生物技術(shù)實踐[生物選修一]知識復(fù)習(xí)圖解

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1、 ...wd... 果酒和果醋的制作 挑選葡萄 沖洗 榨汁 酒精發(fā)酵 醋酸發(fā)酵 注意： ①要先清洗后除枝梗(防止除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的時機，同時，防止葡萄汁流失) ②不能反復(fù)沖洗(防止菌種流失) 注意： 選擇新鮮的葡萄 注意： ①榨汁機要清洗干凈，并晾干(防雜菌污染) ②防止將果核壓破(因果核含有多種有害葡萄酒風(fēng)味的物質(zhì)) 原理：主要菌種是酵母菌。酵母菌是異養(yǎng)兼性厭氧微生物 C6H12O6→C2H5OH＋C02 溫度：20℃左右最適合酵母菌繁殖

2、，一般控制在18℃～25℃。 果酒 果醋 注意： ①發(fā)酵裝置要清洗干凈，并用體積分數(shù)為70％的酒精消毒 ②發(fā)酵瓶裝入葡萄汁后留有l(wèi)/3的空間(目的是先讓酵母菌進展有氧呼吸快速繁殖，耗盡氧氣后再進展酒精發(fā)酵；其次，防止發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2造成發(fā)酵液的溢出) ③如用帶蓋的瓶子制葡萄酒，每隔12 h左右將瓶蓋擰松一次(注意不是翻開瓶蓋，防雜菌污染)，之后再將瓶蓋擰緊(目的:排出多余的氣體放炸裂) ④裝入葡萄汁封閉充氣口(無氧環(huán)境和放雜菌污染) ⑤發(fā)酵過程中，隨著酒精度數(shù)的提高，葡萄酒呈現(xiàn)深紅色(因紅葡萄皮的色素也進入發(fā)酵液) ⑥酒精的鑒定:與酸性重鉻酸鉀→呈灰綠色 對照組→

3、2mL白酒 實驗組→2mL發(fā)酵液 試管甲→2mL發(fā)酵前液 試管乙→2mL發(fā)酵后液 3mL/L的H2SO43滴→混勻→ 重鉻酸鉀3滴→觀察 3mL/L的H2SO43滴→混勻→ 重鉻酸鉀3滴→觀察 原理：主要菌種是醋酸桿菌(異養(yǎng)需氧型) ①當(dāng)氧氣糖源均充足時，糖→醋酸 ②當(dāng)氧氣充足、缺少糖源時，乙醇→乙醛→醋酸 溫度：30℃～35℃。 注意：需適時通入空氣 高考警示： ①由于醋酸菌和乳酸菌屬于原核生物，所以在利用者兩類微生物時，其環(huán)境中一定不能參加抗生素。 ②酵母菌在營養(yǎng)和氧氣充足時進展出芽生殖 選修1?生物技術(shù)實踐?知識歸納圖解 微生物的實驗室培養(yǎng)

4、 〔一〕培養(yǎng)基的 基本知識 1．培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 營養(yǎng)物質(zhì) 定義 作用 主要來源及所涉及的微生物 碳源 但凡能提供微生物所需碳元素的物質(zhì) 構(gòu)成生物細胞、生物體及細胞代謝產(chǎn)物，有些能為異養(yǎng)生物提供能源 無機化合物：C02、NaHC03等(自養(yǎng)生物) 有機化合物：糖類、脂質(zhì)、花生粉餅、石油等(異養(yǎng)生物) 氮源 但凡能提供微生物所需氮元素的物質(zhì) 合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物，也可為異養(yǎng)微生物提供能源 無機化合物：N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽，自養(yǎng)生物有機化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等，異養(yǎng)生物 水分 生物體內(nèi)含量最高的組成成分，分為結(jié)合水和自由水 良好的溶劑、細

