中國(guó)藥典 《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》

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1、凝膠法鱟試劑使用闡明書(shū) 【名稱(chēng)】通用名：鱟試劑 英文名：Tachypleus Amebocyte Lysate （簡(jiǎn)稱(chēng)TAL） 漢語(yǔ)拼音：hou shi ji 本品重要成分為B因子、C因子、凝固酶原、凝固蛋白原。 【用途】專(zhuān)用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。 【性狀】本品為白色或類(lèi)白色凍干塊或粉末，在水和生理鹽水中易溶。 【原理】本品為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的無(wú)菌冷凍干燥品，在合適的條件下（溫度，pH值及無(wú)干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反映形成凝膠。 【用法】 1．材料和設(shè)備 1.1選擇所需的規(guī)格及敏捷度的鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用

2、水。 1.2準(zhǔn)備若干支10ⅹ75mm玻璃反映試管（若使用0.1ml規(guī)格的鱟試劑無(wú)需準(zhǔn)備此試管）、多種規(guī)格吸管或移液器或注射器、稀釋內(nèi)毒素用玻璃管、反映試管架、計(jì)時(shí)器、旋渦混合儀、恒溫水浴箱（37±1℃）。 2．實(shí)驗(yàn)操作 2.1 稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作品：取內(nèi)毒素工作品（凍干品）1支，按細(xì)菌內(nèi)毒素工作品使用闡明書(shū)進(jìn)行操作。 2.2 TAL試劑的溶解：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于TAL試劑中，輕輕振搖至少30S至試劑完全溶解。注意不要引起氣泡，溶解后的試劑應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)使用（即配即用）。 2.3 檢查操作 2.3.1 取分裝有0.1ml 鱟試劑溶液的10×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml

3、 /支規(guī)格的鱟試劑原安瓿8支，其中2支作供試品管，2支作陰性對(duì)照管，2支作陽(yáng)性對(duì)照管，2支作供試品陽(yáng)性對(duì)照管。 2.3.2 每支供試品管加入0.1ml供試品；陰性對(duì)照管加入0.1ml檢查用水；陽(yáng)性對(duì)照管加入0.1ml濃度為2λ的內(nèi)毒素溶液，供試品陽(yáng)性對(duì)照管加入0.1ml含2λ內(nèi)毒素的供試品。 2.3.3 封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37±1℃的恒溫器中孵育60±2分鐘，然后取出觀測(cè)成果。試管在孵育期間應(yīng)避免任何的振動(dòng)。 2.4 成果判斷 2.4.1 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，管內(nèi)的內(nèi)容物呈堅(jiān)實(shí)凝膠，不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為（+）；不呈凝膠或雖生成凝膠但不

4、能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（－）。 2.4.2 陰性對(duì)照管均為陰性，陽(yáng)性對(duì)照管、供試品陽(yáng)性對(duì)照管均為陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)有效，否則無(wú)效。 【注意事項(xiàng)】 1.本品僅用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，嚴(yán)禁用于注射、口服等。 2. 實(shí)驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)解決，以清除也許存在的外源性?xún)?nèi)毒素，常用的措施是在250℃干烤至少60min，也可采用其她確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的合適措施。 3.當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或?qū)嶒?yàn)條件發(fā)生了任何也許影響檢查成果的變化時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)，措施見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的“鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)”。 4.有些物質(zhì)也許引起假陽(yáng)性或假陰性，因此第一次

5、使用本品，供試品必須進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，措施見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的“干擾實(shí)驗(yàn)”。 5.若陰性對(duì)照管為陽(yáng)性，表白鱟試劑或檢查用水或?qū)嶒?yàn)器具受到污染；若陽(yáng)性對(duì)照管為陰性，表白鱟試劑或原則內(nèi)毒素已失效，或鱟試劑的敏捷度及原則內(nèi)毒素的效價(jià)標(biāo)示不精確，或原則內(nèi)毒素的稀釋有誤；供試品陽(yáng)性對(duì)照管為陰性，表白反映體系內(nèi)有克制反映的干擾因素存在。 【貯藏條件】避光，陰涼處保存。 【批準(zhǔn)文號(hào)】[88]衛(wèi)藥準(zhǔn)字SJ-02號(hào) 【規(guī)??? 格】0.1ml、0.5ml、1ml、2ml 【包??? 裝】安瓿10支裝、抗生素瓶10瓶裝 【產(chǎn)品批號(hào)】見(jiàn)外盒【生產(chǎn)日期】見(jiàn)外盒【有效期至】見(jiàn)外盒

