《酶生物化學(xué)》PPT課件.ppt

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1、第二章酶 (Enzyme),1.酶的概念 酶是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化作用和高度專一性的特殊蛋白質(zhì)。簡單說，酶是一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的生物催化劑。,一、酶的概念,2.酶催化作用的特點(diǎn) (1) 酶和一般催化劑的共性： 加快反應(yīng)速度； 不改變平衡常數(shù)； 自身不參與反應(yīng)。 (2) 酶催化作用特性： 條件溫和：常溫、常壓、pH=7； 高效率：反應(yīng)速度與不加催化劑相比可提高108 1020，與加普通催化劑相比可提高1071013； 專一性：即酶只能對(duì)特定的一種或一類底物起作用，這種專一性是由酶蛋白的立體結(jié)構(gòu)所決定的。可分為： 絕對(duì)專一性：有些酶只作用于一種底物，催化一個(gè)反應(yīng)， 而不作用于任何其它物質(zhì)。

2、 相對(duì)專一性：這類酶對(duì)結(jié)構(gòu)相近的一類底物都有作用。包括鍵專一性和簇（基團(tuán)）專一性。 立體異構(gòu)專一性：這類酶不能辨別底物不同的立體異構(gòu)體，只對(duì)其中的某一種構(gòu)型起作用，而不催化其他異構(gòu)體。包括旋光異構(gòu)專一性和幾何異構(gòu)專一性。 易變敏感性：易受各種因素的影響，在活細(xì)胞內(nèi)受到精密嚴(yán)格的調(diào)節(jié)控制。,二、酶的化學(xué)本質(zhì)及結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn),1.發(fā)展史 (1)酶是蛋白質(zhì): 1926年,James Summer由刀豆制出脲酶結(jié)晶確立酶是蛋白質(zhì)的觀念，其具有蛋白質(zhì)的一切性質(zhì)。 (2)核酶的發(fā)現(xiàn)： 19811982年，Thomas R.Cech實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有催化活性的天然RNARibozyme。 L19 RNA和核糖核酸酶P

3、的RNA組分具有酶活性是兩個(gè)最著名的例子。 1955年，發(fā)現(xiàn)DNA的催化活性。 (3)抗體酶（abzyme）： 1986年，Richard Lerrur和Peter Schaltz運(yùn)用單克隆抗體技術(shù)制備了具有酶活性的抗體（catalytic antibody）。,酶,單成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。,雙成份酶,酶蛋白,輔因子,（簡單蛋白質(zhì)）,（結(jié)合蛋白質(zhì)）,（apoenzyme）,（cofacter),輔酶（coenzyme),輔基(prosthetic group),全酶(holoenzyme）= 酶蛋白 + 輔因子,2.酶的組成,3.酶的輔因子 酶的輔因子是酶的對(duì)熱穩(wěn)定的非蛋

4、白小分子物質(zhì)部分，其主要作用是作為電子、原子或某些基團(tuán)的載體參與反應(yīng)并促進(jìn)整個(gè)催化過程。 (1)傳遞電子體：如 卟啉鐵、鐵硫簇； (2)傳遞氫（遞氫體）：如 FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸； (3)傳遞?；w：如 C0A、TPP、硫辛酸； (4)傳遞一碳基團(tuán)：如 四氫葉酸； (5)傳遞磷酸基：如 ATP，GTP； (6)其它作用： 轉(zhuǎn)氨基，如 VB6 ；傳遞CO2，如 生物素。,維生素和輔酶 維生素是機(jī)體維持正常生命活動(dòng)所必不可少的一類小分子有機(jī)物質(zhì)。 多數(shù)維生素維生素作為輔酶和輔基的組成成分，參與體內(nèi)的物質(zhì)代謝。 維生素一般習(xí)慣分為脂溶性和水溶性兩大類。其中脂溶性維生素在體