5、胞生活及生化反響的介質(zhì)、參與物質(zhì)運輸及參與生化反響的反響物 培養(yǎng)基、大氣、代謝產(chǎn)物 無機鹽 為微生物提供大量除C、H、0以外的各種元素 細胞組成成分，生命調(diào)節(jié)物質(zhì)，自養(yǎng)菌的能源或其他營養(yǎng)來源，酶的激活劑 培養(yǎng)基、大氣等環(huán)境 生長因子 微生物正常生長繁殖，必不可少的微量有機物 可作為酶與核酸等的組成成分 維生素、氨基酸、堿基等 高考警示鐘 自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)不同 (1)自養(yǎng)微生物所需的碳源、氮源來自含碳、含氮的無機物，而異養(yǎng)微生物需要的碳源、氮源來自含碳、含氮的有機物，因此可根據(jù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型。 (2)含氮無機物不但能給自養(yǎng)微生物

6、提供氮源，也能作為能源物質(zhì)，提供能量，如NH3既作為硝化細菌的氮源也作為能源。 2．培養(yǎng)基的配制原那么 (1)目的明確。要根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等選擇原料、配制培養(yǎng)基。 (2)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)。各種營養(yǎng)物質(zhì)要保證適當(dāng)?shù)臐舛群捅壤?。營養(yǎng)物質(zhì)比例過低，不能滿足微生物生長；濃度過高那么會抑制微生物的正常生長。營養(yǎng)物質(zhì)的濃度比(如C/N)還會直接影響某些微生物的代謝產(chǎn)物，如谷氨酸生產(chǎn)，C/N=4∶1時，菌體大量繁殖，谷氨酸產(chǎn)量少；而C/N=3∶1時，菌體繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大。 (3)pH要適當(dāng)。不同微生物生長所需pH不同。如細菌pH保持在6.5～7.5之間；放線菌保持在7.5

7、～8.5之間；真菌應(yīng)保持在5.0～6.0之間。 3．培養(yǎng)基的分類及作用：培養(yǎng)基種類很多，作用也不同。根據(jù)不同的分類標準，可將培養(yǎng)基分為不同種類。 劃分標準 培養(yǎng)基種類 特點 用途及實例 物理性質(zhì) 液體培養(yǎng)基 不加凝固劑 工業(yè)生產(chǎn) 半固體培養(yǎng)基 加凝固劑，如：瓊脂 觀察微生物的運動、分類鑒定、保藏菌種 固體培養(yǎng)基 微生物別離、鑒定、活菌計數(shù)、 化學(xué)成分 天然培養(yǎng)基 含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì) 工業(yè)生產(chǎn) 合成培養(yǎng)基 培養(yǎng)基成清楚確(用化學(xué)成分的化學(xué)物質(zhì)配成) 分類、鑒定 用途 選擇培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中參加某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需

8、要的微生物的生長 培養(yǎng)、別離出特定微生物(如：培養(yǎng)酵母茵或霉菌，可在培養(yǎng)基中參加青霉素；培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，可在培養(yǎng)基中參加高濃度食鹽) 鑒別培養(yǎng)基 根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中參加某種指示劑或化學(xué)藥品 鑒別不同種類的微生物，如可用伊紅一美藍培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(假設(shè)有，茵落呈深紫色，并帶有金屬光澤) 說明：①病毒為非細胞構(gòu)造的生物體，專營活細胞寄生，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)，需接種在動植物組織中才能增殖。常用于培養(yǎng)病毒的是活雞胚。 ②參加培養(yǎng)基中的凝固劑(如瓊脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。 ③選擇培養(yǎng)基一般只生長具有特定的微生物，鑒別培

9、養(yǎng)基可以存在其他微生物，而且能鑒別特定的微生物。 注意：選擇培養(yǎng)基的選擇方法 (1)在培養(yǎng)基中參加某種化學(xué)物質(zhì)。例如，參加青霉素可以別離出酵母菌和霉菌；參加高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。這里的參加是在主要營養(yǎng)成分完整的基礎(chǔ)上參加。 (2)改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分。例如缺乏氮源時可以別離出固氮微生物；石油作為惟一碳源時，可以別離出消除石油污染的微生物。 (3)改變微生物的培養(yǎng)條件。例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境下培養(yǎng)，可以得到耐高溫的微生物。 〔二〕滅菌技術(shù) 1．無菌技術(shù)的概念 在微生物培養(yǎng)中，獲得純潔培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌入侵，其主要技術(shù)是無菌操作。無菌技術(shù)是指通過一