6、【生產(chǎn)公司】公司名稱(chēng)：廈門(mén)鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司 公司地址：廈門(mén)海滄新陽(yáng)工業(yè)區(qū)新嘉路131號(hào)（361022） 銷(xiāo)售電話：（0592）2085561、2095294銷(xiāo)售傳真：（0592）2095294網(wǎng)??? 址： 中國(guó)藥典 《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》 　　 ??? 本法系運(yùn)用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量與否符合規(guī)定的一種措施。 ??? 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查涉及兩種措施，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者涉及濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種措施進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定成果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法成果為準(zhǔn)。 ??? 細(xì)菌內(nèi)毒素

7、的量用內(nèi)毒素單位（EU）表達(dá)。 ??? 細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)標(biāo)品系自大腸桿菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑敏捷度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作原則品的效價(jià)。 ??? 細(xì)菌內(nèi)毒素工作原則品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)標(biāo)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于實(shí)驗(yàn)中鱟試劑敏捷度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)及設(shè)立的多種陽(yáng)性對(duì)照。 ??? 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量不不小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。定量測(cè)定用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素的含量應(yīng)不不小于0.005EU/ml。 ??? 實(shí)驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)解決，以清除也許存在的外源性?xún)?nèi)毒素。常用的措施是在250℃干烤至少30分鐘，也可用其她確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的合適措施

8、。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾的器械。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)避免微生物的污染。 ??? 供試品溶液的制備 某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般規(guī)定供試品溶液的PH值在6.0-8.0的范疇內(nèi)。對(duì)于過(guò)酸、過(guò)堿或自身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的合適的緩沖劑調(diào)節(jié)PH值。酸或堿溶液須用檢查用水在已清除內(nèi)毒素的容器中進(jìn)行配制。緩沖液必須通過(guò)驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。 ??? 內(nèi)毒素限值的建立 藥物、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按如下公式擬定： L=K

9、/M ??? 式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表達(dá)； ????K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg·h)表達(dá)，注射劑K=5E U/(kg·h)，放射性藥物注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg·h)。 ??? M為人用每公斤體重每小時(shí)最大劑量，以ml(kg·h)、mg (kg·h)或U/ (kg·h)表達(dá)，人均體重按60kg計(jì)算，注射時(shí)間若局限性1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。 ??? 按人用劑量計(jì)算限值時(shí)，如遇特殊狀況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際狀況做必要調(diào)節(jié)，但需闡明理由。 ??? 擬定

10、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被容許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過(guò)此稀釋倍數(shù)下可進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。用如下公式來(lái)擬定MVD： MVD=CL/λ ??? 式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值； ??? C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表達(dá)時(shí)，則C等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表達(dá)時(shí)，C的單位需為mg/ml或U /ml。如供試品為注射用無(wú)菌粉末或原料藥，則MVD取1，計(jì)算供試品的最小有效濃度C=λ/L。 ??? λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示敏捷度（EU/ml），或是在光度測(cè)定法中所使用的原則曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。 ??? ??? 措施1 凝膠

11、法 ? ??? 凝膠法系通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反映的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的措施。在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示敏捷度，用EU/ml表達(dá)。 ??? 鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn) 當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或?qū)嶒?yàn)條件發(fā)生了任何也許影響檢查成果的變化時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)。 ??? 根據(jù)鱟試劑敏捷度的標(biāo)示值（λ），將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)標(biāo)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作原則品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素原則溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取具有分裝了0.1ml鱟試劑溶液的1

12、0mm×75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素原則溶液，及每一種濃度平行做4管；此外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃合適恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)導(dǎo)致假陰性成果。 ??? 若最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，實(shí)驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反

13、映終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑敏捷度的測(cè)定值(λc). λc=1g-1(∑X/4) ??? 式中X為反映終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。反映終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一種呈陽(yáng)性成果的濃度。 ??? 當(dāng)λc在0.5λ-2λ(涉及0.5λ和2λ)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示敏捷度λ為該批鱟試劑的敏捷度。 ??? 干擾實(shí)驗(yàn) 按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢查出內(nèi)毒素且不超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下操作。 只有當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的成果在鱟試劑敏捷度復(fù)核范疇內(nèi)時(shí)，實(shí)驗(yàn)方為有效。

