《煙草及煙草制品中總植物堿的測定連續(xù)流動(dòng)硫氰酸鉀法》 試驗(yàn)報(bào)告doc

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1、《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(dòng)硫氰酸鉀法》 標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1研究背景 生物堿是一類存在于生物體（主要是植物）中含氮的堿性有機(jī)化合物，也稱為植物堿。煙草中含有多種生物堿，按其分子結(jié)構(gòu)分為兩類，一類是吡啶與氫化吡咯環(huán)相結(jié)合的化合物，如煙堿（尼古?。?、去甲基煙堿（降煙堿）、去氫去甲基煙堿（麥斯明）、二烯煙堿（尼古替啉)等；另一類是吡啶環(huán)與吡啶或氫化吡咯環(huán)相結(jié)合的化合物，如新煙堿（阿那培新）、甲基新煙堿、去氫新煙堿（阿那他明）、N-甲基去氫新煙堿、2,3-二吡啶等。煙草總植物堿是指煙草中所有的生物堿。煙草生物堿以煙堿最重要，它占煙草生物堿總量的95%以上，其次是去甲基煙堿（降煙堿

2、）、新煙堿等，故在測定煙草總植物堿的含量時(shí)，常以煙堿計(jì)。過高的煙堿含量會(huì)嚴(yán)重影響煙葉品質(zhì)，降低煙葉在卷煙配方中的可用性。通過檢測煙堿含量與煙葉厚度、種植密度的關(guān)系，可以在生產(chǎn)中降低煙葉煙堿含量，提高煙葉的可用性。煙堿含量在醫(yī)學(xué)上也是重要指標(biāo)，可緩解和治療多種疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病、神經(jīng)衰弱、記憶衰退等。 目前，我國測定煙草及煙草制品中總植物堿的標(biāo)準(zhǔn)有兩個(gè)，一個(gè)是GB/T 23225－2008《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 光度法》；另一個(gè)是YC/T 160－2002《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(dòng)法》，它的主要內(nèi)容與1994年國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）發(fā)布

3、的35號(hào)推薦方法基本相同。 光度法專一性較強(qiáng)，對(duì)蒸餾回收率有嚴(yán)格要求，操作過程包括蒸餾和光度測定兩步。由于蒸餾裝置的限制，每次測定的樣品量有限，檢測耗時(shí)較長，難以適應(yīng)批量樣品的檢測要求，行業(yè)內(nèi)采用該方法的單位不多。相對(duì)光度法，連續(xù)流動(dòng)法快速、簡便、能同時(shí)測定煙草中多項(xiàng)指標(biāo)，已被行業(yè)內(nèi)各檢測機(jī)構(gòu)普遍采納，是測定煙草及煙草制品中總植物堿含量的主要有效可行方法。 國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）1994年發(fā)布了35號(hào)推薦方法。質(zhì)檢中心采納制定現(xiàn)行的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 160－2002《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(dòng)法》。YC/T 160－2002雖然回避了溴化氰的很多缺陷，

4、但是氰化鉀也屬于劇毒品，是重點(diǎn)危險(xiǎn)源。國家及地方安全管理部門對(duì)氰化鉀的購買、使用、保存、廢液保管與后期處理等均有嚴(yán)格規(guī)定，且隨著我國安全管理的發(fā)展，管理力度的不斷升級(jí)，相應(yīng)的制度會(huì)越來越嚴(yán)格，該方法的應(yīng)用受到了很大的限制。另外，該方法存在嚴(yán)重安全隱患，不僅給操作人員帶來了使用危險(xiǎn)，同時(shí)也給使用單位帶來了管理風(fēng)險(xiǎn)，即，使用單位須建立專用危險(xiǎn)品庫房、設(shè)立專人管理及建立嚴(yán)格的管理與檢查制度等，加大了成本和管理投入。此外，煙草行業(yè)的質(zhì)檢機(jī)構(gòu)大多需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，其中就包括對(duì)毒品的管理和使用的嚴(yán)格考核，這增加了氰化鉀法的使用難度。和國內(nèi)狀況一樣，國外也存在類似問題，所以國外許多煙草機(jī)構(gòu)已開展了替代氰化