5、內(nèi)可直接參與代謝的調(diào)節(jié)作用，而水溶性維生素是通過轉(zhuǎn)變成輔酶對(duì)代謝起調(diào)節(jié)作用。 某些小分子有機(jī)化合物與酶蛋白結(jié)合在一起并協(xié)同實(shí)施催化作用，這類分子被稱為輔酶（或輔基）。 輔酶是一類具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的化合物。參與的酶促反應(yīng)主要為氧化-還原反應(yīng)或基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)。 大多數(shù)輔酶的前體主要是水溶性 B 族維生素。許多維生素的生理功能與輔酶的作用密切相關(guān)。,脂溶性維生素 維生素A,D,E,K均溶于脂類溶劑，不溶于水，在食物中通常與脂肪一起存在，吸收它們，需要脂肪和膽汁酸。 維生素A 維生素A分A1, A2兩種，是不飽和一元醇類。維生素A1又稱為視黃醇，A2稱為脫氫視黃醇。 主要功能：維持上皮組織健康及正

6、常視覺，促進(jìn)年幼動(dòng)物的正常生長。,維生素D 維生素D是固醇類化合物，主要有D2,D3, D4, D5。其中D2,D3活性最高。,維生素D的結(jié)構(gòu) 在生物體內(nèi)，D2和D3本身不具有生物活性。它們?cè)诟闻K和腎臟中進(jìn)行羥化后，形成1，25-二羥基維生素D。其中1，25-二羥基維生素D3是生物活性最強(qiáng)的。 主要功能：調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，維持血液中鈣、磷濃度正常，促使骨骼正常發(fā)育。,維生素E 維生素E又叫做生育酚，目前發(fā)現(xiàn)的有6種，其中，四種有生理活性。 主要功能：具有抗氧化劑的功能，可作為食品添加劑使用，還可保護(hù)細(xì)胞膜的完整性；同時(shí)還有抗不育的作用。,維生素K 維生素K有3種：K1,K2,K3。其中K3是人工

7、合成的。維生素K是2-甲基萘醌的衍生物。 主要功能：促進(jìn)肝臟合成凝血酶原，促進(jìn)血液的凝固。,水溶性維生素 維生素B1和羧化輔酶 維生素B1又稱硫胺素，在體內(nèi)以焦磷酸硫胺素(TPP)形式存在。缺乏時(shí)表現(xiàn)出多發(fā)性神經(jīng)炎、皮膚麻木、心力衰竭、四肢無力、下肢水腫。,焦磷酸硫胺素(TPP)是脫羧酶的輔酶，催化丙酮酸或酮戊二酸的氧化脫羧反應(yīng)，所以又稱為羧化輔酶。,維生素B2和黃素輔酶 維生素B2又稱核黃素，由核糖醇和6，7-二甲基異咯嗪兩部分組成。 缺乏時(shí)組織呼吸減弱，代謝強(qiáng)度降低。主要癥狀為口腔發(fā)炎，舌炎、角膜炎、皮炎等。,FAD(黃素-腺嘌呤二核苷酸)和FMN(黃素單核苷酸)是核黃素(維生素B2)的衍

8、生物。它們?cè)诿摎涿复呋难趸?還原反應(yīng)中，起著電子和質(zhì)子的傳遞體作用。,泛酸和輔酶A（CoA） 維生素B3又稱泛酸，是由,-二羥基-二甲基丁酸和一分子-丙氨酸縮合而成。,輔酶A是生物體內(nèi)代謝反應(yīng)中乙?；傅妮o酶，它是含泛酸的復(fù)合核苷酸。它的重要生理功能是傳遞?；切纬纱x中間產(chǎn)物的重要輔酶。,維生素PP和輔酶I、輔酶II 維生素PP包括尼克酸（又稱煙酸）和尼克酰胺（又稱煙酰胺）兩種物質(zhì)。在體內(nèi)主要以尼克酰胺形式存在，尼克酸是尼克酰胺的前體。,尼克酸,尼克酰胺,維生素PP能維持神經(jīng)組織的健康。缺乏時(shí)表現(xiàn)出神經(jīng)營養(yǎng)障礙，出現(xiàn)皮炎。 NAD+ (煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又稱為輔酶I) 和NADP+

