E-05 chromosome, centromeric region 17/672 0.0001268 condensed nuclear chromosome, centromeric region 6/672 0.000235

14、6 chromosome, telomeric region 15/672 0.0002759 cytosol 154/672 0.0002942 host intracellular organelle 3/672 0.0004687 host intracellular membrane-bounded organelle 3/672 0.0004687 condensed chromosome 17/672 0.0004944 endomembrane system 151/672 0.0122119 tumor necrosis factor re

15、ceptor superfamily complex 1/672 0.0367816 protein phosphatase type 1 complex 2/672 0.0499800 表3 兩組RCMECs差異基因的生物學(xué)過程（biological process） goDescription geneRatio pvalue regulation of interferon-beta production 5/658 0.0057735 regulation of monocyte chemotaxis 4/658 0.0060998 regulati

16、on of intracellular signal transduction 80/658 0.0073309 regulation of leukocyte chemotaxis 9/658 0.0080840 regulation of interleukin-12 production 5/658 0.0086150 regulation of MAP kinase activity 17/658 0.0086854 regulation of intracellular signal transduction 50/658 0.0088540 regul

17、ation of tumor necrosis factor production 8/658 0.0092821 regulation of tumor necrosis factor superfamily cytokine production 8/658 0.0099956 regulation of response to external stimulus 19/658 0.0105641 regulation of stress-activated MAPK cascade 12/658 0.0107008 regulation of interleuki

18、n-6 production 8/658 0.0107490 regulation of inflammatory response 9/658 0.0238767 regulation of dendritic cell cytokine production 2/658 0.0265304 regulation of interleukin-12 biosynthetic process 2/658 0.0265304 I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling 16/658 0.0281508 cellular response

19、to cytokine stimulus 40/658 0.0307542 response to cytokine 45/658 0.0422526 interleukin-12 biosynthetic process 2/658 0.0432579 cytokine-mediated signaling pathway 21/658 0.0488657 5.差異表達(dá)基因的信號通路顯著性富集分析： 差異表達(dá)基因的通路富集分析基于KEGG數(shù)據(jù)庫，把基因及表達(dá)信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。我們對差異基因利用Fisher精確檢驗和卡方檢驗，把目標(biāo)基因參與的Pathw

20、ay進(jìn)行顯著性分析，依照p value<0.05標(biāo)準(zhǔn)篩選，羅列出-LgP排序最大前10項，結(jié)果顯示下調(diào)基因明顯富集于炎癥相關(guān)的信號通路，如toll樣受體信號通路、自然殺傷細(xì)胞細(xì)胞毒活性調(diào)節(jié)通路等，及與多種惡性腫瘤的調(diào)節(jié)有關(guān)（詳見表4）。 表4 兩組RCMECs細(xì)胞有差異的信號通路（passway） pathDescription geneRatio pvalue Herpes simplex virus 1 infection 25/292 0.002565481 Hepatitis B 12/292 0.00670556 Proteoglycans in cancer

21、 14/292 0.008350082 Chagas disease (American trypanosomiasis) 8/292 0.027690321 Gastric cancer 10/292 0.027974197 Human immunodeficiency virus 1 infection 14/292 0.030720746 Pathways in cancer 26/292 0.033211429 Toll-like receptor signaling pathway 7/292 0.037505078 Natural killer c

22、ell mediated cytotoxicity 7/292 0.045285874 Chronic myeloid leukemia 6/292 0.046161062 通過分析下調(diào)倍數(shù)、差異顯著性，以及查詢各基因的功能，我們發(fā)現(xiàn)明顯下調(diào)的基因中有一些與炎癥反應(yīng)顯著相關(guān)的基因，如Tlr4、Il1rl1、Hmgb1、Akt3、Ppp4r3b等（詳見表5）。其中，Tlr4、Hmgb1與膿毒癥的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，是近年來膿毒癥證領(lǐng)域研究的重點基因。其中TLR4、HMGB1和Il1rl1基因編碼的蛋白在膿毒癥中的重要作用已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。 表5 與炎癥反應(yīng)及膿毒癥顯著相關(guān)的下

23、調(diào)的基因 Gene_ID Gene_Symbol log2FoldChange pvalue padj style ENSRNOG00000003712 Ppp4r3b -1.00506 0.049443 0.999686 down ENSRNOG00000007283 Erlec1 -0.59217 0.041586 0.981412 down ENSRNOG00000010522 Tlr4 -0.63731 0.00084 0.257265 down ENSRNOG00000014835 Il1rl1 -0.36946 0.00768