5、鉀的方法研究。2011年，CORESTA化學(xué)常規(guī)分學(xué)組研究了用硫氰酸鉀和次氯酸鈉（或二氯異氰尿酸鈉）反應(yīng)代替氰化鉀和氯胺T反應(yīng)的研究。該方法的原理是利用硫氰酸鉀和次氯酸鈉（或二氯異氰尿酸鈉）在線反應(yīng)生成氯化氰進(jìn)行分析，相比氰化鉀和氯胺T的反應(yīng)，雖然其靈敏度≤50%，但是分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度依然滿足分析要求。因?yàn)榱蚯杷徕?、次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉都是無毒的，該方法的安全性提高了一大步。次氯酸鈉為液體，不穩(wěn)定，用前要滴定確定有效氯濃度，而二氯異氰尿酸鈉為固體粉末，穩(wěn)定性好，并且水解后有效氯能達(dá)到60～63%，用前不需要滴定，所以從實(shí)驗(yàn)操作和測試穩(wěn)定性考慮，采用硫氰酸鉀和二氯異氰尿酸鈉反應(yīng)比較理想。

6、根據(jù)煙草行業(yè)的實(shí)際情況，本項(xiàng)目確定用連續(xù)流動(dòng)分析儀測定煙草及煙草制品中總植物堿樣品的種類及規(guī)格：①采用三種類型的煙葉樣品：烤煙、白肋煙和香料煙；②采用兩種類型的卷煙樣品：烤煙型、混合型。樣品統(tǒng)一由國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供，項(xiàng)目組從檢測原理入手，對(duì)實(shí)驗(yàn)最佳條件進(jìn)行優(yōu)選，通過方法學(xué)研究考證，確定該方法的的檢出限、重復(fù)性和回收率是否達(dá)到要求，并通過實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)確定方法適用性，最終建立《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(dòng)硫氰酸鉀法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，包括試樣制備、設(shè)備及儀器規(guī)格、實(shí)驗(yàn)條件等各項(xiàng)具體技術(shù)指標(biāo)及參數(shù)等，以便在煙草行業(yè)推廣實(shí)行。 2 實(shí)驗(yàn) 2.1儀器和材料 BRAN＋LUEBBE A

7、A3連續(xù)流動(dòng)分析儀，BRAN＋LUEBBE 12英寸透析槽，C”型透析膜(德國布朗盧比公司)；HP8453型紫外一可見分光光度計(jì)(美國HP公司)；BSA2245-CW電子天平(感量0.0001g，德國賽多利斯公司)；Milli一Element超純水裝置(美國Millipore公司)；DCIC（二氯異氰尿酸鈉）(純度>95.0 %，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司)、氯化鈉、硼酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、對(duì)氨基苯磺酸、硫氰酸鉀、硫酸亞鐵、碳酸鈉和冰乙酸(AR，天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；煙堿(純度>98.0 %，國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供)；烤煙，白肋煙，香料煙，烤煙型卷煙和混合型卷煙5類樣品（

8、國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供）。 2.2 樣品的前處理和分析 煙葉樣品制備參照YC/T31-1996。準(zhǔn)確稱取0.25g樣品至50mL具塞三角燒瓶中，加入25 mL 5% 醋酸或去離子水，室溫下振蕩30min后過濾，使用連續(xù)流動(dòng)分析儀測定，測定管路見圖1。 圖1 測定煙草中的總植物堿管路圖 3 結(jié)果與討論 3.1反應(yīng)原理 3.1.1氯化氰在線合成的原理 二氯異氰尿酸鈉的結(jié)構(gòu)式如式1所示： ……………………（式1） 在水溶液中二氯異氰尿酸鈉將發(fā)生二級(jí)水解，此過程將釋放出ClO-(提供氯源)，水解反應(yīng)如式2所示： ……（式2） 另一方面，硫氰酸鉀在水

9、溶液中絕大部分將電離為SCN-（提供氰源）。所以二氯異氰尿酸鈉水解產(chǎn)生的ClO-與硫氰酸鉀電離產(chǎn)生的SCN-瞬間發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生目標(biāo)化合物ClCN，此反應(yīng)方程如下所示： ClO- + SCN- + H2O + 2e = ClCN + S2- + 2OH- 但是在ClCN產(chǎn)生的過程中，伴隨著副反應(yīng)發(fā)生，如式3所示： …………（式3） 此產(chǎn)物是異氰尿酸，屬微溶性化合物，溶解度僅為0.27g，容易在溶液中以白色沉淀析出，造成管路堵塞。所以必須優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，控制異氰尿酸沉淀的析出。 3.1.2氯化氰在線合成控制的關(guān)鍵 二氯異氰尿酸鈉通過二級(jí)水解反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生ClO-，此

