糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)方法編制說明

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1、糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》 編制說明 糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》 標(biāo)準(zhǔn)起草組 2011年 11 月 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金 快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》 編制說明 1 ?任務(wù)來源及工作過程 國(guó)務(wù)院糧食管理流通條例和糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)都明確規(guī)定糧食收購(gòu)要對(duì)真菌毒 素玉米赤霉烯酮進(jìn)行檢驗(yàn)控制，而我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)體系中缺少嘔吐毒素快速檢測(cè)的方法 及標(biāo)準(zhǔn)因此，該項(xiàng)研究迫在眉睫。 我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)產(chǎn)品種植區(qū)分布廣泛，糧食收購(gòu)多集中在縣以下單位的 糧食收儲(chǔ)庫(kù)點(diǎn)。時(shí)間短，收購(gòu)量大，存在很多隱患。主要集中在以下方面：一方 面糧食入庫(kù)時(shí)間短，不宜長(zhǎng)時(shí)間

2、露天存放，因此對(duì)玉米赤霉烯酮的檢測(cè)需要快速 定性。另一方面收購(gòu)企業(yè)技術(shù)力量和硬件設(shè)備不足，利用大型儀器檢測(cè)收購(gòu)糧真 菌毒素?zé)o法普及。因此目前在糧食收購(gòu)環(huán)節(jié)最需要解的問題就是建立高效、 快速、 低成本的定性檢測(cè)方法。 傳統(tǒng)上，真菌毒素的分析一般采用薄層色譜法 (TLC和高效液相色譜法 (HPLC) TLC雖然簡(jiǎn)便，但靈敏度差；HPLC雖然靈敏度高，但樣品處理煩瑣，操 作復(fù)雜，儀器昂貴。這兩種方法都不適合在收購(gòu)原糧時(shí)進(jìn)行快速定性檢測(cè)。 因此 需要玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)方法的研究，從源頭解決儲(chǔ)備糧真菌毒素污染問題。 為了確保公民的飲食安全，進(jìn)一步保證產(chǎn)品質(zhì)量、規(guī)范生產(chǎn)、為市場(chǎng)監(jiān)督提 供依據(jù)，

3、需要制定《糧食中玉米赤霉烯酮一一膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》 標(biāo)準(zhǔn), 按照GB2760-2007的要求，對(duì)小麥粉及其制品中玉米赤霉烯酮的含量進(jìn)行監(jiān)督。 本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定是根據(jù)國(guó)家糧食局標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量中心下達(dá)的 年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 制修訂任務(wù)，由北京市糧油食品檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)起草。項(xiàng)目編號(hào)： 2.編制過程 2.1第一階段工作 第一階段為收集國(guó)內(nèi)外玉米赤霉烯酮測(cè)試分析標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)資料， 了解掌握玉 米赤霉烯酮測(cè)定方法的最新技術(shù)發(fā)展情況階段。本階段查閱了大量的文獻(xiàn)資料， 參考國(guó)內(nèi)外玉米赤霉烯酮測(cè)定方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。 標(biāo)準(zhǔn)編制小組成員經(jīng) 過研究和討論一致認(rèn)為， 膠體金快速檢測(cè)方法具有較好的可操作性和

4、實(shí)用性， 因 此我們參考這些先進(jìn)方法和產(chǎn)品， 并根據(jù)國(guó)內(nèi)糧食行業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)和檢測(cè)技術(shù)應(yīng) 用情況，著手制定 《糧食中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》 的基 本思路和主要工作方向。 2.2 第二階段工作 第二階段為組織起草并召開標(biāo)準(zhǔn)起草組工作會(huì)議。本標(biāo)準(zhǔn)起草組在經(jīng)過收 集、整理資料和調(diào)研工作的基礎(chǔ)上， 提出標(biāo)準(zhǔn)提綱， 確定了標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容和要 求。標(biāo)準(zhǔn)起草工作組成員單位進(jìn)行討論、論證，形成標(biāo)準(zhǔn)初步文本；標(biāo)準(zhǔn)起草組 成員單位間通過多種形式不斷交流、 補(bǔ)充、 完善標(biāo)準(zhǔn)文本， 進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)和比對(duì) 試驗(yàn)，最終形成該標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。 本階段重點(diǎn)組織了玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)。 先后開展