24、1 0.613764 down ENSRNOG00000021497 Akt3 -0.31728 0.041938 0.981415 down ENSRNOG00000058202 Ppp2r2c -2.13028 0.046109 0.992841 down ENSRNOG00000058908 Hmgb1 -0.88728 0.012234 0.703824 down ENSRNOG00000059016 Tspan12 -0.69446 0.005311 0.555121 down 三.分析與討論部分 2.基因測序結(jié)果提示多個基

25、因及信號通路發(fā)生變化 2.1芍藥苷保護(hù)膿毒癥心肌作用涉及多個基因和通路 通過分析我們發(fā)現(xiàn)在顯著下調(diào)的基因中有一些基因與炎癥反應(yīng)及膿毒癥密切相關(guān)，分別是TLR4、HMGB1和Il1rl1。 TLR4編碼的蛋白可識別革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS），形成受體-配體復(fù)合物后，誘導(dǎo) TLRs的TIR 二聚化或者原有二聚結(jié)構(gòu)改變，通過接頭蛋白 TIRAP 招募活化MyD88。MyD88被激活后，招募信號分子白介素-1受體相關(guān)激酶-4（IRAK-4），進(jìn)而激活I(lǐng)RAK-1，之后活化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（TRAF-6），活化的TRAF-6 促進(jìn) IκB 激酶（IKK）的泛素化降解并激活TGF-β

26、激酶（TAK-1）。激活的TAK-1促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子IKK-α、IKK-β、NF-κB 的表達(dá)。TAK-1 同時還可激活絲裂原蛋白激酶（MAPK）途徑，進(jìn)而活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1。NF-κB和AP-1可誘導(dǎo)多種促炎癥因子mRNA轉(zhuǎn)錄，如 IL-1、TNF-α、IL-6等，TLR4的過度激活會引發(fā)炎癥因子的大量、失控性釋放，是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生的關(guān)鍵因素。 HMGB1編碼的蛋白被認(rèn)為是晚期炎癥因子和炎癥伴侶分子，當(dāng)細(xì)胞受到損傷，特別是發(fā)生壞死時，能夠被大量的釋放，胞外的HMGB1蛋白一方面能夠作為趨化因子招募免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。另一方面HMGB1作為伴侶分子能夠與其他的 PAMPs以及細(xì)胞因子形成

27、復(fù)合體增加炎癥因子的產(chǎn)生。它能夠通過脂質(zhì)A區(qū)域與LPS 結(jié)合，催化LPS從細(xì)胞膜上解離，將其轉(zhuǎn)運至游離的或者與膜結(jié)合的 CD14分子。實驗證明，分別用 LPS、LPS+HMGB1復(fù)合體刺激單核細(xì)胞，LPS+HMGB1復(fù)合體刺激組的單核細(xì)胞會分泌更多的炎性因子TNF-α。 IL1RL1基因編碼的蛋白質(zhì)稱為白介素-1受體樣1，也稱為ST2。ST2蛋白具有兩個種型，分別為可溶性ST2和膜結(jié)合受體形式的ST2，參與心肌病發(fā)生和進(jìn)展。ST2的配體是細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-33（IL-33），IL-33與膜結(jié)合受體形式的ST2受體結(jié)合后才可以發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，主要通過激活MAPK信號通路誘導(dǎo)Th2類細(xì)胞因子如

28、 IL-4、IL-5 和 IL-13 的釋放，參與 Th2 型免疫反應(yīng)[]，具有直接保護(hù)心肌的作用。然而可溶性ST2也可與IL-33結(jié)合，但無生物學(xué)效應(yīng)，對膜結(jié)合受體形式的ST2受體起到了拮抗作用。當(dāng)心肌病心肌被拉伸時，IL1RL1基因表達(dá)上調(diào)，增加了循環(huán)可溶性ST2的濃度，結(jié)果，在高水平的可溶性ST2狀況下，膜結(jié)合受體形式的ST2受體的心肌保護(hù)作用被抵消，使得心肌承受更大的壓力，故而IL-33/ ST2通路對心肌的作用具有多重性。 基因測序的結(jié)果提示芍藥苷可能通過抑制以下幾種炎癥因子及炎癥通路改善LPS誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)的作用：1.芍藥苷可以直接抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)