10、ClO-將與SCN-在線合成ClCN。但是，如果溶液中ClO-與SCN-比例大于1:1的話，將有ClO-剩余，ClO-在酸性環(huán)境中具有很強(qiáng)的氧化性，即使在中性環(huán)境中也具有一定的氧化性能，其兩種環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)電極電勢如式4、5所示： HClO + H+ + 2e = Cl- + H2O 1.482 V ……（式4） ClO- + H2O + 2e = Cl- + 2OH- 0.89 V ……（式5） 而待測樣品是植物堿，植物堿是供電化合物，在多數(shù)反應(yīng)中提供電子，因此具有還原性能。如果溶液體系中有多余的ClO-，并且體系環(huán)境偏酸性，其

11、將與植物堿發(fā)生氧化還原反應(yīng)，致使最終檢測到的植物堿含量偏低。 綜上原因，在ClO-與SCN-在線合成ClCN這一過程中，要使溶液體系維持在中性環(huán)境，而且SCN-必須過量，避免ClO-剩余，造成最終結(jié)果偏低。A.P. Brady和Michael L. Pinsky等人通過研究發(fā)現(xiàn) SCN-:DCIC ≈ 3:1這一條件比較適合合成ClCN。本項(xiàng)目在保持這個(gè)比例下，優(yōu)化最適宜的試劑濃度，以此來達(dá)到檢測目標(biāo)化合物信號(hào)最大，管路不會(huì)有沉淀析出，同時(shí)使測量結(jié)果接近真實(shí)值的目的。 3.2定性分析實(shí)驗(yàn) 圖2所示為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品和測試樣品的紫外可見吸收光譜曲線。根據(jù)反應(yīng)原理，通過標(biāo)準(zhǔn)樣品的測試結(jié)果來

12、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后以標(biāo)準(zhǔn)曲線來推斷待測樣品的濃度。從圖2可以判斷光譜的最大吸收波長為463nm，由于儀器配套濾光片的波長基本都是10的倍數(shù)，故本實(shí)驗(yàn)使用的是460nm濾光片。 圖2 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品和測試樣品的紫外可見吸收光譜曲線 3.3萃取劑及萃取時(shí)間的選擇 由于本方法主要是替換氰化鉀與氯胺T試劑，其它試劑保持不變，YC/T 160－2002《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(dòng)法》的方法在制定過程中已進(jìn)行過萃取劑及萃取時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，因此本方法直接采用水或5%醋酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行萃取，不再進(jìn)行萃取劑及萃取時(shí)間的實(shí)驗(yàn)。 3.4緩沖溶液B條件實(shí)驗(yàn) 本方法反應(yīng)原理是萃取液中的

13、總植物堿（以煙堿計(jì)）與對(duì)氨基苯磺酸和氯化氰反應(yīng)，反應(yīng)物用比色劑在460nm測定。根據(jù)Sadeler和Harvey等人的研究結(jié)果，該方法的最佳反應(yīng)pH值為7.0，最大吸收波長為460nm。YC/T 160所使用的試劑PH 見表1 表1 YC/T 160所使用的試劑PH 溶液名稱 PH 緩沖溶液A 9.13 緩沖溶液B 5.67 氰化鉀溶液 10.90 氯胺T溶液 7.25 進(jìn)入檢測器溶液（洗針液為5%醋酸） 6.82 進(jìn)入檢測器溶液（洗針液為水） 6.88 由于本方法采用硫氰酸鉀和二氯異氰尿酸鈉在線反應(yīng)生成氯化氰，硫氰酸鉀的PH為4.97，二氯異氰尿酸鈉

14、的PH為5.27，這兩種溶液混合后會(huì)影響整個(gè)反應(yīng)的酸堿環(huán)境。經(jīng)過實(shí)際測定，洗針液為5%醋酸時(shí)，進(jìn)入檢測器溶液的PH為5.20；洗針液為水時(shí)，進(jìn)入檢測器溶液的PH為6.22，均不在最佳反應(yīng)pH值，因此需要對(duì)緩沖溶液B進(jìn)行調(diào)整。由于緩沖溶液B配置使用了磷酸氫二鈉，通過調(diào)整該物質(zhì)的質(zhì)量可以調(diào)整緩沖溶液B的PH，調(diào)整情況見表2。由表2可知當(dāng)緩沖溶液B中12水合磷酸氫二鈉質(zhì)量為262（g/L）時(shí)，進(jìn)入檢測器溶液PH可達(dá)到最佳反應(yīng)pH的要求，因此本方法緩沖溶液B配置為：稱取262g 十二水合磷酸氫二鈉，10.4g 一水合檸檬酸，7g對(duì)氨基苯磺酸，用水溶解，然后轉(zhuǎn)入1L容量瓶中，加入1 mL Brij 35