14、按下式計(jì)算C和B的反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) ??? 式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反映終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。 ??? 當(dāng)Es在0.5λ-2λ(涉及0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (涉及0.5 Es和2 Es)時(shí)，覺(jué)得供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。若供試品溶液在不不小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋?zhuān)俜磸?fù)干擾實(shí)驗(yàn)。 表1 凝膠法干擾實(shí)驗(yàn)溶液的制備 編號(hào) 內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液 稀釋用液 稀釋倍數(shù) 所含內(nèi)毒 素的濃度 平

15、行 管數(shù) A 無(wú)/供試品溶液 - - - 2 B 2λ/供試品溶液 供試品溶液 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 4 4 4 4 C 2λ/檢查用水 檢查用水 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 4 4 4 4 D 無(wú)/檢查用水 - - - 2 注：A 供試品溶液；B干擾實(shí)驗(yàn)系列；C鱟試劑標(biāo)示敏捷度的對(duì)照系列；D陰性對(duì)照。 ??? 可通過(guò)對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過(guò)其她合適的措施（如過(guò)濾、中和、透析或加熱解決等）排除干擾。為保證所選擇的解決措施能有效的排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒

16、素失去活性，要使用預(yù)先添加了原則內(nèi)毒素再通過(guò)解決的供試品溶液進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。 ??? 當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)前，或無(wú)內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。 ??? 當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝變化或?qū)嶒?yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有也許影響實(shí)驗(yàn)成果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。 ??? 檢查法 ??? 1）凝膠限量實(shí)驗(yàn) ??? 按表2制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來(lái)制備溶液A和B。按鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下操作。 表2 凝膠限量實(shí)驗(yàn)溶液的制備 編號(hào) 內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液 平行管數(shù) A 無(wú)/供試品溶液 2 B

17、 2λ/供試品溶液 2 C 2λ/檢查用水 2 D 無(wú)/檢查用水 2 ??? 注：A供試品溶液；B供試品陽(yáng)性對(duì)照；C陽(yáng)性對(duì)照；D陰性對(duì)照。 ??? 成果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀測(cè)成果。若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照B的平行管均為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照溶液C的平行管均為陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)有效。 ??? 若溶液A的兩個(gè)平行管都為陰性，判供試品符合規(guī)定；若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽(yáng)性，判供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽(yáng)性另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。 ??? 2）凝

18、膠半定量實(shí)驗(yàn) ??? 本措施系通過(guò)擬定反映終點(diǎn)濃度來(lái)量化供試品中內(nèi)毒素的含量。依表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑敏捷度復(fù)核實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下操作。 ??? 成果判斷 若陰性對(duì)照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽(yáng)性對(duì)照B的平行管均為陽(yáng)性，系列溶液C的反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5λ-2λ之間，實(shí)驗(yàn)有效。 ??? 系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個(gè)系列的反映終點(diǎn)濃度，所有平行管反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度（按公式CE=1g-1(∑X/2)）。如果實(shí)驗(yàn)時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將成果乘上稀釋倍數(shù)。 ??? 如實(shí)驗(yàn)中供試品溶液的成

19、果都為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度不不小于λ（如果檢查的是稀釋過(guò)的供試品，則記錄為不不小于λ乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。如果成果都為陽(yáng)性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度不小于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。 ??? 若內(nèi)毒素濃度不不小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度不小于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。 表3 凝膠半定量實(shí)驗(yàn)溶液的制備 編號(hào) 內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液 稀釋用液 稀釋倍數(shù) 所含內(nèi)毒素的濃度 平行管數(shù) A 無(wú)/供試品溶液 檢查用水 1 2 4 8 - - - - 2 2 2 2 B 2λ/供試品溶液 　 1 2λ 2

20、C 2λ/檢查用水 檢查用水 1 2 4 8 2λ 1λ 0.5λ 0.25λ 2 2 2 2 D 無(wú)/檢查用水 - - - 2 注：A：沒(méi)有超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)的供試品溶液。用檢查用水進(jìn)行2倍系列稀釋?zhuān)瑥耐ㄟ^(guò)干擾實(shí)驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開(kāi)始再稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，但隨后的稀釋也不得超過(guò)MVD； ??? B：含2λ濃度原則內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽(yáng)性對(duì)照）； ??? C：含2λ、1λ、0.5λ和0.25λ濃度原則內(nèi)毒素的檢查用水系列； ??? D：陰性對(duì)照。 　??? 措施2 光度測(cè)定法 ???? 光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。 ??

