第七章-病毒基因工程-病毒學課件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master title style,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,*,1,第七章 病毒基因工程,2,第一節(jié),病毒基因工程的主要研究內(nèi)容,第二節(jié) 病毒載體的主要類型及其應(yīng)用,3,第一節(jié) 病毒基因工程的主要研究內(nèi)容,病毒基因工程主要研究目的就是利用重組,DNA,技術(shù)，高效表達病毒基因及其他外源基因或者對病毒基因組進行改造，用于制備防治病毒性疾病的疫苗、抗病毒制劑以及進行基因治療。,4,一、病毒基因及基因組結(jié)構(gòu)與功能研究,病毒基因工程技術(shù)和方法運用于病毒學研究，對于闡明病毒基因及基因組結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系和一些病毒的基因表達調(diào)控機理有重要作用。,RNA,腫瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，使中心法則得以完善及發(fā)展，同時使,RNA,反轉(zhuǎn)錄為,cDNA,成為實驗室常規(guī)手段。,認識到有關(guān)真核基因表達調(diào)控的內(nèi)在規(guī)律及原理，如基因重疊現(xiàn)象、轉(zhuǎn)錄后加工、啟動子及增強子等。,6,最初的乙肝疫苗是,血源性疫苗,(plasma-derived vaccine,，,PDV),從乙型肝炎急性期病人的血清中分離的澳抗,(HBsAg),制備而成的,血源有限、價格昂貴，還存在潛在的不安全性，因為乙型肝炎病毒攜帶者還可能感染,HIV,等其他病毒。,第一個基因工程酵母重組乙型肝炎疫苗由默克公司于,1986,年開發(fā)成功，它是用,酵母表達澳抗,制備的基因工程亞單位疫苗。,7,三、抗病毒藥物與制劑的研制,抗病毒感染的藥物如干擾素、轉(zhuǎn)移因子、活性多肽等，它們有的來源于病毒，有的來源于病毒感染細胞時宿主的反應(yīng)產(chǎn)物,在組織細胞內(nèi)產(chǎn)量極微，所以采用常規(guī)方法很難滿足臨床需要。,1983,年，,Smith,等首次利用,AcMNPV,做載體成功表達人的,-,干擾素，與天然干擾素相同的生物學活性。,1994,年我國批準基因工程干擾素,1b,的臨床使用。,采用基因工程技術(shù)還可以,把幾個不同型別的干擾素基因拼接起來，生產(chǎn)具有多種特性和功能的自然界所沒有的活性多肽物質(zhì),，例如把,D,與,A,基因拼接后產(chǎn)生的干擾素，既具有具,D,的某些性狀，又具有,A,的一些性狀。,8,四、病毒載體的構(gòu)建與應(yīng)用,病毒載體就是利用病毒的基因組序列元件構(gòu)建外源基因轉(zhuǎn)移或表達的工具，多用于真核基因表達，具有以下獨特的優(yōu)點。,病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單，易于改造和操作。,病毒增殖速度快，外源基因可高效表達。,病毒能感染特定受體細胞，使外源基因的導(dǎo)入效率高。,病毒具有特異的宿主范圍、組織嗜性和靶向性，對基因治療有益。,病毒的種類繁多，且各具不同的特性，構(gòu)建的病毒載體也相應(yīng)地具備不同的特點,。,10,五、病毒性疫病的基因診斷方法的建立,傳統(tǒng)培養(yǎng)病毒方法與免疫學診斷方法在時間、敏感性與特異性方面存在一定的局限性，并且一些病毒在實驗室內(nèi)現(xiàn)在很難或尚,無較好的培養(yǎng)方法，難以制備抗血清進行血清學鑒定,。,基因診斷技術(shù)在一定程度上彌補了傳統(tǒng)方法的不足，而且具有微量、快速、特異等優(yōu)點。