15、，用蒸餾水稀釋至1L。使用前用定性快速濾紙過濾。 表2 緩沖溶液B調(diào)整實(shí)驗(yàn) 12水合磷酸氫二鈉質(zhì)量（g/L） 溶液名稱 PH 131 緩沖溶液B 6.50 進(jìn)入檢測器溶液（洗針液為5%醋酸） 6.41 進(jìn)入檢測器溶液（洗針液為水） 6.50 262 緩沖溶液B 7.00 進(jìn)入檢測器溶液（洗針液為5%醋酸） 6.94 進(jìn)入檢測器溶液（洗針液為水） 7.00 3.5硫氰酸鉀和二氯異氰尿酸鈉條件實(shí)驗(yàn) 3.5.1最佳濃度條件實(shí)驗(yàn) 硫氰酸鉀和二氯異氰尿酸鈉實(shí)驗(yàn)濃度見表3 表3 硫氰酸鉀和二氯異氰尿酸鈉濃度 二氯異氰尿酸鈉編號(hào) A1 A2 A3 A

16、4 A5 A6 A7 二氯異氰尿酸鈉稱重g 1.10 1.65 2.20 2.75 3.30 3.85 1.10 二氯異氰尿酸鈉濃度mol/L 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.02 硫氰酸鉀編號(hào) B1 B2 B3 B4 B5 / / 硫氰酸鉀稱重g 2.16 2.88 3.75 4.50 5.04 / / 硫氰酸鉀濃度mol/L 0.09 0.12 0.16 0.19 0.21 / / 備注：以上溶液配制都定容100mL容量瓶。 采用表3中規(guī)定的硫氰酸鉀和二氯異氰尿酸鈉濃度

17、分別對(duì)烤煙、白肋煙、香料煙、烤煙型卷煙和混合型卷煙進(jìn)行條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4～表8。 表4 烤煙條件實(shí)驗(yàn) A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 1.760 1.778 1.739 1.729 1.715 沉淀 B2 1.762 1.773 1.777 1.773 1.739 1.720 B3 1.767 1.768 1.779 1.783 1.778 1.720 B4 1.764 1.766 1.772 1.773 1.762 1.703 B5 1.768 1.774 1.777 1.785 1.779 1

18、.725 表5白肋煙條件實(shí)驗(yàn) A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 4.503 4.573 4.542 4.506 4.555 沉淀 B2 4.516 4.551 4.550 4.542 4.510 4.533 B3 4.491 4.533 4.542 4.563 4.571 4.556 B4 4.520 4.554 4.586 4.601 4.581 4.606 B5 4.430 4.530 4.534 4.588 4.568 4.555 表

19、6 香料煙條件實(shí)驗(yàn) A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 0.977 0.999 0.987 0.945 0.949 沉淀 B2 0.982 0.989 0.996 0.985 0.960 0.958 B3 0.975 0.988 0.992 1.007 1.002 0.988 B4 0.940 0.978 0.983 0.992 0.993 0.983 B5 0.986 0.990 1.000 1.010 1.005 0.998 表7 烤煙

20、型卷煙條件實(shí)驗(yàn) A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 1.694 1.700 1.653 1.660 1.644 沉淀 B2 1.686 1.702 1.723 1.683 1.672 1.685 B3 1.706 1.701 1.711 1.727 1.708 1.709 B4 1.693 1.703 1.710 1.720 1.712 1.714 B5 1.677 1.695 1.714 1.722 1.711 1.708 表8 混合型卷煙條

21、件實(shí)驗(yàn) A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 2.210 2.216 2.207 2.126 2.148 沉淀 B2 2.213 2.226 2.236 2.179 2.163 2.205 B3 2.175 2.209 2.216 2.211 2.205 2.205 B4 2.173 2.210 2.220 2.214 2.208 2.174 B5 2.157 2.207 2.210 2.216 2.217 2.207 由表4～表8數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)A2-B1和A3-B2條件最佳，這種情況與A.P. Brad