10、定物理、化學(xué)的手段，防止實驗室培養(yǎng)物被外來微生物污染。無菌技術(shù)主要圍繞如何防止雜菌污染展開的。 2．消毒、滅菌的方法 工程 概念 常用方法 應(yīng)用范圍 消毒 使用較為溫和的物理或化學(xué)方法，僅殺死物體外表或內(nèi)部一局部對人體等有害的微生物(不包括孢子和芽孢) 巴氏消毒法：70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min 一些不耐高溫的物體如牛奶 煮沸消毒法：在100℃水浴中煮沸5～6 min 一般物品 化學(xué)藥劑消毒法：用乙醇、氯氣、漂白粉、KMnO4等藥劑來殺死或抑制細菌生長或繁殖 可用來對環(huán)境、雙手和衣物等消毒 紫外線消毒法：30W紫外燈照射30min

11、接種室 滅菌 使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼燒滅菌法：酒精燈火焰 接種工具如接種環(huán)、接種針等 干熱滅菌法：在160～170℃加熱1～2h 如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具 高壓蒸汽滅菌：壓力為100 kPa，溫度為12l℃的條件下，維持15～30 min 培養(yǎng)基及容器的滅菌 注意： ①無菌操作是微生物培養(yǎng)過程中，防止雜茵污染的關(guān)鍵步驟。 ②消毒只能消滅或抑制營養(yǎng)體的活動，而不能到達徹底滅菌。酒精消毒用體積分數(shù)為70%的酒精效果最好，因濃度過高，會使菌體外表蛋白凝固成一層保護膜，乙醇分子不能進入其中；濃度過低，殺菌力減弱。而滅菌除殺死營養(yǎng)

12、體外，還必須殺死芽孢和孢子。 ③滅菌消毒的原理，就是通過一定理化手段，使病原茵蛋白質(zhì)變性，失去生命活性。 〔三〕微生物的純化培養(yǎng)技術(shù) 1．常用細菌培養(yǎng)基——蛋白胨培養(yǎng)基配制流程： 計算 稱量 溶化 滅菌 注意：據(jù)配方計算配制一定體積培養(yǎng)基時各成分的用量 注意： ①倒平板時，燒杯口要通過酒精燈火焰滅菌。 ②平板冷凝后要將平板倒置，以確保拿放方便，同時防止水分蒸發(fā)，以利微生物生長，也可防止皿蓋上凝結(jié)的水滴滴入培養(yǎng)基，影響pH；其次防止細菌透過皿底、皿蓋的縫隙，落在培養(yǎng)基上。 ③倒平板時，不能將培養(yǎng)基濺在皿底與皿蓋之間，以防止雜菌滋生，污染培養(yǎng)基 〔調(diào)PH〕 倒平板

13、 注意： ①牛肉膏較粘稠，應(yīng)玻棒挑取，在稱量紙上稱量 ②牛肉膏蛋白胨易吸潮，動作要迅速 注意： ①溶化瓊脂時要控制火力的大小并不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦； ②加熱過程中局部水分蒸發(fā)，待瓊脂完全溶化后應(yīng)補加蒸餾水，以保持溶液的濃度 注意： 由于不同微生物適宜的pH不同，因此在熔化后，必須用NaOH或HCl來調(diào)節(jié)pH 裝瓶 注意：分裝至試管時培養(yǎng)基的高度不要超過試管高度的1/5 注意： ①可用高壓蒸汽滅菌法 ②用干熱滅菌法時溫度160～170℃ (不能超過180℃，否那么易引起報紙等燃燒) ③一般是培養(yǎng)基先滅菌再倒平板，也可先倒平板,再滅菌

14、 2．純化大腸桿菌 Ⅰ．原理：在培養(yǎng)基上將細菌稀釋或分散成單個細胞，使其長成單個的菌落，這個菌落就是純化的細菌菌落。 Ⅱ．微生物接種方法： (1)平板劃線法：平板劃線法中細胞的別離和稀釋過程發(fā)生在接種環(huán)在固體平板外表上的劃線和移動過程中。在線的開場局部，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數(shù)逐漸減少，最后可能形成純種的單個菌落。(如圖) (2)稀釋涂布平板法：10倍系列稀釋操作 劃線操作時注意： 〔1〕用接種環(huán)取菌種之前、每次劃線之前和劃線完畢都要進展灼燒滅菌，灼燒后要在酒精燈附近冷卻后再操作；(第一次操作：殺死接種環(huán)上原有的