9、(煙酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又稱為輔酶II )是維生素?zé)燉０返难苌铮鼈兪嵌喾N重要脫氫酶的輔酶。,維生素B6和磷酸吡哆醛 維生素B6包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。 維生素B6在體內(nèi)經(jīng)磷酸化作用轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的磷酸脂，參加代謝的主要的是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺。磷酸吡哆醛是氨基酸轉(zhuǎn)氨作用、脫羧作用和消旋作用的輔酶。,生物素 生物素是B族維生素B7，它是多種羧化酶的輔酶。 生物素的功能是作為CO2的遞體，在生物合成中起傳遞和固定CO2的作用。,葉酸和葉酸輔酶 維生素B11又稱葉酸，作為輔酶的是葉酸加氫的還原產(chǎn)物四氫葉酸。 四氫葉酸的主要作用是作為一碳基團(tuán)，如-CH3, -CH2-, -CHO 等的載體

10、，參與多種生物合成過程。,維生素B12和B12輔酶 維生素B12又稱為鈷胺素。維生素B12分子中與Co+相連的CN基被5-脫氧腺苷所取代，形成維生素B12輔酶。 維生素B12輔酶的主要功能是作為變位酶的輔酶，催化底物分子內(nèi)基團(tuán)(主要為甲基)的變位反應(yīng)。,維生素C 維生素C能防治壞血病，故又稱抗壞血酸。在體內(nèi)參與氧化還原反應(yīng)，羥化反應(yīng)。人體不能合成。,硫辛酸 硫辛酸是少數(shù)不屬于維生素的輔酶。硫辛酸是6,8-二硫辛酸，有兩種形式：即硫辛酸（氧化型）和二氫硫辛酸（還原型）。,輔酶Q（CoQ） 輔酶Q又稱為泛醌，廣泛存在與動(dòng)物和細(xì)菌的線粒體中。 輔酶Q的活性部分是它的醌環(huán)結(jié)構(gòu)，主要功能是作為線粒體呼吸

11、鏈氧化-還原酶的輔酶，在酶與底物分子之間傳遞電子。,4.酶結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu) 根據(jù)結(jié)構(gòu)不同酶可分為： 單體酶：只有單一的三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成。 寡聚酶：由多個(gè)（兩個(gè)以上）具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的亞基聚合而成。 多酶復(fù)合體：由幾個(gè)功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體。,與催化作用相關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) (1)活性中心：酶分子中直接和底物結(jié)合并起催化反應(yīng)的空間局限（部位）。,結(jié)合部位(Binding site)：酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。,催化部位(Catalytic site): 酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。 通常將酶的結(jié)合部位和催化部位

12、總稱為酶的活性部位或活性中心。 結(jié)合部位決定酶的專一性， 催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。,調(diào)控部位(Regulatory site):酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對(duì)酶起激活或抑制作用,(2)必須基團(tuán)：酶表現(xiàn)催化活性不可缺少的基團(tuán)。 親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。 酸堿性基團(tuán)：門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。,親核性基團(tuán),酸堿性基團(tuán),(3)酶原和酶原的激活： 酶原：沒有活性的酶的前體。 酶原的激活：酶原在一定條件下經(jīng)適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)作用可轉(zhuǎn)變成有活性的酶。酶

13、原轉(zhuǎn)變成酶的過程稱為酶原的激活。 本質(zhì)：酶原的激活實(shí)質(zhì)上是酶活性部位形成或暴露的過程。 (4)同功酶：能催化同一化學(xué)反應(yīng)的一類酶。 活性中心相似或相同：催化同一化學(xué)反應(yīng)。 分子結(jié)構(gòu)不同：理化性質(zhì)和免疫學(xué)性質(zhì)不同。,三、酶的分類及命名,1. 酶的分類 氧化-還原酶 Oxidoreductase 氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)。 主要包括脫氫酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。 如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。,(2) 轉(zhuǎn)移酶 Transferase 轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨

14、基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。,水解酶 Hydrolase 水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng),(4) 裂解酶 Lyase 裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或 原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。 主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。,(5) 異構(gòu)酶 Isomerase 異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)。,(6) 合成酶 Ligase or Synthetase 合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-