5、了兩輪比對(duì) 試驗(yàn)，針對(duì)各家分析實(shí)際操作時(shí)標(biāo)準(zhǔn)文本中存在的問題及建議， 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修 改，得到標(biāo)準(zhǔn)起草小組的一致認(rèn)可，形成該標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。 3 編制原則 3.1 本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T 1.1-2009、GB/T 20000.2-2009 和GB/T 20001.4-2001《標(biāo) 準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4 部分 化學(xué)分析方法》 的規(guī)定和要求編寫， 在標(biāo)準(zhǔn)框架、 結(jié)構(gòu)和 內(nèi)容等方面符合這些標(biāo)準(zhǔn)的要求。 3.2 強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了糧食中玉米赤霉烯酮的安全限量， 且本標(biāo)準(zhǔn)所確定的檢測(cè)方法能滿足該標(biāo)準(zhǔn)的初步篩選測(cè)定。 4. 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù) 4.1 本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容 《糧食

6、中玉米赤霉烯酮——膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)方法》標(biāo)準(zhǔn)為推薦性標(biāo) 準(zhǔn)，其主要內(nèi)容包括： （1 ） 封面 （2） 前言 3） 標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容：范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器設(shè)備、 樣品制備、樣品測(cè)定與結(jié)果判定。 4.2 主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析 4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)方法原理 玉米赤霉烯酮毒素膠體金快速測(cè)試卡檢測(cè)技術(shù)原理是基于抗原抗體反應(yīng)、 免 疫金標(biāo)記技術(shù)及毛細(xì)管層析技術(shù)。 以微孔膜為固相載體， 將可特異性識(shí)別玉米赤 霉烯酮的抗體標(biāo)記紅色或紫紅色的膠體金顆粒， 檢測(cè)卡的膜上兩個(gè)色帶分別固定 玉米赤霉烯酮抗原， 以及抗鼠源性抗體的二抗， 根據(jù)色帶的顏色變化進(jìn)行結(jié)果評(píng) 估。質(zhì)控色帶（ con

7、trol line ）不會(huì)被樣品中的玉米赤霉烯酮影響，而在每次反應(yīng) 后都應(yīng)出現(xiàn)，用于證明檢測(cè)條是否正常。檢測(cè)色帶（test line）在樣品中沒有玉 米赤霉烯酮或樣品中玉米赤霉烯酮的含量低于檢測(cè)限時(shí)會(huì)顯現(xiàn)； 在樣品中玉米赤 霉烯酮含量等于或高于檢測(cè)限時(shí)不出現(xiàn)。 4.2.2 驗(yàn)證方案 驗(yàn)證對(duì)象及驗(yàn)證單位 參考糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)， 確定本次驗(yàn)證糧種為小麥和玉米， 考慮到加標(biāo)樣品的毒 素分布、均勻性等影響， 本次驗(yàn)證全部采用天然陽(yáng)性樣品進(jìn)行驗(yàn)證； 驗(yàn)證毒素為 玉米赤霉烯酮（DON）;驗(yàn)證用膠體金快速測(cè)試卡采用國(guó)內(nèi)二家公司提供的 DON 三批次。驗(yàn)證單位為（北京）國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心、 （湖北）國(guó)家

8、糧食質(zhì)量監(jiān) 測(cè)中心、（遼寧）國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心、 （重慶）國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心、 （四 川）國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心和（廣西）國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心。 陽(yáng)性樣品的制備 北京中心將收集到的陽(yáng)性樣品粉碎，至少 80%以上通過 20 目篩，篩上和篩 下物混勻，采用免疫親和柱高效液相色譜法對(duì)制備的陽(yáng)性樣品進(jìn)行混合均勻度測(cè) 定，混合均勻性達(dá)到要求后將陽(yáng)性樣品分發(fā)給六家國(guó)家檢測(cè)中心。 4.2.2.3 陽(yáng)性樣品定值 六家國(guó)家檢測(cè)中心收到陽(yáng)性樣品后， 采用免疫親和柱高效液相色譜法進(jìn)行平 行試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果報(bào)送北京中心進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，取平均值作為理論值。 4.2.2.4 測(cè)試卡驗(yàn)證 六家國(guó)家中心將分發(fā)并定值后

9、的高濃度陽(yáng)性樣品與空白樣品按照各測(cè)試卡 樣品量要求分別稱取，配置所需濃度，然后按照測(cè)試卡說明書指定的方法進(jìn)行測(cè) ^定。 423結(jié)果與分析 采用兩種DON測(cè)試卡（測(cè)試卡A和測(cè)試卡B）,各三個(gè)批次，按照各自規(guī)定 的操作步驟和評(píng)定方法對(duì)玉米中 DON進(jìn)行了測(cè)定。 準(zhǔn)確性 測(cè)試卡A 根據(jù)結(jié)果，共進(jìn)行21個(gè)濃度150次有效測(cè)試，共出現(xiàn)誤判21次，判定準(zhǔn)確 率為86%,假陽(yáng)誤判出現(xiàn)3次，假陰誤判出現(xiàn)18次。 具體結(jié)果見下表1： 表1玉米赤霉烯酮測(cè)試卡A誤判情況表 品種 測(cè)試次 數(shù) 誤判 次數(shù) 誤判率 % 假陰誤 判次數(shù) 假陰誤 判率% 假陽(yáng)誤 判次數(shù) 假陽(yáng)誤