15、微生物。每次劃線之前：殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端。劃線完畢后：殺死接種環(huán)上殘存的菌種，防止細菌污染環(huán)境和感染操作者) 〔2〕劃線時不要劃破培養(yǎng)基，如果采用分段劃線法操作從第二次操作應(yīng)總在上一次劃線末端開場，首尾區(qū)不能相連； 〔3〕操作必須始終在酒精燈火焰旁進展。 涂布操作時注意： 〔1〕配制系列梯度稀釋液時，所用的試管和移液管均需滅菌，必須用無菌水配制； 〔2〕涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在燒杯中滴盡，沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰引燃。不要將過熱的涂布器放入盛有酒精的燒杯中，一面引燃其中的酒精； 〔3〕配制系列梯度稀釋液和轉(zhuǎn)

16、移菌液以及涂布過程等必須都在酒精燈火焰旁進展，移液管頭不能接觸任何物體。 3．菌種的保存 ①對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。 ②對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。 注意：①菌種保藏的原理是：低溫、枯燥和隔絕空氣，使微生物代謝能力和繁殖能力降低。 ②不同菌種的保藏方法因不同菌種而異。需氧型，必須低溫有氧，而厭氧型必須低溫?zé)o氧；腐生微生物可提供牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，而寄生微生物需提供活體組織等非人工培養(yǎng)基，如病毒需提供活雞胚。 〔三〕微生物的篩選與計數(shù)〔以“土壤中分解尿素的細菌〞為例〕 篩選菌株 原那么：人為提供有利于目的菌生長的條件，同時抑制或阻止

17、其他微生物的生長 培養(yǎng)基的成分：尿素作為惟一的氮源(選擇培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基) 菌落計數(shù) 菌種的鑒定 對照：將不接種的培養(yǎng)基置于一樣溫度恒溫箱培養(yǎng)(目的:證實培養(yǎng)基是否被雜菌污染) 統(tǒng)計茵落數(shù)目的方法： (1)顯微鏡直接計數(shù)法 ①原理：利用特定細菌計數(shù)板或血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積樣品中微生物數(shù)量 ②方法：用計數(shù)板計數(shù)。③缺點：不能區(qū)分死菌與活菌。 (2)間接計數(shù)法(活菌計數(shù)法) ①原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基外表生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。 ②計算公式：每克樣品中的菌株數(shù)＝(C÷

18、V)×M，其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。 ③操作：設(shè)置重復(fù)組，增強實驗的說服力與準確性。同時為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進展計數(shù)。 方法：檢測培養(yǎng)基pH的變化判斷 原理：在細菌分解尿素時，分泌的脲酶將尿素分解為氨，氨使培養(yǎng)基堿性增高，pH升高 菊花的組織培養(yǎng) 制備MS培養(yǎng)基 外植體消毒 接種 成分：無機物(大量元素、微量元素)、有機物：糖類(最常使用的糖是蔗糖，提供能源和維持滲透壓)、維生素、氨基酸

19、、有機添加劑〔生長因子〕、激素 pH：5.8左右 滅菌：高壓蒸汽滅菌 注意： ①為降低工作量、減少誤差，可通過配制母液，到達一次稱量藥品、屢次使用。 ②配制培養(yǎng)基時，母液的應(yīng)用應(yīng)先搖勻，移液用的移液管或量筒需清洗兩次，以免造成誤差。 培養(yǎng) 試管苗 愈傷組織 胚狀體(或不定芽) 脫分化 再分化 移栽(煉苗) 栽培 材料：植物的種類、年齡、保存時間 消毒原因：大局部來自田間，帶有大量病毒、細菌 菊花莖段消毒：所用消毒劑為體積分數(shù)為70％的酒精和質(zhì)量分數(shù)為0.1％的氯化汞溶液，所使用的清洗液是無菌水。 注意：不同植株或同一植株的不同部位，所選用的消毒劑種類及

