PCR和DNP標記核酸探針檢測禽源沙門氏菌四環(huán)素耐藥性基因tetC的研

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1、PCR和DNP標記核酸探針檢測禽源沙門氏菌四環(huán)素耐藥性基因tetC的研 　　目的觀察利用PCR和DNP標記核酸探針檢測禽源沙門氏菌四環(huán)素耐藥性基因tetC。方法通過對臨床分離并經(jīng)生化實驗和血清學試驗鑒定的11株禽源沙門氏菌和1株標準株C79-13進行藥敏試驗。結(jié)果有11株有高耐藥性，另外1株有低耐藥性，耐藥率達100%；對其四環(huán)素耐藥基因tetC進行了擴增，結(jié)果獲得以質(zhì)粒為模板的特異性產(chǎn)物，與藥敏試驗符合率為100%；用DNP標記其PCR產(chǎn)物，制成DNA探針，采用菌落雜交方法對12株沙門氏菌菌落進行雜交。結(jié)果顯示：與PCR結(jié)果的陽性符合率為90.2%，具有很高的特異性。結(jié)論

2、利用PCR和用DNP標記的這種探針檢測四環(huán)素耐藥基因tetC具有很高的敏感性和特異性，從而為禽類沙門氏菌的耐藥性檢測提供了高效敏感的手段。 沙門氏菌；四環(huán)素耐藥基因；TetC； PCR；核酸探針 Study on detection of tetracycline resistance gene(tetC) of avian pathogenic Salmonellaby PCR and DNP labeled nucleic acid probe ObjectiveBy using clinical isolates and biochemical and sero

3、logic tests detection on 11 avian Salmonella strains and one standard Salmonella C19-13, the drug-susceptibility test shows that: 11 strains are with high resistance, another 1 is low.MethodsResultsThe drug-susceptibility tests also shows that the rate is 100%. After amplifying the tetracycline-resi

4、stance gene, it produces specific material by plasmids complete and the concordance rate to drug-susceptibility test is 100%. By using the method of probing the tetC gene labeled with DNP and use colony hybridization to 12 strains, the method of PRC showed 90.2% concordance in positive rate and with

5、 high speciality. ConclusionThe result indicates that the probe of tetC gene with PCR to detect tetracycline-resistant gene has the character of susceptibility and speciality. The paper will provides effective and exact methods to detect the drug-resistance of avian Salmonella. Salmonella; tetr

6、acycline-resistant gene; tetC; PCR; nucleic acid probe 飼料中添加四環(huán)素類藥物和臨床上大量濫用四環(huán)素類藥物，被認為是引起病原菌的耐藥性大量產(chǎn)生的原因［1］。四環(huán)素類藥物早在20世紀60～70年代就已廣泛應用，尤其在獸醫(yī)的臨床上更是如此，所以導致細菌對四環(huán)素類的耐藥性頗為嚴重，我國的情況更是如此。抗生素的選擇性壓力、外源性耐藥質(zhì)粒的獲得、耐藥質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座子在腸道菌間的傳遞等是耐藥菌株產(chǎn)生和不斷增多的主要原因，四環(huán)素耐藥性的產(chǎn)生常常是由于獲得了有關接合質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子中新的四環(huán)素耐藥基因tet。另外， 沙門氏菌還可以感染人和其他動物，耐藥性

7、的研究，是關系到獸醫(yī)、食品衛(wèi)生和人類健康的嚴肅的問題，絕不能掉以輕心。本文就禽源沙門氏菌的耐藥質(zhì)粒的四環(huán)素耐藥基因tetC 進行了分子生物學水平診斷方面的研究。 1材料與方法 1.1材料 1.1.1菌株沙門氏菌標準株：C79-13(購自中國獸藥監(jiān)察所),藥敏質(zhì)控菌ATCC25922(購自生物制品監(jiān)察所)，臨床上經(jīng)分離培養(yǎng)并經(jīng)細菌學和生化及血清學鑒定的禽源沙門氏菌11株(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院禽病研究所分離)。 1.1.2培養(yǎng)基及常規(guī)化學藥品和試劑四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素藥敏紙片(購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司)；四硫磺酸鈉煌綠增菌培養(yǎng)基