29、胞因子TNF-α、IL-1β以及IL-10的產(chǎn)生分泌，減輕心臟炎癥損傷；2.芍藥苷可通過抑制MAPK/NF-κB通路，減少IL-6和TNF-α等促炎因子的產(chǎn)生； 3.芍藥苷通過抑制LPS/NF-κB通路減少巨噬細(xì)胞的M1極化，同時提高IL-4水平促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，從而在減輕M1細(xì)胞的促炎作用的同時增強了M2細(xì)胞的抗炎作用。這表明芍藥苷對膿毒血癥心肌損傷的保護(hù)涉及多條通路，這些與炎癥相關(guān)的信號通路通過激活或者抑制，共同發(fā)揮了抑制炎癥作用，下調(diào)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。 2.2 芍藥苷保護(hù)膿毒癥心肌作用未通過Rho家族基因的變化 細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)的纖維狀蛋白絲，維持細(xì)

30、胞形態(tài)、完成細(xì)胞運動、信息傳遞等。細(xì)胞骨架是由蛋白纖維交織而構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與外側(cè)胞膜和內(nèi)側(cè)核膜存在聯(lián)系，從而保持細(xì)胞形狀，參與細(xì)胞運動。內(nèi)皮細(xì)胞骨架是由肌動蛋白微絲、微管和中間絲組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，這些微絲結(jié)合在一起共同調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞之間的形狀變化和信號傳遞[53]。內(nèi)皮又主要包括單層內(nèi)皮細(xì)胞和基膜，是具有屏障功能的半通透膜，內(nèi)毒素可通過直接或間接形式激活或損傷內(nèi)皮細(xì)胞，造成其功能變化。 Rac1是Rho GTP家族中一員，是真核細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白分子，參加基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期的調(diào)控以及細(xì)胞骨架的構(gòu)建等多種生物功能，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮屏障功能方面發(fā)揮著重要作用。許多細(xì)胞因子可激活Rac1，

31、表明Rac1蛋白在多器官功能衰竭所引起的血管內(nèi)皮屏障功能障礙中起著關(guān)鍵作用。注射活化的Rac1蛋白分子到成纖維細(xì)胞中造成細(xì)胞出現(xiàn)膜突起、片狀偽足和應(yīng)力纖維形成，但在注射前注射抑制型Rac1即可使上述反應(yīng)消失[54]，說明Rac1蛋白活性對于細(xì)胞形態(tài)和骨架的改變十分重要。 在RNA-seq測序分析中發(fā)現(xiàn)，無論從基因水平還是從轉(zhuǎn)錄本水平，亦或是芍藥苷組和LPS組的差異基因或轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平Rac1基因都不存在顯著性差異，本次細(xì)胞實驗部分也未發(fā)現(xiàn)芍藥苷對Rac1的表達(dá)有明顯調(diào)節(jié)作用，所以我們推測芍藥苷改善LPS誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用并不直接通過Rac1基因即Rho基因家族起作用。本人所在

32、研究團隊前期研究中曾發(fā)現(xiàn)Rac1參與LPS誘導(dǎo)的心肌損傷過程，改變細(xì)胞骨架，增加細(xì)胞通透性，但對于芍藥苷對心肌的保護(hù)作用是否涉及Rho基因家族的改變，我們還需要進(jìn)一步完善的體外試驗進(jìn)行驗證。 IL-33與心肌損傷 白介素-33（Interleukin-33，IL-33)屬于IL-1大家族，所以基因與其它家族成員，如IL-18和IL-1β有很多相同之處。在正常情況下IL-33存在于細(xì)胞核內(nèi)，是一種染色質(zhì)相關(guān)核因子[9, 10]；組織細(xì)胞受損時可分泌至胞外[11]。與IL-1β和 IL-18的成熟依賴于caspase1 不同，IL-33被 caspase1 切割后會失活；而全長的 IL-

33、33具有生物學(xué)活性[12]。因此，IL-33 與 IL-1β 會在不同的情況下發(fā)揮作用，它們的生物學(xué)功能也有很大差別。IL-33 與存在于細(xì)胞膜上的受體 ST2 結(jié)合，導(dǎo)致 MAPK和 NF-κB 信號通路的激活，主要誘導(dǎo) Th2 類細(xì)胞因子如 IL-4、IL-5 和 IL-13 的釋放，參與 Th2 型免疫反應(yīng)[13,14]，具有直接保護(hù)心肌的作用。IL-33能夠顯著改善由血清苯腎上腺素和血管緊張素Ⅱ增高引發(fā)的心肌肥大[15]，也可以保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[16]。在膿毒癥發(fā)生時，血清 IL-33 濃度會上升[17]。IL-33 可以調(diào)節(jié)全身性的炎癥反應(yīng)，降低血清中的 IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ，減輕器官的損傷[18]；IL-33使炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)向 Th2，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 M2極化[19]，并通過增強中性粒細(xì)胞的趨化作用，增強對病原微生物的清除能力[20]。IL-33對膿毒癥炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，提示其可能通過對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)參與了膿毒癥心肌保護(hù)。