實驗四:魚類細胞培養(yǎng)基礎知識.ppt
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實驗四動物細胞培養(yǎng)基的配置和原代培養(yǎng),一實驗項目簡介,1、實驗學時6學時2實驗過程:A動物細胞培養(yǎng)液的配置B采用組織培養(yǎng)法培養(yǎng)魚類細胞,二、實驗原理,原代細胞培養(yǎng)是指直接從動物體內獲取的細胞、組織或器官,經體外培養(yǎng)后,直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng),首先用無菌操作的方法,從動物體內取出所需的組織(或器官),經消化,分散為單個游離的細胞,在人工培養(yǎng)下,使其不斷的地生長及繁殖。細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹的實驗技術。,魚類細胞組培的一些方法:,(1)組織塊固定法當組織量較少時可采用此法。它是將組織剪成約一立方毫米的小塊,按一定比例將組織塊貼在瓶壁上,至少三十分鐘以上,然后輕輕加人營養(yǎng)液置溫箱培養(yǎng)。(2)機械分散法此法適用于細胞間連接較松散的組織,如胚胎組織及幼魚全魚。將組織剪成約一立方毫米耐的小塊,放入底部有一銅網的注射器內,用手的壓力將組織擠出網孔,最后將分散的組織吹打后加人營養(yǎng)液分裝培養(yǎng)。(3)絡合劑分散法目前使用的絡合劑主要是乙二胺四乙酸,它能與細胞間鈣離子、鎂離子結合而使細胞連接松散,經吹打即可分散。該法目前主要用于囊胚細胞培養(yǎng)及上皮型細胞系的傳代。(4)酶消化法該法是目前采用極為廣泛的方法,適用于絕大多數組織器官。所用的酶主要是胰酶,常用濃度是0.25%。根據酶消化時溫度的不同,又可進一步分為冷消化法及熱消化法。(5)冷消化法此法是將組織剪成約刀的小塊,然后置一倍體積的胰酶中,四攝氏度培養(yǎng)。,三、實驗目的,1、掌握動物細胞培養(yǎng)緩沖液、消化液的配置。2掌握動物細胞原代培養(yǎng)的基本過程。,四、實驗試劑,DMEM培養(yǎng)基胰蛋白酶Hanks緩沖液抗生素溶液牛血清70%乙醇去離子水,五、實驗用品,器材:解剖剪、解剖鑷、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好,,六、實驗步驟,培養(yǎng)液的配置1、DMEM培養(yǎng)液的配置:將1袋袋裝的干粉溶解于1L去離子水中,加3.7gNaHCO3,溶解,調節(jié)PH7.2,過濾除菌,4℃保存。2、雙抗溶液的配置:將青霉素、鏈霉素溶解于生理鹽水中,至青霉素最終濃度為100U/mL。,六、實驗步驟,3、D-Hanks緩沖溶液:稱取8gNaCl,0.4gKCl,0.06gNa2HPO4,0.06gKH2PO4,0.35gNaHCO3溶解于1000mL去離子水中,高壓滅菌,4℃保存。,六、實驗步驟,魚類細胞的組織培養(yǎng)法1.取材:迅速處死動物,無菌分離肝臟,置D-Hanks液中,沖洗肝臟至灰白色。,,六、實驗步驟,2.接種、培養(yǎng):將肝臟剪成1mm1mm1mm的組織塊,用D-Hanks液洗3次,去掉血細胞,37℃下用0.25%的胰蛋白酶消化10min,倒掉消化液后用D-Hanks液洗2次,培養(yǎng)液洗2次,將肝組織塊貼壁于組織培養(yǎng)瓶中,每個培養(yǎng)瓶放組織塊20~25塊。加少許培養(yǎng)液,將培養(yǎng)瓶倒轉置于培養(yǎng)箱中,在37℃條件下培養(yǎng),2h后補充培養(yǎng)液,并翻轉培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。,六、實驗步驟,3.觀察置于37℃培養(yǎng)的細胞.需逐日進行觀察.主要觀察:(1)培養(yǎng)物是否被污染,如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁,表示該瓶被污染。(2)細胞生長狀況與培養(yǎng)液顏色的變化,如培養(yǎng)液變?yōu)樽霞t色,一般細胞生長不好。可能是瓶塞未蓋緊或營養(yǎng)液pH過高。,六、實驗步驟,待細胞已基本長成致密單層時,此時即可進行傳代培養(yǎng)了。,七、注意事項,細胞培養(yǎng)要求無菌操作。無菌是細胞培養(yǎng)成功的首要條件。重視進人無菌室操作前必須將培養(yǎng)瓶外表消毒提防試劑瓶中的液體浸濕瓶蓋,這往往是試驗污染的重要因素之一。,八魚類細胞原代培養(yǎng)意義,魚類培養(yǎng)細胞作實驗驗對象,有著活體魚無法比擬的優(yōu)點:(I)成本低,細胞系的維護不需要大型的養(yǎng)殖設備和大量的換水與換氣。(2)重復性好,實驗條件可以精確控制。因此,對魚類細胞系進行深入研究,無論在理論研究方面,還是在實際應用方面,都具有深遠意義。,八魚類細胞原代培養(yǎng)意義,在對細胞的營養(yǎng)需求有比較深人認識的基礎上,化學成分明確的無蛋白培養(yǎng)基已被用于中國倉鼠卵巢細胞匯和雜交瘤細胞的培養(yǎng)。雖然魚類細胞培養(yǎng)中尚未成功應用無血清培養(yǎng)技術,但在這方面的研究已有一定基礎,相信在不久的將來魚細胞培養(yǎng)技術會有所突破,更廣泛地應用于研究領域。,- 配套講稿:
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