20、濃度可能不同； 方法：始終在酒精燈火焰旁進灼燒滅菌。 注意：將菊花莖段插入培養(yǎng)基時不要倒插 溫度：18～22℃ 光照：在初期菊花的組織培養(yǎng)需光照，月季的花藥培養(yǎng)不需光照(有利愈傷組織形成)，二者后期均需要光照(有利葉綠素形成和光合作用) 注意：生長素和細胞分裂素的使用 使用順序不同→結(jié)果不同 (先生長素，后細胞分裂素：有利于細胞分裂，但不分化 先細胞分裂素，后生長素：細胞既分裂也分化 同時使用： 分化頻率提高) 用量比例不同→發(fā)育方向不同 (高：利用根的分化，抑制芽的形成 低：利用芽的分化，抑制根的形成 適中：

21、促進愈傷組織的生長) 注意：培養(yǎng)一株完整的試管苗，必須先進展生芽培養(yǎng)，然后進展生根培養(yǎng)，如果順序顛倒，先誘導(dǎo)生根，就不好誘導(dǎo)生芽了。 原因：因試管苗光合作用能力低，對不良環(huán)境耐受力差，一定要在保溫、保濕一段時間以增強適應(yīng)力 方法：流水清洗根部，移栽至消過毒的蛭石或珍珠巖環(huán)境培養(yǎng) 脫分化階段只分裂； 再分化階段既有分裂也有分化 人工種子制備階段 原理：細胞的全能性(高度分化的植物細胞，仍具有發(fā)育為完整個體的潛能) (1)原因：體細胞攜帶有本物種全部的遺傳信息 (2)實現(xiàn)的條件：離體狀態(tài)和適宜條件(水分、無機鹽、有機營養(yǎng)及激素、溫度、pH等) (3)細胞

22、的全能性大小與細胞種類的關(guān)系： ①受精卵＞生殖細胞＞體細胞；植物細胞＞動物細胞；分化程度低的細胞＞分化程度高的細胞 ②一般的，離體的植物細胞的全能性在一定條件下可充分地表達出來。 ③離體的動物細胞的全能性受到限制，但其細胞核的全能性借助卵細胞的細胞質(zhì)可表達出來。 ④未離體的細胞的全能性不能表達，只是在機體的調(diào)控下進展定向分化。 果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用 一、果膠酶的組成和作用：包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠分解酶、果膠酯酶等。果膠酶能分解果膠，瓦解植物的細胞壁及胞間層

23、。其實質(zhì)是果膠分解成可溶性的半乳糖醛酸。 注意：①果膠酶是分解果膠的一類酶的總稱，不是一種酶。 ②植物、霉菌、酵母菌等細胞均能產(chǎn)生果膠酶，但通常動物細胞不產(chǎn)生果膠酶。 ③在植物細胞工程中，應(yīng)用纖維素酶和果膠酶來破壞細胞壁，獲得原生質(zhì)體。 二、探究溫度對果膠酶活性的影響 (1)實驗原理：果膠酶活性受溫度影響，處于最適溫度時，活性最高；低于或高于最適溫度，酶活性受到抑制。即果肉的出汁率、果汁的澄清度與果膠酶的活性大小成正比。 (2)設(shè)計思路：設(shè)置一系列梯度溫度，從中選出酶活性最高的溫度，然后再以該溫度為中心，縮小溫度梯度向兩個方面各設(shè)置梯度溫度，以進一步確定最適溫度范圍。所選擇

24、的溫度只能接近最適溫度，但不一定就是最適溫度。 (3)實驗操作流程及本卷須知 制備水果泥 注意：蘋果、橙子和葡萄等水果都可以作為反響物，水果不用去皮。如用蘋果為原材料，一般可按每個中等大小的蘋果加水100～200 mL的比例進展攪拌，獲得稀的蘋果泥 制備果膠酶 水果泥、果膠酶分別水浴保溫 水果泥、果膠酶混合水浴保溫 記錄果汁量 自變量：溫度(應(yīng)控制為唯一) 對照：相互對照 無關(guān)變量：果泥量、果膠酶的濃度和用量、水浴時間和混合物的pH等所有其他條件(應(yīng)控制為一樣) 設(shè)計實驗方案 確定溫度梯度→探討控制溫度的方法和措施 確定水果的種類→確定