15、S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。 A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng) 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,核酸酶（催化核酸） Ribozyme 核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應(yīng)。,2. 酶的命名,(1)習(xí)慣命名法: 根據(jù)其催化底物來命名； 根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名； 結(jié)合上述兩個(gè)原則來命名； 有時(shí)在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點(diǎn)。,(2)國際系統(tǒng)命名法 系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構(gòu)型、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。例如： 習(xí)慣名稱:谷丙轉(zhuǎn)氨酶 系統(tǒng)名稱:

16、丙氨酸：-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶 酶催化的反應(yīng): 谷氨酸 + 丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙氨酸,1.酶催化作用的本質(zhì)：降低反應(yīng)活化能 2.酶催化作用的中間產(chǎn)（絡(luò)合）物學(xué)說 在酶催化的反應(yīng)中，第一步是酶與底物形成酶底物中間復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學(xué)變化后，中間復(fù)合物再分解成產(chǎn)物和酶。 E + S = E-S P + E 許多實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明了ES復(fù)合物的存在。ES復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)有關(guān)。,四、酶作用的機(jī)制,3.酶與底物結(jié)合形成中間絡(luò)合物的方式（理論） (1)鎖鑰假說(lock and key hypothesis)： 認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。

17、酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣 (2)誘導(dǎo)契合假說（inducedfit hypothesis): 該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀.,4. 使酶具有高效催化的因素 (1)臨近定向效應(yīng)： 在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度； 另一方面，由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn)。 (2)“張力”和“形變” ： 底物與酶結(jié)合誘導(dǎo)酶的分子構(gòu)象變化，變化的酶分子又使底物分子的敏感鍵

18、產(chǎn)生“張力”甚至“形變” ，從而促使酶底物中間產(chǎn)物進(jìn)入過渡態(tài)。,(3)酸堿催化： 酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸堿催化方式。 廣義酸堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過程。 酶活性部位上的某些基團(tuán)可以作為良好的質(zhì)子供體或受體對(duì)底物進(jìn)行酸堿催化。 His 殘基的咪唑基是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個(gè)催化功能團(tuán)。,廣義酸基團(tuán) 廣義堿基團(tuán) （質(zhì)子供體） （質(zhì)子受體）,(4)共價(jià)催化： 催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價(jià)催化。

19、 酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括 His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等。 某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用。,1.底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響 在酶濃度，pH，溫度等條件不變的情況下研究底物濃度和反應(yīng)速度的關(guān)系。如右圖所示： 在低底物濃度時(shí), 反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征。 當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。,五、酶促反應(yīng)的速度及其影響因素,米氏方程 1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說對(duì)

20、酶促反映的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。,Km 米氏常數(shù) Vmax 最大反應(yīng)速度,根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:,米氏方程的推導(dǎo)：,米氏常數(shù)Km的意義:,由米氏方程可知，當(dāng)反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時(shí),即V = 1/2 Vmax, Km = S 上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。 因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。 Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。 Km值表示酶與底物之間的親和程度：

21、Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。,測(cè)定Km和V的方法很多，最常用的是LineweaverBurk的作圖法 雙倒數(shù)作圖法。,1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax,取米氏方程式的倒數(shù)形式：,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,-1/Km,米氏常數(shù)Km的測(cè)定：,2.抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響 有些物質(zhì)能與酶分子上某些必須基團(tuán)結(jié)合（作用),使酶的活性中心的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活力下降或喪失，這種現(xiàn)象稱為酶的抑制作用。 能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑（inhibitor)。 酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)： a.在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與被

22、抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。 b.能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。,抑制作用的類型： (1)不可逆抑制作用： 抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以共價(jià)形式結(jié)合，引起酶的永久性失活。如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。,(2)可逆抑制作用： 抑制劑與酶蛋白以非共價(jià)方式結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性。 根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，又可以分為三類： 競(jìng)爭性抑制： 某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。 竟?fàn)幮?/p>

23、抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競(jìng)爭能力來消除。 競(jìng)爭性抑制可用下式表示：,有競(jìng)爭性抑制劑存在時(shí)，Km值增大(1+I/Ki)倍，且Km值隨I的增高而增大； 在E固定時(shí)，當(dāng)S Km (1+I/Ki), Km (1+I/Ki)項(xiàng)可忽略不計(jì)，則v= Vmax，即最大反應(yīng)速度不變。,競(jìng)爭性抑制作用的速度方程：,競(jìng)爭性抑制作用的LineweaverBurk圖 ：,非競(jìng)爭性抑制： 酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競(jìng)爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競(jìng)爭性抑制劑。 如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控