10、 判率% 玉米 15 21 14. 18 12. 3 2.0 0 0 0 4.2.3.1.2 測(cè)試卡 B 根據(jù)結(jié)果，共進(jìn)行21個(gè)濃度142次有效測(cè)試，共出現(xiàn)誤判24次，判定準(zhǔn)確 率為83.1%，假陽(yáng)誤判出現(xiàn)9次，假陰誤判出現(xiàn)15次。 具體結(jié)果見下表2： 表2玉米赤霉烯酮測(cè)試卡B誤判情況表 品種 測(cè)試次 誤判 誤判率 假陰誤 假陰誤 假陽(yáng)誤 假陽(yáng)誤 數(shù) 次數(shù) % 判次數(shù) 判率% 判次數(shù) 判率% 玉米 142 24 16.9 15 10.6 9 6.3 重復(fù)性 測(cè)試卡A:按照驗(yàn)證方案，共進(jìn)

11、行240次測(cè)試，其中有效結(jié)果為240次，共 出現(xiàn)誤判29次，判定準(zhǔn)確率為87.9%,其中假陰性誤判次數(shù)為11次，出現(xiàn)比例 為 4.6%。 測(cè)試卡B:按照驗(yàn)證方案，共進(jìn)行243次測(cè)試，其中有效結(jié)果為243次，共 出現(xiàn)誤判29次，判定準(zhǔn)確率為88.1%,其中假陰性誤判次數(shù)為20次，出現(xiàn)比例 為 8.2%。 423.3穩(wěn)定性 測(cè)試卡A 根據(jù)有效結(jié)果，按照含量為限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)判定為陽(yáng)性的規(guī)則， 各不同產(chǎn)品批 次測(cè)定結(jié)果如下表3： 表3測(cè)試卡A不同產(chǎn)品批次測(cè)定結(jié)果 批次 測(cè)試次數(shù) 誤判 判定準(zhǔn)確率% 20101110 16 1 93.8 20101116 25 2 92

12、.0 20101126 24 3 87.5 20101106 15 2 86.7 批間相對(duì)偏差% 3.8 4.2.3.3.2 測(cè)試卡 B 根據(jù)有效結(jié)果，按照含量為限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)判定為陽(yáng)性的規(guī)則， 各不同產(chǎn)品批 次測(cè)定結(jié)果如下表4: 表4測(cè)試卡B不同產(chǎn)品批次測(cè)定結(jié)果 批次 測(cè)試次數(shù) 誤判 判定準(zhǔn)確率% G101009301 33 0 100 G101125304 39 0 100 G101125305 29 5 82.8 批間相對(duì)偏差% 10.5 約定誤差范圍試驗(yàn) 測(cè)試卡A:在40-80ppb濃度范圍內(nèi)，對(duì)玉米

13、樣本共進(jìn)行12個(gè)濃度的測(cè)定， 共獲得有效結(jié)果102次，假陰出現(xiàn)16次，基本平均分布在60-80ppb濃度之間, 且110與120ppb濃度下也各出現(xiàn)1次誤判；假陽(yáng)出現(xiàn)3次，分別在在55ppb濃 度2次、58ppb濃度1次，總體樣本假陽(yáng)誤判率為2.9%。 測(cè)試卡B:在40-80ppb濃度范圍內(nèi)，對(duì)玉米樣本共進(jìn)行12個(gè)濃度的測(cè)定， 共獲得有效結(jié)果92次，假陰出現(xiàn)14次，基本平均分布在60-80ppb濃度之間， 另外，在120ppb濃度下出現(xiàn)1次誤判；假陽(yáng)出現(xiàn)9次，分別在在40ppb-58ppb 濃度之間，總體樣本假陽(yáng)誤判率為 9.8%。 結(jié)論 現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的ZEN測(cè)定方法精密度（見

14、表5）。 表5玉米赤霉烯酮檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)號(hào) GB/T500 9.209-20 08 GB/T 23504-200 9 SN/T 1772-2006 標(biāo)準(zhǔn)名稱 食品中玉 進(jìn)出口糧谷中 米赤霉烯 玉米赤霉烯酮 酮的測(cè)定 的測(cè)定 采用方法 免疫親和層析HPLC 薄層色譜 ELISA HPLC 重復(fù)性% 15 10 10 15 / 再現(xiàn)性% / / / / / 檢出限/量 5ug/kg 20ug/kg 20 ng 0.25 ng 5ug/kg 回

