臨床醫(yī)學(xué)專業(yè) 深低溫凍存肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸質(zhì)量控制研究

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1、深低溫凍存肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸質(zhì)量控制研究 [摘要] 目的 探索上海東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫低溫凍存0～10年肝細(xì)胞癌樣本的核糖核酸的質(zhì)量。方法 隨機(jī)抽取2008年至2017年間庫存手術(shù)切除肝細(xì)胞癌標(biāo)本30份。1％瓊脂糖凝膠電泳和RIN值評(píng)估法檢測(cè)RNA完整性。 結(jié)果 將組織標(biāo)本按凍存年限分成4組(<2年、3～5年、6～8年和>9年)，各組間的RNA濃度無顯著性差異(P>0.05)，各組之間A260/A280差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四組之間的RIN值檢測(cè)顯示，凍存5年以上組的RIN值有明顯下降(P<0.05)。 結(jié)論 長(zhǎng)期低溫時(shí)間超過5年后的肝細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)本RN

2、A存在嚴(yán)重的降解。 [關(guān)鍵詞] 生物樣本；肝細(xì)胞癌；低溫保存；核糖核酸；質(zhì)量控制； 前言 腫瘤分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究對(duì)高質(zhì)量新鮮腫瘤標(biāo)本的需求日益增長(zhǎng)，生物樣本庫建設(shè)是后基因組時(shí)代的重要課題。全球范圍內(nèi)各研究機(jī)構(gòu)建立有較為完善的腫瘤生物標(biāo)本庫(1-5)，不僅為腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究提供重要的標(biāo)本，并在核酸與蛋白質(zhì)的提取、分析和建立腫瘤細(xì)胞系方面取得成果(6-8)。上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫自2008年起開展肝癌生物樣本庫建設(shè)，在闡明肝癌發(fā)生的分子機(jī)制上提供了大量有價(jià)值的生物樣本(9-15)。目前，有較大比例生物樣本保存時(shí)間已經(jīng)長(zhǎng)達(dá)10年之久。為分析長(zhǎng)期冷凍保存腫瘤樣本是否

3、適合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，本文探討了低溫樣本庫的儲(chǔ)存年限與核糖核酸的分子完整性關(guān)系，以期為高質(zhì)量生物樣本庫建設(shè)以及腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供參考。 1 材料與方法 1.1 肝細(xì)胞癌樣本 隨機(jī)抽取上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫中2008年至2017年間庫存手術(shù)切除肝細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)本30份。所有樣本均為我院肝癌外科資深醫(yī)師行肝癌根治術(shù)切取的肝癌標(biāo)本，標(biāo)本離體后30min內(nèi)取材、分裝在低溫凍存管后投于液氮內(nèi)，然后轉(zhuǎn)入-80℃深低溫冰箱保存。低溫凍存時(shí)間在0至10年不等。樣本編號(hào)T代表肝細(xì)胞癌組織。所有患者術(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本編號(hào)與儲(chǔ)存時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表1。 表1：標(biāo)本編號(hào)與低溫儲(chǔ)存時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系

4、 儲(chǔ)存年份 組織樣本 儲(chǔ)存時(shí)間 (年） T(腫瘤組織) 2008 08-1T﹑08-2T﹑08-3T 10 2009 09-1T﹑09-2T﹑09-3T 9 2010 10-1T﹑10-2T﹑10-3T 8 2011 11-1T﹑11-2T﹑11-3T 7 2012 12-1T﹑12-2T﹑12-3T 7 2013 13-1T﹑13-2T﹑13-3T 5 2014 14-1T﹑14-2T﹑14-3T 4 2015 15-1T﹑15-2T﹑15-3T 3 2016 16-1T﹑16-2T﹑16-3T 2 2017 17-1T﹑

5、17-2T﹑17-3T 1 1.2 樣本中腫瘤細(xì)胞含量評(píng)估 上海市東方肝膽外科醫(yī)院肝癌樣本庫所有組織均同時(shí)留存一份于10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋后制備組織切片，由本院擁有5年以上經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行腫瘤組織學(xué)分類以及腫瘤細(xì)胞含量評(píng)估，本研究所有樣本的腫瘤細(xì)胞含量均大于60％。 1.3 核糖核酸抽提與質(zhì)控 RNA抽提采用Trizol(寶生,大連,中國(guó))抽提法。分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值，1％瓊脂糖凝膠電泳測(cè)量28S和18S核糖體RNA條帶。RNA上樣量為4ul，電泳時(shí)間30min，于凝膠圖像分析儀觀察電泳條帶；Agilent2100生物分析儀測(cè)量RNA完整數(shù)值(RNA