8、、亞硒酸鹽胱氨酸增菌培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(由國產(chǎn)試劑自配)；腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管（購自杭州天和微生物試劑有限公司）、沙門氏菌屬診斷血清試劑盒（購自成都生物制品研究所）。 1.1.3分子生物學試劑和用品100bp DNA Marker、PBR322、PUC18、Taq PCR試劑盒（購自天為時代科技有限公司）；Biospin膠回收試劑盒（購自Bioer Technology有限公司）；帶正電尼龍膜、硝酸纖維膜、雜交袋或雜交瓶、紫外交聯(lián)儀（購自華美公司）；暴光盒（購自粵華公司）；膠片（購自柯達公司）；鮭魚精DNA、電泳級瓊脂糖（購自寶生物工程有限公司）；

9、質(zhì)粒小提量試劑盒（購自OMEGA生物科技公司）；TAE自配；HybQUESTComplete System(購自美國Mirus生物公司)；X-ray光機(上海訊星電子科技公司)。 1.2方法 1.2.1病原菌的臨床分離和鑒定對于臨床上的疑似沙門氏菌病例，經(jīng)無菌接種和四硫磺酸鈉煌綠培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)以及SS培養(yǎng)和三糖鐵培養(yǎng)，再經(jīng)生化和血清學鑒定以確定沙門氏菌。具體方法見試劑盒說明書和參考文獻［1］。 1.2.2藥敏試驗以大腸桿菌ATCC25922做藥敏質(zhì)控菌,采用瓊脂平板稀釋分別測定禽原沙門氏菌對四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素的MIC值。具體參考文獻參見［1］。

10、 1.2.3tetC基因的PCR引物設計：根據(jù)Genebank中注冊的tetC的序列，用DNA Man軟件處理后，提交序列給大連寶生物公司，再用OLIGO6.0軟件設計四環(huán)素抗性基因TetC的引物。 LEFT PRIMER2259.8645.454.001.00 agattgtcacgaccacatcatc RIGHT PRIMER2260.1645.453.000.00 actttctaaggcagaccaacca 模板制備:用小提量的質(zhì)粒提取試劑盒(美國進口試劑盒，由天泰公司提供)，步驟按說明書上的方法進行，但需要優(yōu)化步驟。模板稀釋10倍。 對

11、照：以PBR322為陽性對照，以PUC18作為陰性對照。50μl反應體系：(1)模板DNA 1μl;(2)LEFT PRIMER 1μl、RIGHT PRIMER 1μl(貯存液稀釋10倍);(3)10Taq buffer 5μl;(4)dNTP mixture 4μl;(5)MgCl2 4μl;(6)Taq 1μl;(7)ddH2O 34μl。 反應條件：Step1 94℃ 3min： Step2 94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)：Step3 72℃ 5min。 1.2.4tetC基因的序列分析試劑回收后，送大連寶生物公司測序，再與Geneba

12、nk中注冊的PBR322中的TetC基因序列在DNA Man軟件進行比對，分析其同源性。 1.2.5DNP標記核酸探針經(jīng)純化和回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNP標記，制備成核酸探針。 標記反應體系(20μl)：(1)Diluted Sample DNA(14μl);(2)10Labeling Buffer A(2μl);(3)Label ITReagent(4μl)。 對照標記反應體系(20μl)：(1)Control DNA(8μl);(2)無核酶水(6μl);(3)10Labeling Buffer A(2μl);(4)Label ITReagent(4μl)。

13、 制法：稀釋2μl的Sample DNA至14μl，加它到盛有Label ITReagent的小瓶內(nèi)，再加入2μl的10Labeling Buffer A，輕輕搖勻，37℃孵化1h后，利用乙醇沉淀法或使用G50微螺旋純化柱，從已標記的DNA中除去未反應的Label ITReagent，然后儲存在-20℃冰箱中備用。具體操作見文獻［2,3］以及標記試劑盒說明并經(jīng)優(yōu)化處理。 1.2.6細菌菌落轉(zhuǎn)移在瓊脂平皿上(含有四環(huán)素的營養(yǎng)培養(yǎng)基)接種細菌,經(jīng)培養(yǎng)后獲得所需要的大量的細菌克隆。準備一些帶正電的尼龍膜，滅菌之后，把膜放在瓊脂平面上轉(zhuǎn)移細菌克隆到新的含有四環(huán)素的瓊脂平面上培養(yǎng)，孵育幾個小時(37℃)，然后經(jīng)細胞裂解、DNA變性和固定后，為雜交做好準備，具體操作見文獻［2,3］以及標記試劑盒說明并經(jīng)優(yōu)化處理。