22、y和Michael L. Pinsky等人的研究成果一致，即SCN-:DCIC ≈ 3:1為最佳配比，由于本方法生成的氯化氰必須過量，因此本方法選擇硫氰酸鉀和二氯異氰尿酸鈉濃度的最佳配比為A3-B2，即SCN-:DCIC=2.88g:2.20g=0.12mol/L: 0.04mol/L。 3.5.2管路條件 考慮到二氯異氰尿酸鈉和硫氰酸鉀的反應(yīng)體系信號(hào)比氰化鉀和氯胺T的弱，選擇0.32mL/min的黑黑泵管，將在線生成的氯化氰壓入反應(yīng)體系。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在走上10個(gè)樣品杯后，管路中生成白色沉淀，實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行，故選擇比氰化鉀和氯胺T反應(yīng)體系的管徑略大的0.23mL/min的橙白泵管壓入在線生成

23、的氯化氰，一周連續(xù)每天測試230個(gè)樣品，未發(fā)現(xiàn)白色沉淀堵塞管路。 3.6標(biāo)準(zhǔn)曲線 將所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液由高濃度到低濃度（0.5 ～7%）進(jìn)行分析。煙堿的響應(yīng)值（Y，%）對(duì)相應(yīng)的分析物濃度（x，%）進(jìn)行線性回歸，得到煙堿的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（見表9），結(jié)果表明，所煙堿在0.5 ～7%的濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。 表9 煙堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù) 回歸方程 相關(guān)系數(shù)R2 Y=0.000706x-2.4064 1.0000 3.7檢出限 連續(xù)流動(dòng)分析方法的檢出限是根據(jù)美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）方法part136 apendix B 來確定的。EPA方法應(yīng)用廣泛，容易重復(fù)測試

24、，用一連串的最高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的2%濃度溶液10個(gè)重復(fù)測量3次，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差再乘以相應(yīng)t值，即MDL(method detection limit) = (s) * (t-value)= (s) * t(n-1, .99)。標(biāo)準(zhǔn)品10個(gè)，自由度為9，t(9, .99)=2.821，即MDL= 2.821 *(s)，得到的結(jié)果值表示方法檢出限具有 99% 可信度。定量限的計(jì)算是LOQ（Limit of Quantitation）= 10 * (s)。 按氰化鉀法和硫氰酸鉀法，配置最高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的2%濃度溶液10份，每份重復(fù)測量3次，按EPA方法計(jì)算得到方法的檢出限和定量限，結(jié)果見表1

25、0、表11。 表10 氰化鉀法的檢出限和定量限 測試 次數(shù) 測試值 % 測試 次數(shù) 測試值 % 測試 次數(shù) 測試值 % 1 0.101 11 0.073 21 0.122 2 0.095 12 0.067 22 0.133 3 0.102 13 0.097 23 0.122 4 0.080 14 0.107 24 0.131 5 0.097 15 0.088 25 0.119 6 0.073 16 0.092 26 0.088 7 0.086 17

26、0.107 27 0.063 8 0.081 18 0.119 28 0.078 9 0.094 19 0.136 29 0.083 10 0.073 20 0.146 30 0.117 標(biāo)準(zhǔn)偏差S 0.022 檢出限 % MDL=0.022*2.821=0.063 定量限 % LOQ=10*0.022=0.220 表11 硫氰酸鉀法的檢出限和定量限 測試 次數(shù) 測試值 % 測試 次數(shù) 測試值 % 測試 次數(shù) 測試值 % 1 0.169 11 0.168 21 0.160 2

27、0.144 12 0.168 22 0.159 3 0.138 13 0.175 23 0.155 4 0.148 14 0.178 24 0.153 5 0.135 15 0.170 25 0.135 6 0.137 16 0.152 26 0.140 7 0.150 17 0.161 27 0.150 8 0.178 18 0.158 28 0.142 9 0.154 19 0.171 29 0.122 10 0.174 20 0.160 30 0.124 標(biāo)準(zhǔn)偏差S 0.016

28、檢出限 % MDL=0.016*2.821=0.045 定量限 % LOQ=10*0.016=0.160 氰化鉀法的檢出限和定量限分別為0.063%和0.220%，硫氰酸鉀法的檢出限和定量限0.045%和0.160%，兩方法均達(dá)到檢測要求。 3.8方法的精密度 采用本方法分別對(duì)樣品烤煙、白肋煙、香料煙、烤煙型卷煙和混合型卷煙樣品進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果見表12。由結(jié)果可以看出硫氰酸鉀法的精密度可以滿足總植物堿測定的要求。 表12 硫氰酸鉀法的精密度測定結(jié)果 樣品 1 2 3 4 5 6 平均值% 標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 烤煙 1.796 1.788 1.787