6、integrity number，RIN)。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。RNA的濃度、A260/A280比值、RIN值采用單向ANOVA檢驗(yàn)。組間構(gòu)成比采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1長(zhǎng)期低溫時(shí)間對(duì)樣本抽提RNA濃度影響 首先采用檢測(cè)了不同低溫保存年限的RNA濃度(ng/μL)。將組織標(biāo)本按照低溫凍存年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年和>9年，四組肝癌組織的RNA濃度分別為724.4 50.9﹑691.4 42.5﹑717.5 35.6﹑和618.5 34.5，各組之間RNA濃度沒有顯著性差

7、異(圖1，F(xiàn)=1.111，P=0.363)?？梢?，長(zhǎng)期低溫凍存對(duì)腫瘤組織樣本RNA濃度無影響。 2.2長(zhǎng)期低溫時(shí)間對(duì)樣本抽提A260/A280影響 將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，統(tǒng)計(jì)分析了四組間A260/A280差異，四組腫瘤的A260/A280比值分別為1.910.05﹑1.90 0.04﹑1.90 0.03﹑和1.93 0.04187,各組之間沒有顯著性差異(圖2，F(xiàn)=0.143，P=0.933)。可見，長(zhǎng)期低溫凍存對(duì)腫瘤組織樣本A260/A280無影響。 2.3 長(zhǎng)期低溫時(shí)間樣本對(duì)抽提RNA RIN影響 接下來比較了四組之間RIN值差異

8、，將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，四組腫瘤的RIN值分別為8.380.56﹑7.78 0.36﹑5.780.48﹑和4.23 0.34，如圖3所示，<2年和3-5年兩組RIN值無差別(F=0.983，P=0.340)；6-8年組RIN值比較3-5年組RIN值有明顯下降(F=10.860，P=0.005)；>9年RIN值比較6-8年組有明顯下降(F=5.399，P=0.037)。提示凍存時(shí)間超過5年的標(biāo)本RNA質(zhì)量成逐年下降趨勢(shì)。 2.4 RNA分子完整性及質(zhì)量分級(jí) 依照在1％瓊脂糖凝膠電泳圖上28S與18S條帶情況以及RIN值將樣本RNA質(zhì)量與完整性分為

9、A,B,和C 3級(jí)。在1％瓊脂糖凝膠電泳圖上有清晰的28S與18S兩條主帶且RIN大于7定義為A，若能看到兩條帶但清晰度下降且28S條帶模糊定義為B且RIN值大于4定義為B，若28S與18S兩條帶均消失呈涂抹狀或RIN值小于4則定義為C。本組樣本RNA分子的質(zhì)控檢測(cè)與儲(chǔ)存年限關(guān)系見表2。 本研究組將組織標(biāo)本按年限分成四組，分別為<2年、3-5年、6-8年、>9年，各個(gè)A、B、C級(jí)樣本數(shù)目之比為5:1:0、6:3:0、1:6:2和0:3:3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示樣本低溫凍存5年以內(nèi)A、B、C級(jí)樣本數(shù)目之比無明顯差異(P=0.604)，A、B、C級(jí)樣本數(shù)目比例在低溫凍存>9年組和3-5年組比較存在差

10、異(P=0.013)；樣本低溫凍存6-8年，A、B、C級(jí)樣本數(shù)目比例比較3-5年組也存在差異(P=0.037)；但是樣本低溫凍存6-8年與低溫凍存>9年組A、B、C級(jí)樣本數(shù)目比例無差異(P=0.435)。提示凍存時(shí)間超過5年的標(biāo)本RNA提取高質(zhì)量樣本的數(shù)目銳減。 3 討論 腫瘤生物樣本庫的核心是溫度與質(zhì)量，國(guó)際上在樣本核酸質(zhì)量分析中，A260，A280及其比值是判斷RNA樣本純度的指標(biāo)；RNA的完整性可用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)量28S和18S核糖體RNA(rRNA)條帶法和RIN值檢測(cè)法(16)。A260代表核酸(RNA)吸光度，A280代表蛋白質(zhì)吸光度。純凈的RNA其A260/A280比值

