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1、食品安全實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)突變實(shí)驗(yàn)食品安全實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)n一、目的與要求n1、了解化學(xué)毒物致突變性分析的原理及分析要求。n2、掌握回復(fù)突變的測(cè)試方法。n二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理n 鼠傷寒沙門氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。n 某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變， 故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。食品安全實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌回
2、復(fù)突變實(shí)驗(yàn)三、培養(yǎng)基和試劑 n1、 0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液n2、頂層瓊脂培養(yǎng)基n3、底層瓊脂培養(yǎng)基n4、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基n5、鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)n6、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)n7、S9混合液n8、溶劑的選擇 食品安全實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)四、操作方法四、操作方法 n1、增菌培養(yǎng)n取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5ml，加入無(wú)菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于12109活菌數(shù)。n2、平板摻入法n 實(shí)驗(yàn)時(shí)，將含0.5
3、mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代謝活化時(shí)），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37培養(yǎng)箱里孵育48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。n實(shí)驗(yàn)中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照、陽(yáng)性誘變劑對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照。食品安全實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)五、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷五、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷n記錄受試物各劑量組、空白對(duì)照（自發(fā)回變）、溶劑對(duì)照以及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照的每皿回變菌落數(shù)，并求平
4、均值和標(biāo)準(zhǔn)差。n如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系者，則該受試物判定為致突變陽(yáng)性。n受試物經(jīng)上述四個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株，無(wú)論在加S9或未加S9條件下為陽(yáng)性，均可報(bào)告該受試物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽(yáng)性。如果受試物經(jīng)四個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后，無(wú)論加S9和未加S9均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。食品安全實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)六、試驗(yàn)報(bào)告六、試驗(yàn)報(bào)告n 試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：n（1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、使用溶劑；n（2）試驗(yàn)菌株：所用試驗(yàn)菌株；n（3）代謝活化系統(tǒng)：所用誘導(dǎo)劑；n（4）試驗(yàn)方法：簡(jiǎn)述操作步驟，除受試物劑量分組外，還應(yīng)說(shuō)明空白對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)；n（5）結(jié)果：以列表方式報(bào)告受試物的Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）；n（6）結(jié)論。食品安全實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)表1 Ames試驗(yàn)菌株的回變結(jié)果（平均值標(biāo)準(zhǔn)差）TA102組別劑量(mg/皿)TA97-( S9) +( S9)TA98-( S9) +( S9)TA100-( S9) +( S9)-( S9) +( S9) 受試物自發(fā)回變?nèi)軇?duì)照陽(yáng)性物對(duì)照
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