29、 1.779 1.787 1.776 1.786 0.0073 0.41 白肋煙 4.583 4.550 4.568 4.613 4.556 4.569 4.573 0.0224 0.49 香料煙 1.010 1.035 1.033 1.020 1.012 1.006 1.019 0.0123 1.20 烤煙型卷煙 1.666 1.713 1.698 1.682 1.697 1.703 1.693 0.0168 0.99 混合型卷煙 2.212 2.206 2.212 2.198 2.234 2.242 2

30、.217 0.0170 0.77 3.9不同萃取液萃取結(jié)果比較 由于YC/T 160規(guī)定5%醋酸或水萃取樣品均可，因此采用本方法萃取液分別使用5%醋酸和水對(duì)樣品烤煙、白肋煙、香料煙、烤煙型卷煙)和混合型卷煙樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表13。對(duì)表13的結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果為 t=1.45，t0.05=2.78，t＜t0.05，說明兩種萃取液提取煙草樣品的結(jié)果沒有顯著性差異，因此采用本方法使用5%醋酸或水萃取樣品可得到相同的結(jié)果。 表13 不同萃取液樣品測試結(jié)果 樣品 名稱 不同萃取液樣品測試結(jié)果% 5%醋酸 水 烤煙 1.76 1.79 白肋煙 4.54 4.5

31、7 香料煙 0.98 1.02 烤煙型卷煙 1.72 1.69 混合型卷煙 2.20 2.22 3.10回收率 分別稱取樣品烤煙、白肋煙、香料煙、烤煙型卷煙和混合型卷煙樣品，分別按樣品含量的75%、100%、125%進(jìn)行加標(biāo)，每個(gè)加標(biāo)濃度3個(gè)平行。加標(biāo)后的樣品分別按本方法前處理方法處理樣品，在相同儀器分析條件進(jìn)行樣品分析，并由原含量、加標(biāo)量以及測定量計(jì)算回收率，結(jié)果見表14～表16。從表14～表16可知，硫氰酸鉀法測得的五種煙草類型煙堿的加標(biāo)回收率平均值在98.06%～100.25%之間，表明該方法滿足檢測要求。 表14 75%加標(biāo)回收率 樣品編號(hào) 煙末 含量

32、 mg 測定 總含量 mg 添加量 mg 回收率 % 回收率 平均值 % 回收率 總平均值 % 烤煙 4.1923 7.0489 2.9051 98.33 98.86 99.18 4.2381 7.0887 2.9051 98.12 4.1727 7.0819 2.9051 100.14 白肋煙 10.7589 20.3722 9.6837 99.27 99.19 10.8445 20.3834 9.6837 98.50 10.7118 20.3743 9.6837 99.78 香料煙 2.4491 4.

33、4129 1.9367 101.40 100.25 2.4368 4.3787 1.9367 100.26 2.4103 4.3296 1.9367 99.10 烤煙型卷煙 4.1763 7.0631 2.9051 99.37 99.25 4.2112 7.0778 2.9051 98.68 4.2045 7.1008 2.9051 99.70 混合型卷煙 5.0812 8.8843 3.8735 98.18 98.34 5.1230 8.9500 3.8735 98.80 5.0852 8.8830 3.8735

34、98.05 表15 100%加標(biāo)回收率 樣品編號(hào) 煙末 含量 mg 測定 總含量 mg 添加量 mg 回收率 % 回收率 平均值 % 回收率 總平均值 % 烤煙 4.1907 8.4624 4.3577 98.03 98.28 98.74 4.1334 8.4272 4.3577 98.54 4.1792 8.4618 4.3577 98.28 白肋煙 10.8274 22.2236 11.6204 98.07 98.58 10.8231 22.3259 11.6204 98.99 10.8744

35、22.3415 11.6204 98.68 香料煙 2.3933 4.8816 2.4209 102.78 99.63 2.3631 4.7362 2.4209 98.02 2.3688 4.7431 2.4209 98.07 烤煙型卷煙 4.1730 8.4812 4.3577 98.86 99.07 4.1531 8.4742 4.3577 99.16 4.2444 8.5669 4.3577 99.19 混合型卷煙 5.0852 10.3123 5.3260 98.14 98.16 5.0274 10.2603