21、? 濁度法系運(yùn)用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反映過(guò)程過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的措施。根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是根據(jù)反映混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終結(jié)時(shí)的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的措施。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反映混合物的濁度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反映時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增長(zhǎng)速度的措施。 ??? 顯色基質(zhì)法系運(yùn)用鱟試劑與內(nèi)毒素反映過(guò)程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的措施。根據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是根據(jù)反映混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終結(jié)時(shí)釋放出的有色團(tuán)的量之間存在著量化

22、關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量的措施。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反映混合物的色度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反映時(shí)間，或是檢測(cè)色度增長(zhǎng)速度的措施。 ??? 光度測(cè)定實(shí)驗(yàn)應(yīng)在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37℃±1℃。 ??? 供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)闡明進(jìn)行。 ??? 為保證濁度和顯色實(shí)驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)以及供試品溶液的干擾實(shí)驗(yàn)。 ??? 原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn) 當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或?qū)嶒?yàn)條件發(fā)生了任何也許會(huì)影響檢查成果的變化時(shí)，需進(jìn)行原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)。 ??? 用原則內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰

23、濃度間稀釋倍數(shù)不得不小于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。每一稀釋環(huán)節(jié)的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同步規(guī)定做2支陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反映，將所有數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。 ??? 根據(jù)線性回歸分析，原則曲線的有關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)當(dāng)不小于或等于0.980，實(shí)驗(yàn)方為有效。否則須重新實(shí)驗(yàn)。 ??? 干擾實(shí)驗(yàn) 選擇原則曲線中點(diǎn)或一種接近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。每種溶液至少做2個(gè)平行管。 表4 光度測(cè)定法干擾實(shí)驗(yàn)的制備 編號(hào) 內(nèi)毒素濃度 配制內(nèi)毒素的溶液 平行管數(shù) A 無(wú) 供試品溶液 不少于2個(gè) B 原

24、則曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的濃度（設(shè)為λm） 供試品溶液 不少于2個(gè) C 至少3個(gè)濃度（最低一點(diǎn)設(shè)定為λ） 檢查用水 每一濃度不少于2個(gè) D 無(wú) 檢查用水 不少于2個(gè) 注 A：稀釋倍數(shù)未超過(guò)MVD的供試品溶液。 ?? B：加入原則曲線中點(diǎn)或接近中點(diǎn)的一種已知內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有相似稀釋倍數(shù)的供試品溶液。 ?? C：如“原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)下描述的，用于制備原則曲線的原則內(nèi)毒素溶液。 ?? D：陰性對(duì)照。 ??? 按所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含原則內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計(jì)算該實(shí)驗(yàn)條件下的回收率（R）。 R=(CS-Ct

25、)/λm×100% ??? 當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%~200%之間，則覺(jué)得在此該實(shí)驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。 ??? 當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定的范疇時(shí)，須按“凝膠法干擾實(shí)驗(yàn)”中的措施清除干擾因素。并要反復(fù)干擾實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證解決的有效性。 ??? 當(dāng)鱟試劑、供試品的來(lái)源、配方、生產(chǎn)工藝變化或?qū)嶒?yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有也許影響實(shí)驗(yàn)成果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。 ??? 檢查法 ??? 按“光度法的干擾實(shí)驗(yàn)”中的操作環(huán)節(jié)進(jìn)行檢測(cè)。 ??? 使用溶液C生成的原則曲線來(lái)計(jì)算溶液A的每一平行管的內(nèi)毒素濃度。 ??? 實(shí)驗(yàn)必須符合如下三個(gè)條件方為有效： ??? （1）系列溶液C的成果要符

26、合 “原則曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)”中的規(guī)定。 ??? （2）用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范疇內(nèi)。 ??? （3）溶液D在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反映。 ??? 若供試品溶液所在平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)和濃度后，不不小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若不小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。 ??? （注：本檢查法中，“管”的意思涉及其她任何反映容器，如微孔板中的孔。）? ??????????????????????來(lái)源--中華人民共和國(guó)藥典 附錄Ⅺ E?? 廈門(mén)鱟試劑廠整頓 　　　 　?? 中國(guó)藥典