目前應(yīng)用最廣泛的基因診斷方法有聚合酶鏈式反應(yīng),(polymerase chain reaction,，,PCR),、核酸分子雜交、基因芯片、生物傳感器等。,11,第二節(jié) 病毒載體的主要類型及其應(yīng)用,根據(jù)外源基因與病毒基因組的整合方式，可將病毒載體分為，置換型載體和插入型載體。,根據(jù)載體進入宿主細胞的方式，可將表達載體分為質(zhì)粒載體與病毒載體。,根據(jù)宿主類型可將病毒載體分為噬菌體載體、桿狀病毒載體、動物病毒載體、植物病毒載體等。,13,(,一,),噬菌體,左臂從,A,到,J,，長約,20kb,，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲等蛋白質(zhì)。,中段長約,20kb,，是,噬茵體,DNA,整合和切出、溶原性生長所需的序列。,右臂長,8-10kb,，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長的基因調(diào)控序列以及,噬菌體,DNA,的復(fù)制起始區(qū)。,15,(,二,)M13,絲狀噬菌體,M13,是溫和性噬菌體，裝配成熟后分泌到細胞外，不產(chǎn)生溶菌作用。被感染的細胞一個世代可釋放出約,1000,個子代噬菌體顆粒。,雖然,M13,噬菌體只含環(huán)狀單鏈,DNA,，但是在復(fù)制過程中仍以雙鏈,DNA,為中間媒介，可以如同質(zhì)粒,DNA,一樣進行操作。,+,鏈,DNA,16,M13,絲狀噬菌體載體,M13,的感染與釋放,不會殺死宿主菌,，僅使宿主細胞生長緩慢。,M13 DNA,在宿主細胞中既可以是單鏈也可以是雙鏈，通過感染或轉(zhuǎn)化的方法能將,M13 DNA,導(dǎo)入宿主細胞中。,M13,的包裝不受,DNA,大小的限制,，噬菌體顆粒的大小可隨,DNA,的大小而改變，即使,DNA,的大小比本身,DNA,的大小超出,6,倍,，仍能進行包裝。,可用于制備大量純化的單鏈,DNA,分子。,M13,噬菌體載體的主要用途是為,Sanger ddNTP,鏈終止法測定,DNA,序列制備單鏈,DNA,模板。,18,桿狀病毒載體的優(yōu)點,由于桿狀病毒的核衣殼可大幅度延伸，對外源基因克隆容量大。,桿狀病毒的多角體蛋白基因的啟動子是最強的真核基因啟動子之一，外源基因能高水平表達。,構(gòu)建,多元桿狀病毒載體,或用,幾個不同的重組桿狀病毒載體共感染細胞,，可同時表達,2,個或更多的外源基因。,利用在昆蟲細胞中,表達的外源蛋白的生物活性接近天然蛋白質(zhì)。,桿狀病毒,對于脊椎動物無病原性,，被認為是遺傳學上安全的表達載體。,利用重組桿狀病毒感染昆蟲或相應(yīng)的昆蟲細胞，可以工業(yè)化生產(chǎn),BEVS,表達的重組蛋白。,19,昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)的應(yīng)用,自,1983,年,Smith,等首次利用,AcMNPV,表達成功人,2,干擾素,以來，有近千種外源基因在該系統(tǒng)中得到表達，其中大部分表達產(chǎn)物是具較大潛力的高價值的藥用物質(zhì)。,AcMNPV,病毒也可以將外源基因?qū)氩溉閯游锏募毎?，如肝細?AcMNPV,病毒可能成為哺乳動物基因治療的媒介載體,，因此桿狀病毒有望在未來人類的基因治療中得到應(yīng)用。,利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)進行,重組桿狀病毒殺蟲劑,。,20,三、動物病毒載體,當表達高等真核基因時，應(yīng)用哺乳動物表達體系比應(yīng)用原核及昆蟲表達體系顯得更為優(yōu)越，這是因為,原核及昆蟲細胞表達體系不能對外源真核基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯后進行有效的修飾,。