25、制備果汁的方法→確定實驗用的水果量→確定果膠酶的量→探討測定果膠酶活性的方法 動手實驗 過濾出果汁 改變不同溫度后重復(fù)上面實驗(也可同時進展不同溫度的實驗) 記錄實驗數(shù)據(jù) 得出結(jié)論 記錄表格設(shè)計 溫度/℃ 10 20 30 40 50 60 果汁量/mL 原因：將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理，可以保證底物和酶在混合時的溫度是一樣的，防止了果泥和果膠酶混合時影響混合物的溫度，從而影響果膠酶活性的問題 原因：讓果泥和果膠酶有充分的反響時間 通過測定濾出的蘋果汁的體積大小來判斷果膠酶活性的上下原因： 果膠酶將果膠分解為小分子物質(zhì)，小分子物質(zhì)可

26、以通過濾紙，因此蘋果汁的體積大小反響了果膠酶的催化分解果膠的能力。在不同的溫度和pH下，果膠酶的活性越大，蘋果汁的體積就越大 注意：過濾果汁時漏斗中應(yīng)放置濾紙 注意：①每個探究實驗的設(shè)計，都要遵循實驗設(shè)計的一般原那么，特別是單因子變量控制原那么。 ②每個探究實驗的設(shè)計思路希是大梯度差值尋找最適范圍，再小梯度差值選出最適溫度、pH或酶用量。 ③如果隨酶濃度增加，果汁體積也增大，說明酶用量缺乏；當(dāng)酶用量達一定值時，再增加酶用量，果汁體積不變，那么說明這個值就是酶的最適用量。 ④如果變量(溫度、pH、酶濃度)梯度無法滿足實驗，即出現(xiàn)過高、過低等現(xiàn)象

27、，那么應(yīng)及時調(diào)整實驗。 血 紅 蛋 白 的 提 取 和 分 離 一、實驗原理：蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和別離各種蛋白質(zhì)。 1．凝膠色譜法〔分配色譜法〕： 〔1〕原 理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。 〔2〕凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。 〔3〕別離過程：混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。 〔4〕作用：別離蛋白質(zhì)，

28、測定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。 2．緩沖溶液 〔1〕原理：由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成〔如H2CO3－NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等〕，調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。 〔2〕緩沖液作用：抵抗外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。 3．凝膠電泳法： 〔1〕原 理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。 〔2〕別離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。 〔3〕別離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負電；參加帶負電荷多的SDS，形

29、成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物〞，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 二、實驗步驟及本卷須知 血紅蛋白的釋放 過程：①采集血樣(加檸檬酸鈉防止血液凝固)→②低速短時離心(防止白細胞沉淀)→③吸取血漿→④生理鹽水洗滌(防紅細胞破裂)→緩慢攪拌(防止紅細胞破裂釋)⑤低速短時離心→⑥重復(fù)洗滌三次→⑦上清液中無黃色，說明紅細胞已洗滌干凈。 目的：除去雜蛋白 紅細胞 的洗滌 過程：加蒸餾水→加40％體積的甲苯→磁力攪拌器攪拌 目的：紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白 注意：參加蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要一樣。參加甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋

30、白的釋放和別離 別離血紅 蛋白溶液 過程：離心〔2000r/min〕 目的：別離血紅蛋白和其他雜質(zhì) 結(jié)果 第1層(最上層)：甲苯層(無色透明) 第2層(中上層)：脂溶性物質(zhì)的沉淀層(白色薄層固體) 第3層(中下層)：血紅蛋白的水溶液層(紅色透明液體) 第4層(最下層)：雜質(zhì)的沉淀層(暗紅色) 透 析 原理：透析袋能使小分子自由進出，而將大分子保存在袋內(nèi) 過程：血紅蛋白溶液裝入透析袋→將透析袋放入磷酸緩沖液中→透析12h 目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或用于更換樣品的緩沖液 1.樣品處理 2.粗別離 3.純 化 調(diào)節(jié)緩

31、沖液面 翻開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口 參加蛋白質(zhì)樣品 調(diào)節(jié)緩沖液面 洗 脫 收集分裝蛋白質(zhì) 4.純度鑒定 凝膠色譜柱 裝填 步驟：固定(色譜柱垂直固定在支架)→裝填(將凝膠懸浮液一次性裝填) →洗滌(目的：使凝膠裝填嚴密) 要求：嚴密、均勻(否那么，會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響別離的效果) 裝填成功檢測：①凝膠是一種半透明的介質(zhì)，可在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 ②參加大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動是否均勻、狹窄、平整