36、 5.3260 98.25 5.0453 10.2700 5.3260 98.10 表16 125%加標(biāo)回收率 樣品編號(hào) 煙末 含量 mg 測定 總含量 mg 添加量 mg 回收率 % 回收率 平均值 % 回收率 總平均值 % 烤煙 4.1317 9.8329 5.8102 98.12 98.06 98.37 4.1285 9.8267 5.8102 98.07 4.1890 9.8829 5.8102 98.00 白肋煙 10.6947 24.9594 14.5256 98.20 98.22 10

37、.8359 25.1011 14.5256 98.21 10.7717 25.0422 14.5256 98.24 香料煙 2.3735 5.2091 2.9051 97.61 99.15 2.3688 5.2700 2.9051 99.87 2.4141 5.3186 2.9051 99.98 烤煙型卷煙 4.1730 9.8979 5.8102 98.53 98.21 4.1863 9.9096 5.8102 98.50 4.2494 9.9198 5.8102 97.59 混合型卷煙 5.1389 11.8035

38、 6.7786 98.32 98.18 5.1350 11.7939 6.7786 98.23 5.0194 11.6627 6.7786 98.00 3.11不同方法比對(duì) 將烤煙、白肋煙、香料煙、烤煙型卷煙和混合型卷煙五個(gè)樣品，分別采用氰化鉀方法和硫氰酸鉀的測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表17，同一樣品采用硫氰酸鉀測定結(jié)果相對(duì)于氰化鉀法的相對(duì)誤差均小于5%。對(duì)同一樣品分別采用硫氰酸鉀或氰化鉀方法的兩組測定結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果為 t=1.39，t0.05=2.78，t＜t0.05，說明兩種分析方法沒有顯著性差異，表明硫氰酸鉀法與氰化鉀方法結(jié)果一致。 表17 硫氰酸

39、鉀法與氰化鉀法測定總植物堿結(jié)果對(duì)比 硫氰酸鉀法 氰化鉀法 兩法測定結(jié)果的差異 樣品編號(hào) 平均值 % 平均值 % 差值 % 烤煙 1.79 1.78 0.02 白肋煙 4.57 4.58 0.01 香料煙 1.02 1.00 0.02 烤煙型卷煙 1.69 1.69 0.00 混合型卷煙 2.22 2.18 0.04 3.12實(shí)驗(yàn)室間比對(duì) 國內(nèi)6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)烤煙、白肋煙、香料煙、烤煙型卷煙和混合型卷煙樣品七個(gè)樣品按照硫氰酸鉀法進(jìn)行三平行測定，結(jié)果見表18。項(xiàng)目組測定結(jié)果（實(shí)驗(yàn)室1）與5個(gè)實(shí)驗(yàn)室（實(shí)驗(yàn)室2-6）各個(gè)樣品測定結(jié)果均值之間雙邊

40、t檢驗(yàn)結(jié)果見表19，可以看出國內(nèi)5家實(shí)驗(yàn)室與項(xiàng)目組結(jié)果不存在顯著性差異。對(duì)表18的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到各樣品的r和R，見表20。由表20的數(shù)據(jù)可以看出硫氰酸鉀法的r和R與Coresta35號(hào)推薦方法（氰化鉀方法）的r和R類似，說明本方法重復(fù)性和再現(xiàn)性可以滿足總植物堿測定的需要。 表18 國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)室1 樣品編號(hào) 測定結(jié)果1 % 測定結(jié)果2 % 測定結(jié)果3 % 平均值 % 標(biāo)準(zhǔn)偏差 烤煙 1.796 1.788 1.787 1.790 0.005 白肋煙 4.566 4.569 4.582 4.572 0.009 香料煙 1.038

41、1.016 0.997 1.017 0.021 烤煙型卷煙 1.675 1.694 1.691 1.687 0.010 混合型卷煙 2.223 2.206 2.218 2.216 0.009 實(shí)驗(yàn)室2 樣品編號(hào) 測定結(jié)果1 % 測定結(jié)果2 % 測定結(jié)果3 % 平均值 % 標(biāo)準(zhǔn)偏差 烤煙 1.649 1.675 1.676 1.667 0.016 白肋煙 4.325 4.309 4.306 4.314 0.010 香料煙 0.936 0.930 0.932 0.933 0.003 烤煙型卷煙 1.595 1.