27、和美國(guó)藥典中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法的不同點(diǎn)比較 Requirements CP USP 細(xì)菌內(nèi)毒素工作原則品（CSE） 對(duì)CSE的用途及效價(jià)進(jìn)行定義“細(xì)菌內(nèi)毒素工作原則品中每1ng細(xì)菌內(nèi)毒素的效價(jià)應(yīng)不不不小于2EU，不不小于50EU” 未提到CSE 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 與敏捷度為0.03EU/ml或更高敏捷度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時(shí)不產(chǎn)生凝集反映的滅菌注射用水 與鱟試劑在限定的敏捷度下不發(fā)生反映的滅菌注射用水或其他水 用于細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)定用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，內(nèi)毒素含量應(yīng)不不小于0.005EU/ml 未提到 實(shí)驗(yàn)用品的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)所用器皿需經(jīng)解決，除去也許存在

28、的外源性?xún)?nèi)毒素，常用的措施是250℃下干烤至少1小時(shí)，也可用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的合適措施。 使用經(jīng)驗(yàn)證的除熱原程序?qū)λ胁Ａ髅蠛陀鰺岱€(wěn)定的材料在熱空氣烘箱中進(jìn)行除熱原，常用的最低溫度和至少的時(shí)間是250℃下30分鐘 實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)避免微生物污染 未提到 內(nèi)毒素原則品儲(chǔ)藏液和原則品溶液的制備 未提到 USP的RSE的效價(jià)定為10,000USP EU/支，用5ml鱟試劑檢查用水復(fù)溶1支RSE的所有內(nèi)容物，用漩渦混合器間歇混合30分鐘，并用此原液作系列稀釋?zhuān)瑢⒃褐糜诒裰斜４娌怀^(guò)14天，作后來(lái)的稀釋之用，在使用前用漩渦混合器強(qiáng)力混合不少于3分鐘，在作下一步稀釋前需對(duì)前面的

29、稀釋液混合不少于30秒，不要貯存稀釋液，由于沒(méi)有數(shù)據(jù)能證明其不會(huì)由于吸附作用而失去活性。 供試品溶液的制備 某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提 用LRW復(fù)溶或稀釋藥物或抽提醫(yī)療器械，某些物質(zhì)也許更適于用其他水性溶液來(lái)溶解、稀釋或抽提 對(duì)于過(guò)酸、過(guò)堿或自身有緩沖能力的供試品需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，一般規(guī)定供試品溶液的pH值在6.0-8.0的范疇內(nèi) 如果需要，可調(diào)節(jié)待測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，以使鱟試劑和樣品的混合物的pH范疇落在鱟試劑生產(chǎn)商指定的范疇內(nèi)，這一般合用于pH值在6.0-8.0范疇內(nèi)的產(chǎn)品 內(nèi)毒素限值的建立 藥物、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）

30、一般按如下公司擬定：L=K/M 非經(jīng)腸道藥物的內(nèi)毒素限值，以劑量定義，等于K/M K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kg.h)表達(dá)。注射劑，K=5EU/(kg.h)，其中放射性藥物注射劑，K=2.5EU/(kg.h)，鞘內(nèi)用注射劑，K=0.5EU/(kg.h) 除了鞘內(nèi)給藥以外的任何給藥途徑，K均為5 USP-EU/kg，鞘內(nèi)給藥時(shí)，K為0.2 USP-EU/kg，對(duì)于非鞘內(nèi)給藥放射性藥物，內(nèi)毒素限值的計(jì)算為175/V，V為以mL為單位的最大推薦劑量，對(duì)于鞘內(nèi)給藥的放射性藥物，其內(nèi)毒素限值為14/V，對(duì)于按以每平方體表面積計(jì)算的給藥劑量（一般是抗