32、。如紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，否那么重新裝柱。 用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后，翻開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后，關(guān)閉出口 參加20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 連接緩沖液洗脫瓶，翻開下端出口，進展洗脫 方法：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集 檢測別離是否成功：如果凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明別離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(選做)

33、 胡 蘿 卜 素 的 提 取 一、胡蘿卜素基礎(chǔ)知識 1．原理：根據(jù)胡蘿卜素易溶于有機溶劑的特點，可采取有機溶劑萃取的方法來提取胡蘿卜素。即將粉碎、枯燥的植物原料用有機溶劑浸泡，使胡蘿卜素溶解在有機溶劑中，再蒸發(fā)出有機溶劑可獲得。 2．萃取劑的選擇 〔1〕有機溶劑的分類：分為水溶性〔如乙醇和丙酮〕和水不溶性〔如石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳〕兩類。多數(shù)對人體有一定毒性。 〔2〕選取萃取胡蘿卜素的有機溶劑的原那么 ①具有較高的熔點，能夠充分溶解胡蘿卜素，并且不與水混溶；②萃取效率高；③對人無毒

34、、不易燃、易與產(chǎn)品別離、不影響產(chǎn)品質(zhì)量 萃取胡蘿卜素的有機溶劑應(yīng)該具有較高的沸點，能夠充分溶解胡蘿卜素且不與水混溶。另外，還要考慮對人體是否有毒性等安全問題。因乙醚的沸點較低，苯和四氯化碳對人體有毒性，所以本實驗選用石油醚或乙酸乙酯作為萃取劑。 胡蘿卜 粉碎 目的：便于胡蘿卜素能充分溶解 注意：顆粒要小 枯燥 萃取 過濾 濃縮 胡蘿卜素 目的：除去水分 注意：控制溫度、時間 目的：使胡蘿卜素充分溶解 注意：①不能明火加熱 ②冷凝回流，防萃取液揮發(fā) 影響因素：主要是萃取劑的性質(zhì)和量；其次是原料顆粒的大小、嚴密程度、含水量、萃取的溫度、萃取時間的長短等 目的：

35、除去顆粒等雜質(zhì) 目的：除去有機溶劑 裝置：蒸餾裝置 注意：①不能明火加熱 ②收集瓶口可用錫箔或牛皮紙遮蓋 胡蘿卜素粗品的鑒定 方法：紙層析法， 原理：混合物各組分在層析液中的溶解度不同，隨層析液在濾紙上的擴散速度不同，溶解度大的隨層析液在濾紙上的擴散速度快，反之那么慢，這樣，同一種物質(zhì)在濾紙上的擴散速度一樣，最終位置也一樣。 流程：量作基線：下端距底邊2cm處劃基線，在基線上取A、B、C、D四個點 對照點樣：在A、D點點標準樣品，B、C點點提取樣品 枯燥層析：吹干濾紙溶劑，放入層析容器中層析 比照觀察：比照觀察樣品色素點與標準色素點的異同。 結(jié)果分析：如果萃取樣品中出現(xiàn)了和標準樣品一樣的層析帶，說明提取胡蘿卜素的實驗成功。由于提取物中含有雜質(zhì)，萃取樣品的顏色可能比標準樣品的顏色淺，我們也可以通過顏色的比較，初步確定提取的胡蘿卜素的量。 注意： ①選擇枯燥的濾紙，為防止操作時濾紙的污染，應(yīng)盡量防止用手直接接觸濾紙，可以戴手套進展操作 ②點樣時應(yīng)注意點樣斑點不能太大(直徑應(yīng)小于0.5cm)，如果用吹風(fēng)機吹干，溫度不宜太高，否那么斑點會變黃 ③卷紙時注意濾紙兩邊不能互相接觸，以免因毛細現(xiàn)象導(dǎo)致溶劑沿濾紙兩邊的移動加快，溶劑前沿不齊，影響效果 二、操作流程及注意： 。