15、收率% / 70-100 / / 73.7-98.2 4.2.4.2測(cè)試卡性能（見表 6）： 表6測(cè)試卡B不同產(chǎn)品批次測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確率 批次 測(cè)試卡A % 測(cè)試卡B %備注 準(zhǔn)確性 86 83.1 玉米 重復(fù)性 87.9 88.1 玉米 穩(wěn)定性 90 95.0 玉米 約定誤差范圍（50 81.2 73.3 玉米 mg/kg ?70 mg/kg） 4.243嘔吐毒素測(cè)試卡指標(biāo)設(shè)定 準(zhǔn)確性判定誤判率：結(jié)合4.241中目前國(guó)內(nèi)方法的各項(xiàng)指標(biāo)可設(shè)定為小于 15% 重復(fù)性判定誤判

16、率：結(jié)合4.241中目前國(guó)內(nèi)方法的各項(xiàng)指標(biāo)可設(shè)定為小于 15% 穩(wěn)定性判定誤判率：結(jié)合4.241中目前國(guó)內(nèi)方法的各項(xiàng)指標(biāo)可設(shè)定為小于 15% 約定誤差范圍（50 mg/kg~70 mg/kg）內(nèi)判斷誤判率： 該方法中，兩種測(cè)試卡的約定誤差范圍誤判率提取機(jī)制上進(jìn)一步改進(jìn)， 應(yīng)當(dāng) 能解決誤判率告的問題，因此將該濃度范圍內(nèi)的誤判率定為小于 15% 5. 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建議 建議將此國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)列為推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。 6. 貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過度辦法等內(nèi)容） 建議職能管理機(jī)構(gòu)，指定生產(chǎn)部門，生產(chǎn)貫徹本標(biāo)準(zhǔn)以達(dá)到保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益 的

17、目的。 7. 新舊國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的總體對(duì)比 8. 技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證及預(yù)期的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效果 國(guó)際上少數(shù)國(guó)家針對(duì)糧食玉米赤霉烯酮含量的檢測(cè)制定了試行方法， 但方法 均不統(tǒng)一。我國(guó)目前還未制定相關(guān)的快速篩選方法標(biāo)準(zhǔn)。 隨著食品安全、糧食安 全戰(zhàn)略意義的不斷擴(kuò)大，以及我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，加入世界貿(mào)易組織，與國(guó)際 標(biāo)準(zhǔn)接軌，必須制定相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行安全控制?，F(xiàn)狀：我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng) 產(chǎn)品種植區(qū)分布廣泛，糧食收購(gòu)多集中在縣以下單位的糧食收儲(chǔ)庫(kù)點(diǎn)。時(shí)間短， 收購(gòu)量大，存在很多隱患。主要集中在以下方面：一方面糧食入庫(kù)時(shí)間短，不宜 長(zhǎng)時(shí)間露天存放，因此對(duì)玉米赤霉烯酮的檢測(cè)需要快速定性。 另一方面收購(gòu)企業(yè) 技術(shù)力

18、量和硬件設(shè)備不足，利用大型儀器檢測(cè)收購(gòu)糧真菌毒素?zé)o法普及。 因此目 前在糧食收購(gòu)環(huán)節(jié)最需要解的問題就是建立高效、 快速、低成本的定性檢測(cè)方法。 該標(biāo)準(zhǔn)的制定有利于促進(jìn)產(chǎn)業(yè)升級(jí)和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的調(diào)整、 推動(dòng)技術(shù)進(jìn)步和技術(shù) 創(chuàng)新、推進(jìn)與國(guó)際慣例接軌； 有利于糧食質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的建立； 有利于公共食品 安全。 9. 參考的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) 無 10. 與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 11. 關(guān)于強(qiáng)制性條款 12. 貫徹國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議 1）首先應(yīng)在實(shí)施前保證文本的充足供應(yīng)， 讓每個(gè)使用者都能及時(shí)得到文本。 這是保證新標(biāo)準(zhǔn)貫徹實(shí)施的基礎(chǔ)。 2）發(fā)布后、實(shí)施前應(yīng)將信息在媒體上廣為宣傳。 3）本次修訂，不僅與生產(chǎn)廠家有關(guān)，而且與消費(fèi)者有關(guān)。對(duì)于使用過程中 容易出現(xiàn)的疑問，要在媒體上撰文事先予以解釋。 4）要分別標(biāo)準(zhǔn)的不同使用對(duì)象，消費(fèi)者、生產(chǎn)廠家、質(zhì)量監(jiān)管部門等，有 側(cè)重點(diǎn)地進(jìn)行培訓(xùn)、宣傳。 5）實(shí)施的過渡期宜定為 6 個(gè)月。 6）建議質(zhì)量監(jiān)督部門加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。 13. 廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議 無