11、為1.7～2.0，比值<1.7表明有蛋白質(zhì)或酚類污染，比值>2.0表明可能有異硫氰酸胍殘留。對(duì)于RNA完整性的評(píng)價(jià)目前主要有兩種方法，包括瓊脂糖凝膠電泳測(cè)量28S和18S核糖體RNA(rRNA)條帶法和RIN值檢測(cè)法。rRNA占整個(gè)RNA分子的80％，而mRNA僅占RNA分子的3％，故檢測(cè)mRNA并不容易，而檢測(cè)含量高的rRNA相對(duì)容易。在瓊脂糖凝膠電泳中，當(dāng)28S和18S的rRNA條帶亮度比例為2時(shí)便被認(rèn)為RNA完整。RNA是極易降解的生物分子，由于缺血、凋亡及壞死等影響，28S的rRNA比18S的rRNA更易退化，所以28S和18S的比值為2難以實(shí)現(xiàn)。RIN的計(jì)算采用了“RIN軟件算法”，

12、檢測(cè)結(jié)果以1到10數(shù)字表示，完整的RNA為10。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，RIN值>7可視為優(yōu)秀，適用于高質(zhì)量的RNA研究，如基因芯片檢測(cè)；RIN值為4～7視為良好，可以用于一般分子生物學(xué)研究，如定量PCR；當(dāng)RNA完全降解時(shí)RIN值為1(17, 18)。自RIN檢測(cè)方法開發(fā)以來，被廣泛用來評(píng)價(jià)RNA完整性。有文獻(xiàn)提出，對(duì)于有一定程度RNA降解的樣本，也可以進(jìn)行定量PCR檢測(cè)獲得目的基因的相對(duì)表達(dá)量，從而提高了一批珍稀樣本利用率。在本研究中，我們依照凍存年限將組織標(biāo)本分成4組(<2年、3～5年、6～8年和>9年)，研究結(jié)果提示各組間的RNA濃度無顯著性差異(P>0.05)，各組之間A260/A280差

13、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四組之間的RIN值檢測(cè)顯示，凍存5年以上組的RIN值有明顯下降(P=0.018)。高質(zhì)量的A級(jí)別RNA質(zhì)量在凍存5年以上組所占比例開始降低，由此提示長(zhǎng)期低溫時(shí)間超過5年后的肝細(xì)胞癌患者的腫瘤標(biāo)本RNA存在嚴(yán)重的降解。本研究不足之處在于僅對(duì)肝癌組織樣本RNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，缺乏對(duì)癌旁組織和正常肝組織樣本RNA質(zhì)量評(píng)估，我們將在接下來的研究中進(jìn)一步深入探討。 [參考文獻(xiàn)] 1. Barry W. National tumor bank set up in United king

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26、 圖3：不同凍存年限樣本RIN在各組之間數(shù)值 (卡方檢驗(yàn)，# P>0.05;* P<0.05;** P<0.01) 表2：凍存樣本的RNA質(zhì)控分級(jí)與儲(chǔ)存年限關(guān)系 肝癌組織(T) 樣本 儲(chǔ)存年限 RNA 編號(hào) （年） 質(zhì)量等級(jí) 08-1T 10 B 08-2T 10 C 08-3T 10 C 09-1T 9 C 09-2T 9 B 09-3T 9 B 10-1T 8 B 10-2T 8 C 10-3T 8 B 11-1T 7 B 11-2T 7 A 11-3T 7 B 12-1T 6 B 12-2T 6 B 12-3T 6 C 13-1T 5 B 13-2T 5 B 13-3T 5 A 14-1T 4 A 14-2T 4 A 14-3T 4 A 15-1T 3 B 15-2T 3 A 15-3T 3 A 16-1T 2 A 16-2T 2 A 16-3T 2 A 17-1T 1 A 17-2T 1 B 17-3T 1 A