42、614 1.596 1.602 0.011 混合型卷煙 2.311 2.326 2.266 2.301 0.031 實(shí)驗(yàn)室3 樣品編號(hào) 測定結(jié)果1 % 測定結(jié)果2 % 測定結(jié)果3 % 平均值 % 標(biāo)準(zhǔn)偏差 烤煙 1.752 1.753 1.782 1.762 0.017 白肋煙 4.418 4.460 4.446 4.441 0.021 香料煙 1.095 1.091 1.087 1.091 0.004 烤煙型卷煙 1.687 1.695 1.707 1.696 0.010 混合型卷煙 2.147 2.15

43、1 2.153 2.150 0.003 實(shí)驗(yàn)室4 樣品編號(hào) 測定結(jié)果1 % 測定結(jié)果2 % 測定結(jié)果3 % 平均值 % 標(biāo)準(zhǔn)偏差 烤煙 1.682 1.682 1.660 1.675 0.013 白肋煙 4.384 4.373 4.384 4.380 0.006 香料煙 0.906 0.895 0.960 0.920 0.035 烤煙型卷煙 1.738 1.738 1.749 1.741 0.006 混合型卷煙 2.085 2.096 2.106 2.096 0.011 實(shí)驗(yàn)室5 樣品編號(hào) 測定結(jié)果1 %

44、 測定結(jié)果2 % 測定結(jié)果3 % 平均值 % 標(biāo)準(zhǔn)偏差 烤煙 1.810 1.800 1.860 1.823 0.032 白肋煙 4.600 4.760 4.730 4.697 0.085 香料煙 0.930 0.950 0.990 0.957 0.031 烤煙型卷煙 1.790 1.740 1.760 1.763 0.025 混合型卷煙 2.190 2.260 2.210 2.220 0.036 實(shí)驗(yàn)室6 樣品編號(hào) 測定結(jié)果1 % 測定結(jié)果2 % 測定結(jié)果3 % 平均值 % 標(biāo)準(zhǔn)偏差 烤煙 1.772

45、1.796 1.797 1.788 0.014 白肋煙 4.432 4.469 4.501 4.467 0.035 香料煙 1.023 1.020 1.028 1.024 0.004 烤煙型卷煙 1.749 1.766 1.765 1.760 0.010 混合型卷煙 2.114 2.124 2.031 2.090 0.051 表19 項(xiàng)目組測定結(jié)果與5個(gè)實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果均值之間雙邊t檢驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)室編號(hào) t(t0.05 =2.78) 是否存在顯著性差異 2 1.70 否 3 0.81 否 4 2.32 否 5

46、1.13 否 6 0.83 否 表20 國內(nèi)比對(duì)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 樣品名稱 測試結(jié)果平均值% r R 烤煙 1.751 0.051 0.189 白肋煙 4.479 0.110 0.400 香料煙 0.990 0.059 0.191 烤煙型卷煙 1.708 0.038 0.176 混合型卷煙 2.179 0.082 0.242 Coresta CRM35 （2006 年共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果） 烤煙A 2.87 0.15 0.48 烤煙B 2.61 0.08 0.43 烤煙C 0.62 0.03 0.14 白肋煙D

47、 2.95 0.11 0.60 白肋煙E 1.36 0.07 0.29 烤煙F 0.61 0.03 0.11 Coresta CRM35 （1993 年共同實(shí)驗(yàn)結(jié)果） 香料煙 1.17 0.05 0.19 烤煙 2.90 0.08 0.41 白肋煙 3.97 0.12 0.55 6、結(jié)論 項(xiàng)目組研究并論證了《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(dòng)硫氰酸鉀法》方法的氯化氰反應(yīng)原理，氯化氰在線合成控制的關(guān)鍵，定性分析實(shí)驗(yàn)，硫氰酸鉀和DCIC條件實(shí)驗(yàn)，方法的檢出限、回收率，進(jìn)行了不同方法的比對(duì)，并對(duì)方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性進(jìn)行了充分的論證。通過以上的研究最終建立了《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(dòng)硫氰酸鉀法》，該方法達(dá)到了國內(nèi)現(xiàn)今的發(fā)展水平，可以替代氰化鉀的方法。建議將本方法作為推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。 《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動(dòng)硫氰酸鉀法》項(xiàng)目組 2012.4 15