目前較廣泛地應(yīng)用于哺乳動物細胞表達體系的載體有猴病毒,40(simian virus40,，,SV40),，痘病毒,(Poxvirus),，腺病毒（,Adenovirus,）、逆轉(zhuǎn)錄病毒,(Retroviruses),載體等。,21,SV40,載體,SV40,是一種能感染,猿、猴等哺乳動物的,DNA,病毒,，其基因組為,環(huán)狀雙鏈,DNA,。,基因組在功能上分為早期轉(zhuǎn)錄和晚期轉(zhuǎn)錄兩個區(qū)域。早期轉(zhuǎn)錄形成兩種成熟的,mRNA,，分別編碼小,t,抗原和大,T,抗原。小,t,抗原在病毒感染中的作用不明，,大,T,抗原對,DNA,的復(fù)制起始,起著十分重要的作用。,晚期轉(zhuǎn)錄的,VP1,、,VP2,和,VP3,是病毒的衣殼蛋白。,22,SV40,載體的構(gòu)建,SV40 DNA,中的非必需區(qū)很小，插入外源基因時，需除去某些區(qū)段：早期基因被置換時，不能合成,T,抗原；晚期基因被置換時，則不能合成衣殼蛋白,均形成所謂的缺損性病毒,。,載體構(gòu)建時一般在晚期轉(zhuǎn)錄單位中插入外源,DNA,，由于晚期啟動子的轉(zhuǎn)錄水平高于早期啟動子，因此外源,DNA,轉(zhuǎn)錄的,RNA,和表達的蛋白量也較高。但需另一個,SV40,的溫度敏感變異株,(tsA,株,),作為輔助病毒提供衣殼蛋白，形成子代病毒顆粒。,早期基因被置換時，形成的重組,DNA,沒有,T,抗原，需要,cos,細胞來解決。,cos,細胞是己被,SV40 DNA,轉(zhuǎn)化了的猴傳代細胞，在其染色體內(nèi)的,SV40 DNA,編碼功能,T,抗原，但因缺乏復(fù)制起始點，病毒,DNA,不能復(fù)制,。將重組,DNA,導(dǎo)入,cos,細胞，可以形成含有重組,DNA,的病毒顆粒。,24,痘苗病毒載體,痘苗病毒（,Vaccinia Virus,）是人們熟悉的一種病毒，它被人們用作疫苗根除天花病。,利用痘苗病毒作為基因表達載體的優(yōu)點為：,基因組很大，故可用于插入的外源基因量也較大，病毒宿主范圍廣；,病毒在胞質(zhì)中復(fù)制與增殖，無致癌性。,重組痘病毒可在人體接種作為活疫苗。,VV,可容納長達,2540kb,的外源基因插入，甚至可在同一非必需區(qū)或不同非必需區(qū)插入多個外源基因。,25,四、植物病毒載體,在植物病毒載體中研究得較為深入的是,植物病毒中唯一的雙鏈,DNA,病毒,-,花椰菜花葉病毒,(Califlower mosic virus,，,CaMV),。,CaMV,是感染十字花科作物的病毒，基因組為約,8 kb,的環(huán)狀,dsDNA,分子。有多種限制性核酸內(nèi)切酶的切點。,植物病毒載體具有很多優(yōu)點，例如,短時間內(nèi)可以生產(chǎn)大量成本低廉的外源蛋白,，滿足醫(yī)藥及工業(yè)用蛋白的需求。,近年來也逐步利用植物病毒載體作為,探針,，用于研究植物和植物病原基因的表達調(diào)控、編碼產(chǎn)物的功能以及植物與病原的相互作用。,26,花椰菜花葉病毒載體,互補載體系統(tǒng)：由缺陷型,CaMV DNA,與輔助病毒組成互補系統(tǒng)。外源基因克隆到,CaMV,基因組中，在共感染植物細胞時，外源基因能在,CaMV 35S,啟動子驅(qū)動下表達，由于輔助病毒的協(xié)助，可組成重組病毒顆粒。,混合載體系統(tǒng)：將,CaMV DNA,插入,Ti,質(zhì)粒的,T-DNA,中，轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，由細菌介導(dǎo)的將,CaMV,基因組轉(zhuǎn)移至植物細胞基因組內(nèi)，并產(chǎn)生對植物細胞的感染稱土壤桿菌感染作用（,Agroinfection,）。,融合載體系統(tǒng)：,利用,CaMV,強啟動子,35S,構(gòu)建成融合載體，插入外源基因，,在,35S,啟動子驅(qū)動下在植物細胞中表達外源基因。,