PCR和DNP標(biāo)記核酸探針檢測(cè)禽源沙門氏菌四環(huán)素耐藥性基因tetC的研

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1、PCR和DNP標(biāo)記核酸探針檢測(cè)禽源沙門氏菌四環(huán)素耐藥性基因tetC的研 　　目的觀察利用PCR和DNP標(biāo)記核酸探針檢測(cè)禽源沙門氏菌四環(huán)素耐藥性基因tetC。方法通過(guò)對(duì)臨床分離并經(jīng)生化實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)鑒定的11株禽源沙門氏菌和1株標(biāo)準(zhǔn)株C79-13進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果有11株有高耐藥性，另外1株有低耐藥性，耐藥率達(dá)100%；對(duì)其四環(huán)素耐藥基因tetC進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果獲得以質(zhì)粒為模板的特異性產(chǎn)物，與藥敏試驗(yàn)符合率為100%；用DNP標(biāo)記其PCR產(chǎn)物，制成DNA探針，采用菌落雜交方法對(duì)12株沙門氏菌菌落進(jìn)行雜交。結(jié)果顯示：與PCR結(jié)果的陽(yáng)性符合率為90.2%，具有很高的特異性。結(jié)論

2、利用PCR和用DNP標(biāo)記的這種探針檢測(cè)四環(huán)素耐藥基因tetC具有很高的敏感性和特異性，從而為禽類沙門氏菌的耐藥性檢測(cè)提供了高效敏感的手段。 沙門氏菌；四環(huán)素耐藥基因；TetC； PCR；核酸探針 Study on detection of tetracycline resistance gene(tetC) of avian pathogenic Salmonellaby PCR and DNP labeled nucleic acid probe ObjectiveBy using clinical isolates and biochemical and sero

3、logic tests detection on 11 avian Salmonella strains and one standard Salmonella C19-13, the drug-susceptibility test shows that: 11 strains are with high resistance, another 1 is low.MethodsResultsThe drug-susceptibility tests also shows that the rate is 100%. After amplifying the tetracycline-resi

4、stance gene, it produces specific material by plasmids complete and the concordance rate to drug-susceptibility test is 100%. By using the method of probing the tetC gene labeled with DNP and use colony hybridization to 12 strains, the method of PRC showed 90.2% concordance in positive rate and with

5、 high speciality. ConclusionThe result indicates that the probe of tetC gene with PCR to detect tetracycline-resistant gene has the character of susceptibility and speciality. The paper will provides effective and exact methods to detect the drug-resistance of avian Salmonella. Salmonella; tetr

6、acycline-resistant gene; tetC; PCR; nucleic acid probe 飼料中添加四環(huán)素類藥物和臨床上大量濫用四環(huán)素類藥物，被認(rèn)為是引起病原菌的耐藥性大量產(chǎn)生的原因［1］。四環(huán)素類藥物早在20世紀(jì)60～70年代就已廣泛應(yīng)用，尤其在獸醫(yī)的臨床上更是如此，所以導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類的耐藥性頗為嚴(yán)重，我國(guó)的情況更是如此?？股氐倪x擇性壓力、外源性耐藥質(zhì)粒的獲得、耐藥質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子在腸道菌間的傳遞等是耐藥菌株產(chǎn)生和不斷增多的主要原因，四環(huán)素耐藥性的產(chǎn)生常常是由于獲得了有關(guān)接合質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子中新的四環(huán)素耐藥基因tet。另外， 沙門氏菌還可以感染人和其他動(dòng)物，耐藥性

7、的研究，是關(guān)系到獸醫(yī)、食品衛(wèi)生和人類健康的嚴(yán)肅的問(wèn)題，絕不能掉以輕心。本文就禽源沙門氏菌的耐藥質(zhì)粒的四環(huán)素耐藥基因tetC 進(jìn)行了分子生物學(xué)水平診斷方面的研究。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1菌株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株：C79-13(購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所),藥敏質(zhì)控菌ATCC25922(購(gòu)自生物制品監(jiān)察所)，臨床上經(jīng)分離培養(yǎng)并經(jīng)細(xì)菌學(xué)和生化及血清學(xué)鑒定的禽源沙門氏菌11株(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院禽病研究所分離)。 1.1.2培養(yǎng)基及常規(guī)化學(xué)藥品和試劑四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素藥敏紙片(購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)；四硫磺酸鈉煌綠增菌培養(yǎng)基

