高中生物 實(shí)驗(yàn)13 DNA片段的PCR擴(kuò)增學(xué)案 浙科版選修1

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1、DNA片段的PCR擴(kuò)增 1．為什么DNA復(fù)制需要引物？ DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基末端稱為3′端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 DNA復(fù)制方向的示意圖 2.細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分和作用是怎樣的？ 參與的組分 在DNA復(fù)制中的作用 解旋酶 打開DNA雙鏈 DNA母鏈 提供DNA復(fù)制的模

2、板 4種脫氧核苷酸 合成子鏈的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子鏈 引物 使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸 3.細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制與體外DNA擴(kuò)增(PCR技術(shù))相同嗎？?jī)烧哂钟惺裁搓P(guān)聯(lián)呢？ 細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制與體外DNA擴(kuò)增(PCR技術(shù))是不同的，兩者具體比較見下表： 細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制 PCR 不 同 點(diǎn) 解旋 有解旋酶的參與，邊解旋邊復(fù)制 80～100 ℃高度解旋，雙鏈完全分開 酶 DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶 TaqDNA聚合酶 引物 RNA DNA或RNA 能量 ATP 不加 溫度 體內(nèi)溫和條件

3、 高溫 相同點(diǎn) ① 提供DNA復(fù)制的模板； ②四種脫氧核苷酸作原料； ③子鏈延伸的方向都是從5′端到3′端 PCR反應(yīng)是通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制，所以有關(guān)PCR反應(yīng)的題目與DNA復(fù)制的原理相同，計(jì)算方法也大體相同。例如：PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億(230)個(gè)這樣的片段。 4．當(dāng)PCR反應(yīng)體系的溫度經(jīng)快速冷卻到50℃左右時(shí)，為什么一般不考慮解開的2個(gè)DNA模板鏈又重新結(jié)合了，這是為什么？ 原因是：(1)模板DNA比引物長(zhǎng)得多、復(fù)雜得多、不易重新

4、結(jié)合； (2)引物和模板之間的碰撞機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞； (3)加入的引物的量足夠大而模板鏈數(shù)量少，模板鏈濃度低，不易結(jié)合。 5．為什么PCR能有廣泛用途？除用于DNA擴(kuò)增外，還有哪些用途？ 在生物基因組中存在著許多差異，如物種之間的差異、基因表達(dá)上的時(shí)間差異、基因表達(dá)的地域或組織差異、變異后的差異、生理和病理變化引起的差異、遺傳的差異、雜交的差異等。但這些差異只有在DNA擴(kuò)增后才能被觀察出來。因此，PCR是這種差異的一種觀察方法，因而在法醫(yī)學(xué)上、在遺傳病和其他疾病的診斷、考古中人種的確定、食品質(zhì)量的確定上和基因轉(zhuǎn)移上都可使用。　　 6.PCR的反應(yīng)過程具體是怎樣的？

5、 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性(當(dāng)溫度上升到90 ℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈)、復(fù)性(溫度下降到50 ℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合)和延伸(溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈)三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。 第一輪的產(chǎn)物作為第二輪的模板,經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸三步 ↓ 第二

6、輪的產(chǎn)物作為第三輪的模板,經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸三步 ↓ 題例領(lǐng)悟TILILINGWU 【例題1】 一個(gè)由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，利用PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的DNA分子占總數(shù)的(　　) A．1/10　B．1/5 C．1/16 D．1/25 解析：一個(gè)DNA分子利用PCR技術(shù)循環(huán)5次后產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為2n。而DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制，其特點(diǎn)是新形成的DNA雙鏈，一條是來自親代DNA分子的母鏈，另一條是新形成的子鏈。這樣最初由15N標(biāo)記的DNA分子復(fù)制后，其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代DNA分子中，這樣兩個(gè)子代DNA分子被標(biāo)記了。以后均是

7、在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，不論經(jīng)過多少次復(fù)制，最初標(biāo)記的兩條鏈?zhǔn)冀K存在于兩個(gè)DNA分子中，這樣經(jīng)過n次循環(huán)后，標(biāo)記的DNA分子中的2/2n，即1/2n－1。 答案：C PCR技術(shù)的實(shí)質(zhì)就是DNA分子的復(fù)制。 【例題2】 DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是…(　　) A．可加快DNA的復(fù)制速度 B．引物可與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合 C．引物的5′端有助于DNA聚合酶的延伸DNA鏈 D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈 解析：DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(—OH)末端稱為3′端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5′端。DNA聚合酶不

8、能從5′端開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。 答案：D DNA復(fù)制是有方向的，只能由3′端延伸至5′端，而不能倒過來。 隨堂訓(xùn)練SUITANGXUNLIAN 11個(gè)PCR循環(huán)后，一個(gè)由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，可產(chǎn)生幾個(gè)含15N標(biāo)記的DNA分子(　　) A．1個(gè)　B．23＝8個(gè) C．2個(gè) D．4個(gè) 答案：C　解析：PCR的1次循環(huán)，相當(dāng)于1個(gè)DNA分子復(fù)制了1次。因?yàn)镈NA的復(fù)制為半保留復(fù)制，所以形成了2個(gè)帶標(biāo)記的DNA分子。 2DNA復(fù)制需要引物，在引物的輔助下，DNA的復(fù)制(延伸)方向是怎樣的(　　) A．由3′端延伸至5′端 B．由5′端延伸至3′端 C．由3′端和5′端都可以延伸 D．由DNA分子的中間氫鍵處開始延伸 答案：B　解析：由于DNA聚合酶只能由引物的3′端延伸DNA鏈，而DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，所以引物?′端對(duì)應(yīng)DNA子鏈的5′端，所以從子鏈的5′端向3′端延伸。 5