過氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定

過氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定 傅璐121140012 一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1. 了解米氏常數(shù)的測(cè)定方法 2. 學(xué)習(xí)提取生物組織中的酶 二、 實(shí)驗(yàn)原理 1. 米氏反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 米氏方程 (Michaelis-Menten Equation): 2. 米氏常數(shù)的意義： ① 反映酶的種類：Km是一種酶的特征常數(shù)，只與酶的種類有關(guān)，與酶濃度、底物濃度無關(guān)。 ② 米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax一半時(shí)的底物濃度。其數(shù)值大小反映了酶與底物之間的親和力：Km值越大，親和力越弱，反之Km值越小，親和能力越強(qiáng)。 ③ Km可用來判斷酶（多功能酶）的最適底物：Km值最小的酶促反應(yīng)對(duì)應(yīng)底物就是該酶的最適底物。 3.米氏常數(shù)的求法： 該方法的缺點(diǎn)是難以確定最大反應(yīng)速度Vmax。 1 / 6 該作圖法應(yīng)用最廣。但在低濃度是v值誤差較大，在[S]等差值實(shí)驗(yàn)時(shí)作圖點(diǎn)較集中于縱軸。因此在設(shè)計(jì)底物濃度時(shí)，最好將1/[S]配成等差數(shù)列，這樣可使點(diǎn)距較為平均，再配以最小二乘回歸法，就可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。 此法優(yōu)點(diǎn)是橫軸上點(diǎn)分布均勻，缺點(diǎn)是1/v會(huì)放大誤差，同時(shí)對(duì)底物濃度的選擇有要求。[S]<<Km時(shí)圖形近于水平線，[S]>>Km時(shí)直線將在原點(diǎn)附近與軸相交。 4.氧化酶：生物體內(nèi)重要的三種氧化酶類，其作用均是消除體內(nèi)自由基： ①POD：過氧化物酶 ②SOD:超氧化物歧化酶 ③CAT：；過氧化氫酶 5.過氧化氫酶的作用： 植物體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使過氧化氫發(fā)生積累。過氧化氫可進(jìn)行一步生成氫氧自由基。氫氧自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并且有非常高的速度常數(shù)，破壞性極強(qiáng)，可使細(xì)胞膜遭受損害，加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶（catalase，CAT）可以清除過氧化氫、分解氫氧自由基，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活，因此CAT是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一，其活性高低與植物的抗逆性密切相關(guān)。 6.過氧化氫酶活力的測(cè)定方法： ①紫外吸收法： 過氧化氫在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度（A240nm）隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光度的變化速度即可測(cè)出過氧化氫酶的活性。（以一分鐘內(nèi)A240nm下降0.1為一個(gè)單位） ②滴定法（高錳酸鉀法、碘量法） 在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的過氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過氧化氫。根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)消耗的過氧化氫的量即可測(cè)出過氧化氫酶活力大小。 7.實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng) ： H2O2被過氧化氫酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性環(huán)境中滴定, 根據(jù)反應(yīng)前后的濃度差可以算出反應(yīng)速度: 酶 2H2O2 ?→ 2H2O + O2 2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 ?→ 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2 （本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯提供過氧化氫酶） 三、 實(shí)驗(yàn)試劑 1. 0.02mol/L 磷酸緩沖溶液 (pH=7.0): 實(shí)驗(yàn)室提供. 2. 酶液: 稱取馬鈴薯 5g, 加緩沖液 10mL, 勻漿過濾. 3. 0.01mol/L 高錳酸鉀. 4. 0.098mol/L H2O2. 5. 25%H2SO4. 四、 實(shí)驗(yàn)操作 取 6 只錐形瓶, 按下表的順序加入試劑. 先加好過氧化氫和蒸餾水, 加酶液后立即混合, 依次記錄各瓶的起始反應(yīng)時(shí)間. 反映到達(dá) 5min 立即加入2ml 25%硫酸終止反應(yīng), 充分混勻.。用 0.01mol/L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的過氧化氫至微紅色, 記錄消耗的高錳酸鉀體積. 。 五、注意事項(xiàng)： 1.反應(yīng)時(shí)間必須準(zhǔn)確。 2.酶濃度須均一，若酶活力過大，應(yīng)適當(dāng)稀釋。 3.滴定終點(diǎn)的判定。 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 過氧化氫濃度：0.098mol/L 稱取馬鈴薯的質(zhì)量：5.00g 高錳酸鉀：0.01mol/L 序號(hào) 1 3 4 5 V（KMnO4）/ml 2.7 4.4 6.32 12.4 [S]/(mol/L) 0.0098 0.016368 0.0245 0.049 v/(mmol/min) 0.0061 0.010732 0.0174 0.036 1/[S] 102.0408 61.0948 40.8163 20.4082 1/v 163.9344 93.1793 57.4713 27.7778 米氏常數(shù)Km= -0.1913 七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析： 1.曲線上少一個(gè)點(diǎn)的原因： 用移液管移取序號(hào)為2的過氧化氫溶液（應(yīng)為1.25ml）錯(cuò)誤的移取了1.75ml，故在制圖時(shí)將其舍去。 2.曲線線性較好（R=0.9988）的原因： 本實(shí)驗(yàn)采取了兩人分工的方法完成實(shí)驗(yàn)，控制反應(yīng)結(jié)束及滴定分別由一人完成，所以標(biāo)準(zhǔn)都相同，從而在一定程度上提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 3. Km計(jì)算結(jié)果呈負(fù)值的原因： Km呈負(fù)值（即整條直線都向下移動(dòng)），亦即所有測(cè)定的v值都偏大。 由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推斷最可能的原因是V2整體測(cè)量偏小，可能的操作失誤是編號(hào)為0的空白對(duì)照組中高錳酸鉀的滴加量偏高，從而使除去該點(diǎn)的整體的高錳酸鉀量都偏小。 溫馨提示：最好仔細(xì)閱讀后才下載使用，萬分感謝！