24、部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競(jìng)爭性抑制。 非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。 非競(jìng)爭性抑制可用下式表示：,有非競(jìng)爭性抑制劑存在時(shí)，V值減小(1+I/Ki)倍，且V值隨I的增高而降低； Km值不變。,非競(jìng)爭性抑制作用的速度方程：,非競(jìng)爭性抑制作用的LineweaverBurk圖 ：,有反競(jìng)爭性抑制劑存在時(shí)，Km和V值均減小(1+I/Ki)倍，且都隨I的增高而降低。,反競(jìng)爭性抑制： 酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，引起酶活性下降。 反競(jìng)爭性抑制可用下式表示： 反競(jìng)爭性抑制作用的速度方程：,反競(jìng)爭性抑制作用的LineweaverBurk圖 ：,3.激活劑對(duì)酶反

25、應(yīng)的影響 凡是能提高酶活力的簡單化合物都稱為激活劑（activator)。其中大部分是一些無機(jī)離子和小分子簡單有機(jī)物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等； 這些離子可與酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合，可能是酶活性部位的組成部分，也可能作為輔酶或輔基的一個(gè)組成部分起作用； 一般情況下，一種激活劑對(duì)某種酶是激活劑，而對(duì)另一種酶則起抑制作用； 對(duì)于同一種酶，不同激活劑濃度會(huì)產(chǎn)生不同的作用。 4.酶濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響 在底物足夠過量而其它條件固定的情況下，并且反應(yīng)系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物質(zhì)及其他不利

26、于酶發(fā)揮作用的因素時(shí)，酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比。,5.溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響 一方面是溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快。 另一方面,溫度升高,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。 因此大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。 在最適溫度條件下,反應(yīng)速度最大。,最適溫度,6.pH對(duì)酶反應(yīng)的影響 在一定的pH下, 酶具有最大的催化活性,通常稱此pH為最適pH。,7.酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng)： 由于效應(yīng)物的存在，而引起酶的結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）變化。 別構(gòu)酶(Allosteric enzyme)的特點(diǎn)： 一般是寡聚酶，由多亞基組成，包括催化部位和調(diào)節(jié)（別構(gòu)）部位； 具有別構(gòu)效應(yīng)。指酶和一個(gè)配體（底物，調(diào)節(jié)物）結(jié)合后

27、可以影響酶和另一個(gè)配體（底物）的結(jié)合能力。,相同（均為底物）：同促效應(yīng)（homotropic effect）,不同（效應(yīng)調(diào)節(jié)物）：異促效應(yīng)（heterotropic effect）,根據(jù)配體結(jié)合后對(duì)后繼配體的影響,根據(jù)配體性質(zhì),正協(xié)同效應(yīng)（positive cooperative effect）,負(fù)協(xié)同效應(yīng)（negative cooperative effect）,動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)：不符合米曼方程雙曲線。,別構(gòu)酶與非調(diào)節(jié)酶動(dòng)力學(xué)曲線的比較,別構(gòu)酶舉例：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，簡稱ATCase,8.固定化酶 固定化酶是通過吸附、耦聯(lián)、交聯(lián)和包埋等物理或化學(xué)的方法把酶連接到某種載體上，做成仍具有酶催化活性的

28、水不溶性酶。 作用特點(diǎn)：穩(wěn)定性提高，易分離，可反復(fù)使用，提高操作的機(jī)械強(qiáng)度。,六、酶的分離純化與酶活力測(cè)定,1.酶的分離純化 基本原則：提取過程中避免酶變性而失去活性；防止強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和劇烈攪拌等；要求在低溫下操作，加入的化學(xué)試劑不使酶變性，操作中加入緩沖溶液. 基本操作程序： 選材：微生物（微生物發(fā)酵物: 胞內(nèi)酶，胞外酶），動(dòng)物（動(dòng)物器臟：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶等）。 抽提：加入提取液提取。胞內(nèi)酶先要進(jìn)行細(xì)胞破碎（機(jī)械研磨，超聲波破碎，反復(fù)凍融或自溶等）， 分離：先進(jìn)行凈化處理（過濾，絮凝，離心脫色），再采用沉淀法分離（鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀

29、法，超離心等）。 純化：可采用離子交換層析，凝膠過濾，液相色譜，親和色譜和超濾等方法。,酶的制劑形式： 固體：干燥（冰凍升華，噴霧干燥，真空干燥） 液體 保存：低溫下短期保存。 2.酶活力的測(cè)定 概念 酶活力：又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度來表示。 基本原理:酶是蛋白質(zhì)，種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，一般對(duì)酶的測(cè)定，不是直接測(cè)定其酶蛋白的濃度，而是測(cè)定其催化化學(xué)反應(yīng)的能力，這是基于在最優(yōu)化條件下，當(dāng)?shù)孜镒銐颍ㄟ^量），在酶促反應(yīng)的初始階段，酶促反應(yīng)的速度（初速度）與酶的濃度成正比（即V=KE），故酶活力測(cè)定的是化學(xué)反應(yīng)速度，一定條件下可代

30、表酶活性分子濃度。,酶活力測(cè)定 酶活力測(cè)定就是測(cè)定一定量的酶，在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物(P)的生成（增加）量或底物（S）的消耗（減少）量。即測(cè)定時(shí)確定三種量：加入一定量的酶；一定時(shí)間間隔；物質(zhì)的增減量。 測(cè)定酶活力常有以下幾種方法： 在一個(gè)反應(yīng)體系中，加入一定量的酶液，開始計(jì)時(shí)反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間反應(yīng)后，終止反應(yīng)，測(cè)定在這一時(shí)間間隔內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)量（終止時(shí)與起始時(shí)的濃度差），這時(shí)測(cè)得的是初速度。 在一定條件下，加入一定量底物（規(guī)定），再加入合適量的酶液，測(cè)定完成該反應(yīng)（底物反應(yīng)完）所需的時(shí)間，（非初速度，為一平均速度）。 動(dòng)態(tài)連續(xù)測(cè)定法。在反應(yīng)體系中，加入酶，用儀器連續(xù)監(jiān)測(cè)整個(gè)酶促反應(yīng)過程中底物的消耗或

31、產(chǎn)物的生成。 快速反應(yīng)追蹤法。近年來，追蹤極短時(shí)間（10-3s以下）內(nèi)反應(yīng)過程的方法和裝置已經(jīng)應(yīng)用。其代表有停流法（stopped-flow）和溫度躍變法（temperature jump）。 酶反應(yīng)條件優(yōu)化： 測(cè)酶活所用的反應(yīng)條件應(yīng)該是最適條件，所謂最適條件包括最適溫度、最適pH、足夠大的底物濃度、適宜的離子強(qiáng)度、適當(dāng)稀釋的酶液及嚴(yán)格的反應(yīng)時(shí)間，抑制劑不可有，輔助因子不可缺。,酶活力測(cè)定方法： 反應(yīng)計(jì)時(shí)。反應(yīng)計(jì)時(shí)必須準(zhǔn)確。反應(yīng)體系必須預(yù)熱至規(guī)定溫度后，加入酶液并立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)到時(shí)，要立即滅酶活性，終止反應(yīng)，并記錄終了時(shí)間。終止酶反應(yīng)，常使酶立刻變性，最常用的方法是加入三氯乙酸或過氯酸使酶蛋白

32、沉淀，也可用SDS使酶變性，或迅速加熱使酶變性。有些酶可用非變性法來停止反應(yīng)或用破壞其輔因子來停止反應(yīng) 。 反應(yīng)量的測(cè)定。測(cè)底物減少量或產(chǎn)物生成量均可。在反應(yīng)過程中產(chǎn)物是從無到有，變化量明顯，極利于測(cè)定，所以大都測(cè)定產(chǎn)物的生成量。 具體物質(zhì)量的測(cè)定，據(jù)被測(cè)定物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)通過定量分析法測(cè)定。常用的方法有： 光譜分析法：酶將產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄖ苯踊蜷g接）一個(gè)可用分光光度法或熒光光度法測(cè)出的化合物。 化學(xué)法：利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物變成一個(gè)可用某種物理方法測(cè)出的化合物，然后再反過來算出酶的活性。 放射性化學(xué)法：用同位素標(biāo)記的底物，經(jīng)酶作用后生成含放射性的產(chǎn)物，在一定時(shí)間內(nèi)，生成的放射性產(chǎn)物量與酶活性成正比