8、、亞硒酸鹽胱氨酸增菌培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(由國(guó)產(chǎn)試劑自配)；腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管（購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司）、沙門氏菌屬診斷血清試劑盒（購(gòu)自成都生物制品研究所）。 1.1.3分子生物學(xué)試劑和用品100bp DNA Marker、PBR322、PUC18、Taq PCR試劑盒（購(gòu)自天為時(shí)代科技有限公司）；Biospin膠回收試劑盒（購(gòu)自Bioer Technology有限公司）；帶正電尼龍膜、硝酸纖維膜、雜交袋或雜交瓶、紫外交聯(lián)儀（購(gòu)自華美公司）；暴光盒（購(gòu)自粵華公司）；膠片（購(gòu)自柯達(dá)公司）；鮭魚(yú)精DNA、電泳級(jí)瓊脂糖（購(gòu)自寶生物工程有限公司）；

9、質(zhì)粒小提量試劑盒（購(gòu)自O(shè)MEGA生物科技公司）；TAE自配；HybQUESTComplete System(購(gòu)自美國(guó)Mirus生物公司)；X-ray光機(jī)(上海訊星電子科技公司)。 1.2方法 1.2.1病原菌的臨床分離和鑒定對(duì)于臨床上的疑似沙門氏菌病例，經(jīng)無(wú)菌接種和四硫磺酸鈉煌綠培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)以及SS培養(yǎng)和三糖鐵培養(yǎng)，再經(jīng)生化和血清學(xué)鑒定以確定沙門氏菌。具體方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)和參考文獻(xiàn)［1］。 1.2.2藥敏試驗(yàn)以大腸桿菌ATCC25922做藥敏質(zhì)控菌,采用瓊脂平板稀釋分別測(cè)定禽原沙門氏菌對(duì)四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素的MIC值。具體參考文獻(xiàn)參見(jiàn)［1］。

10、 1.2.3tetC基因的PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)Genebank中注冊(cè)的tetC的序列，用DNA Man軟件處理后，提交序列給大連寶生物公司，再用OLIGO6.0軟件設(shè)計(jì)四環(huán)素抗性基因TetC的引物。 LEFT PRIMER2259.8645.454.001.00 agattgtcacgaccacatcatc RIGHT PRIMER2260.1645.453.000.00 actttctaaggcagaccaacca 模板制備:用小提量的質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)進(jìn)口試劑盒，由天泰公司提供)，步驟按說(shuō)明書(shū)上的方法進(jìn)行，但需要優(yōu)化步驟。模板稀釋10倍。 對(duì)

11、照：以PBR322為陽(yáng)性對(duì)照，以PUC18作為陰性對(duì)照。50μl反應(yīng)體系：(1)模板DNA 1μl;(2)LEFT PRIMER 1μl、RIGHT PRIMER 1μl(貯存液稀釋10倍);(3)10Taq buffer 5μl;(4)dNTP mixture 4μl;(5)MgCl2 4μl;(6)Taq 1μl;(7)ddH2O 34μl。 反應(yīng)條件：Step1 94℃ 3min： Step2 94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)：Step3 72℃ 5min。 1.2.4tetC基因的序列分析試劑回收后，送大連寶生物公司測(cè)序，再與Geneba

12、nk中注冊(cè)的PBR322中的TetC基因序列在DNA Man軟件進(jìn)行比對(duì)，分析其同源性。 1.2.5DNP標(biāo)記核酸探針經(jīng)純化和回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNP標(biāo)記，制備成核酸探針。 標(biāo)記反應(yīng)體系(20μl)：(1)Diluted Sample DNA(14μl);(2)10Labeling Buffer A(2μl);(3)Label ITReagent(4μl)。 對(duì)照標(biāo)記反應(yīng)體系(20μl)：(1)Control DNA(8μl);(2)無(wú)核酶水(6μl);(3)10Labeling Buffer A(2μl);(4)Label ITReagent(4μl)。

13、 制法：稀釋2μl的Sample DNA至14μl，加它到盛有Label ITReagent的小瓶?jī)?nèi)，再加入2μl的10Labeling Buffer A，輕輕搖勻，37℃孵化1h后，利用乙醇沉淀法或使用G50微螺旋純化柱，從已標(biāo)記的DNA中除去未反應(yīng)的Label ITReagent，然后儲(chǔ)存在-20℃冰箱中備用。具體操作見(jiàn)文獻(xiàn)［2,3］以及標(biāo)記試劑盒說(shuō)明并經(jīng)優(yōu)化處理。 1.2.6細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)移在瓊脂平皿上(含有四環(huán)素的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基)接種細(xì)菌,經(jīng)培養(yǎng)后獲得所需要的大量的細(xì)菌克隆。準(zhǔn)備一些帶正電的尼龍膜，滅菌之后，把膜放在瓊脂平面上轉(zhuǎn)移細(xì)菌克隆到新的含有四環(huán)素的瓊脂平面上培養(yǎng)，孵育幾個(gè)小時(shí)(37℃)，然后經(jīng)細(xì)胞裂解、DNA變性和固定后，為雜交做好準(zhǔn)備，具體操作見(jiàn)文獻(xiàn)［2,3］以及標(biāo)記試劑盒說(shuō)明并經(jīng)優(yōu)化處理。