31、腫瘤藥物），計(jì)算公式為K/M，其中K=5EU/kg，M為（最大劑量/m2/小時(shí)×1.80m2)/70kg 敏捷度復(fù)核算驗(yàn) 未闡明 至少用每批鱟試劑中的1支試劑進(jìn)行敏捷度復(fù)核算驗(yàn) 當(dāng)最大濃度2.0λ管為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性時(shí)，實(shí)驗(yàn)方為有效 濃度最低的原則品溶液的所有反復(fù)管均為陰性，實(shí)驗(yàn)方為有效 按下式計(jì)算反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑敏捷度的測(cè)定值（λc）： λc=lg-1(ΣX/4) 用下式計(jì)算終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值的平均值，然后再計(jì)算該平均值的反對(duì)數(shù)： 終點(diǎn)濃度的幾何平均值= antilog(Σe/f) Σe是稀釋系列的終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值之

32、和，f為反復(fù)管數(shù)，反映終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為鱟試劑敏捷度的測(cè)定值 凝膠法限量實(shí)驗(yàn) 溶液制備中的表添加了內(nèi)毒素的溶液為“供試品溶液” 為“經(jīng)稀釋的供試品溶液” 使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品液來(lái)制備溶液A和B 使用稀釋倍數(shù)不超過(guò)MVD的稀釋液來(lái)制備溶液A和B 在復(fù)試中，溶液A需做4支平行管，當(dāng)所有平行管都為陰性時(shí)，供試品溶液符合規(guī)定 在復(fù)試中，如果溶液A的兩支平行管均為陰性，供試品溶液符合規(guī)定 未闡明 如果供試品溶液以不超過(guò)MVD的某個(gè)稀釋倍數(shù)稀釋?zhuān)瑱z測(cè)成果為陽(yáng)性時(shí)，可進(jìn)一步稀釋供試品溶液但不能超過(guò)MVD，再重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 光度測(cè)定法 所有的光度測(cè)定實(shí)驗(yàn)都

33、規(guī)定在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般在37±1℃ 所有的光度法實(shí)驗(yàn)都應(yīng)在鱟試劑供應(yīng)商推薦的恒溫溫度下進(jìn)行，一般為37±1℃ 未提到 如果動(dòng)態(tài)法中所需的濃度范疇不小于兩個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，應(yīng)增長(zhǎng)一種原則品以便在原則曲線范疇內(nèi)涉及每個(gè)對(duì)數(shù)增長(zhǎng) 溶液D（陰性對(duì)照）在規(guī)定的反映時(shí)間內(nèi)沒(méi)有可檢測(cè)到的內(nèi)毒素 陰性對(duì)照系列D的成果不超過(guò)所用鱟試劑所闡明的空白對(duì)照限值 細(xì)菌內(nèi)毒素化學(xué)構(gòu)造(LPS)： (1) O-特異性多糖鏈(親水端) (2) 核心多糖 (3) 類(lèi)脂A（生理活性中心）(疏水端) 細(xì)菌內(nèi)毒素在水溶液中的狀態(tài)： 細(xì)菌內(nèi)毒素很容易吸附在容器

34、壁上或匯集在一起，中國(guó)藥典明確注明：細(xì)菌內(nèi)毒素溶液要混旋15min和30s，以充足混勻。 1.4 細(xì)菌內(nèi)毒素的耐熱特性 由于細(xì)菌內(nèi)毒素要在高溫250℃ 30分鐘才干完全滅活，因此在制藥工業(yè)和一次性醫(yī)療器械及血袋等生產(chǎn)工藝中都是讓人頭疼的問(wèn)題，檢測(cè)使用的多種玻璃器材均應(yīng)嚴(yán)格清除內(nèi)毒素后才干使用，我們提供的成品實(shí)驗(yàn)器材要通過(guò)7道嚴(yán)格工序才達(dá)到規(guī)定。 2 鱟試劑（TAL） 海洋節(jié)肢動(dòng)物——鱟 鱟血提獲得生物制劑——鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素和鱟試劑生化反映原理： 細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS） 1,3-(β,D)-葡聚糖 C因子 被活化為活化C因子 B因子 被活化為活化B因子 G因子 被活化為活化G因子 凝固酶原產(chǎn)生 凝固酶 凝固蛋白原產(chǎn)生凝固蛋白（凝膠） 革蘭氏陰性菌死亡 真菌等代謝產(chǎn)生 鱟試劑有兩條反映通路，可檢測(cè)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌產(chǎn)生的 1,3-(β,D)-葡聚糖，即可以間接檢測(cè)革蘭氏陰性菌和真菌的存在，目前試劑廠家可以提供分別針對(duì)于這兩種物質(zhì)的特異性鱟試劑