33、。,3.酶活力的表示方法及計(jì)算 酶活力單位 酶活力可用單位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量表示，單位為mol/min等。 酶活力單位的基本定義為：規(guī)定條件（最適條件）下一定時(shí)間內(nèi)催化完成一定化學(xué)反應(yīng)量所需的酶量。 據(jù)不同情況有幾種酶活力單位（activity unit）或又稱酶單位（enzyme unit）。 國際單位： 一般用活力單位U（Unit）表示，許多酶活力單位都是以最佳條件或某一固定條件下每分鐘催化生成1mol產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。,一個(gè)“Katal”單位是指在一定條件下1秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量。 Kat和U的換算關(guān)系：1 Kat=6107U，1U=1

34、6067n Kat 以上的酶單位定義中，如果底物（S）有一個(gè)以上可被作用的化學(xué)鍵，則一個(gè)酶單位表示1分鐘使1mol有關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)化的酶量。如果是兩個(gè)相同的分子參加反應(yīng)，則每分鐘催化2mol底物轉(zhuǎn)化的酶量稱為一個(gè)酶單位。 在“U”和“kat”酶活力單位的定義和應(yīng)用中，酶催化底物的分子量必須是已知的，否則將無法計(jì)算。 習(xí)慣單位： 在實(shí)際使用中，結(jié)果測(cè)定和應(yīng)用都比較方便、直觀，規(guī)定的酶活力單位，不同酶有各自的規(guī)定，如： -淀粉酶活力單位：每小時(shí)分解1g可溶性淀粉的酶量為一個(gè)酶單位。（QB546-80），也有規(guī)定每小時(shí)分解1mL2%可溶性淀粉溶液為無色糊精的酶量為一個(gè)酶單位。顯然后者比前一個(gè)單位小。 糖化

35、酶活力單位：在規(guī)定條件下，每小時(shí)轉(zhuǎn)化可溶性淀粉產(chǎn)生1mg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量為一個(gè)酶單位。 蛋白酶：規(guī)定條件下，每分鐘分解底物酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸所需的酶量。 DNA限制性內(nèi)切酶：推薦反應(yīng)條件下，一小時(shí)內(nèi)可完全消化1g純化的DNA所需的酶量。,比活力（specific activity） 酶的比活力是每單位（一般是mg）蛋白質(zhì)中的酶活力單位數(shù)（如：酶單位/mg蛋白），實(shí)際應(yīng)用中也用每單位制劑中含有的酶活力數(shù)表示（如：酶單位/mL（液體制劑），酶單位/g（固體制劑），對(duì)同一種酶來講，比活力愈高則表示酶的純度越高（含雜質(zhì)越少），所以比活力是評(píng)價(jià)酶純度高低的一個(gè)指標(biāo)。 在評(píng)價(jià)純化酶的純化操

36、作中，還有一個(gè)概念就是回收率。 回收率=某純化操作后的總活力/某純化操作前的總活力 總活力=比活力總體積（總重量） 酶活力計(jì)算及計(jì)算舉例 酶活力計(jì)算是將實(shí)驗(yàn)中所用各種參數(shù)和所測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（反應(yīng)時(shí)間、酶液稀釋度和用量、產(chǎn)物生成量等）換算成每毫升（或每克）酶制劑中所含的酶活力單位數(shù)。 酶活力測(cè)定舉例：福林-酚（Lowry）法測(cè)定蛋白酶活力。該方法的基本原理是以酪蛋白為底物進(jìn)行反應(yīng)，然后用福林-酚試劑顯色，并用光度法測(cè)定酶促反應(yīng)產(chǎn)物酪氨酸的生成量。測(cè)定在初速度階段進(jìn)行，為初速度法。 ,本章小結(jié),一、酶 酶的概念 酶催化作用的特點(diǎn) 共性 特性：條件溫和、高效率、專一性、易變敏感性 二、酶的化學(xué)本質(zhì)及

37、結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn) 酶： 單純酶 結(jié)合酶：全酶 = 酶蛋白 + 輔因子 酶的輔因子 維生素和輔酶 維生素是機(jī)體維持正常生命活動(dòng)所必不可少的一類小分子有機(jī)物質(zhì)。 維生素一般習(xí)慣分為脂溶性和水溶性兩大類。 輔酶是一類具有特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能的化合物。參與的酶促反應(yīng)主要為氧化-還原反應(yīng)或基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)。 大多數(shù)輔酶的前體主要是水溶性 B 族維生素。許多維生素的生理功能與輔酶的作用密切相關(guān)。,酶結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn) (1)活性中心：結(jié)合部位、催化部位、調(diào)控部位 (2)必須基團(tuán) (3)酶原和酶原的激活 (4)同功酶 三、酶的分類及命名 四、酶作用的機(jī)制 1.酶催化作用的本質(zhì)：降低反應(yīng)活化能 2.酶催化作用的中間產(chǎn)（絡(luò)合

38、）物學(xué)說 E + S = E-S P + E 3.酶與底物結(jié)合形成中間絡(luò)合物的方式：鎖鑰假說、誘導(dǎo)契合假說 4. 使酶具有高效催化的因素 臨近定向效應(yīng) “張力”和“形變” 酸堿催化 共價(jià)催化,五、酶促反應(yīng)的速度及其影響因素 1.底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 米氏方程 米氏常數(shù)Km的意義:米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。米氏常數(shù)的單位為mol/L。 Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。,2.抑制劑對(duì)酶反應(yīng)的影響 抑制作用的類型： 不可逆抑制作用 可逆抑制作用 競(jìng)爭性抑制 非競(jìng)爭性抑制 反競(jìng)爭性抑制,a,

39、b,c,3.激活劑對(duì)酶反應(yīng)的影響：提高酶活力 4.酶濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響:在一定條件下酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比。 5.溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響:最適溫度 6.pH對(duì)酶反應(yīng)的影響：最適pH 7.酶的別構(gòu)（變構(gòu)）效應(yīng) 別構(gòu)酶的特點(diǎn)： 一般是寡聚酶 具有別構(gòu)效應(yīng) 反應(yīng)速度和底物濃度關(guān)系不符合米曼方程雙曲線 8.固定化酶 六、酶的分離純化與酶活力測(cè)定 1.酶的分離純化 基本原則：提取過程中避免酶變性而失去活性 基本操作程序： 選材 抽提 分離 純化 酶的制劑形式與保存,2.酶活力的測(cè)定 概念 酶活力：又稱為酶活性，一般把酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活力，通常以在一定條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度來表示。

40、酶活力測(cè)定就是測(cè)定一定量的酶，在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物(P)的生成（增加）量或底物（S）的消耗（減少）量。即測(cè)定時(shí)確定三種量：加入一定量的酶；一定時(shí)間間隔；物質(zhì)的增減量。 測(cè)定酶活力常有以下幾種方法 初速度法 平均速度法 動(dòng)態(tài)連續(xù)測(cè)定法 快速反應(yīng)追蹤法 測(cè)酶活所用的反應(yīng)條件應(yīng)該是最適條件,酶活力測(cè)定方法： 反應(yīng)計(jì)時(shí) 反應(yīng)量的測(cè)定：根據(jù)被測(cè)定物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)通過定量 分析法測(cè)定。常用的方法有：光譜分析法、化學(xué)法和放射性化學(xué)法。 3.酶活力的表示方法及計(jì)算 酶活力單位的基本定義為：規(guī)定條件（最適條件）下一定時(shí)間內(nèi)催化完成一定化學(xué)反應(yīng)量所需的酶量。 國際單位： “U” 和 “Kat” 習(xí)慣單位 比活力：酶的比活力是每單位（一般是mg）蛋白質(zhì)中的酶活力單位數(shù)（如：酶單位/mg蛋白）。 回收率=某純化操作后的總活力/某純化操作前的總活力,