工業(yè)用溶菌酶行業(yè)標準簡要編制說明

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《工業(yè)用 溶菌酶 》行業(yè)標準 簡要 編制說明 一、 工作簡況 （一）任務來源、起草單位、起草人 本標準由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院組織上報，被列入工業(yè)和信息化部 2012 年行業(yè)標準制修訂計劃， 計劃名稱為《工業(yè)用溶菌酶》， 項目編號 2012本標準由中國輕工業(yè)聯(lián)合會提出， 全國食品 標準化中心 歸口 。 本標準主要起草單位略。本標準主要起草人略。負責標準技術資料查詢、收集及對比，檢測方法的驗證比對，樣品檢測及數(shù)據(jù)整理，標準文本及編制說明的起草、撰寫，行業(yè)內(nèi)征求意見，組織標準的初審討論會及標準報送等。 （二）簡要起草過程 標準任務下達后，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院針對制定工業(yè)用溶菌酶行業(yè) 標準的具體工作進行了認真研究，確定了總體工作方案， 于 2012 年 12 月組建了標準起草工作組 。起草工作組 首先 查閱相關的國內(nèi)外技術標準資料，在參照國際和國外先進標準的基礎上，結合目前國內(nèi)市場產(chǎn)品的實際情況，初步確定了產(chǎn)品的質(zhì)量技術指標和相應的試驗方法，形成了標準草案 （第一稿） 。 2013 年 5 月，工作組在北京召開 第一次 討論會對標準草案進行討論研究， 綜合各方意見，對一些尚存在異議的內(nèi)容進行進一步整理 ， 修改成 標準草案 （第二稿），同時 確定了進一步的對比驗證工作 ， 2013 年 6 月～ 2014 年 4 月，起草組完成樣品的搜集，測定底物、標準品的購置、轉(zhuǎn)化及試驗方法的驗證調(diào)整工作。 2014 年 5 月，工作組在北京召開 第二次 討論會 ， 經(jīng)過大家的認真、細致的討論研究，對標準中涉及的主要關鍵問題達成共識， 會后 又經(jīng) 多次 溝通研究，并 于 2015 年 11 月 修改 形成征求意見稿，向行業(yè)內(nèi)公開征集意見 。 二、 對主要條款的說明 （ 一 ） 主要內(nèi)容 據(jù)起草工作組調(diào)研和查閱，目前 菌酶）和 1992）酸鹽溶菌酶）、日本食品添加劑公 定書第八版 s 品添加劑溶菌酶標準規(guī)范） 及 原衛(wèi)生部2010公告 均已公布了溶菌酶的質(zhì)量規(guī)格 要求 。 質(zhì)量規(guī)格特指鹽酸鹽溶菌酶； 限定蛋清來源，給出酶活力測定方法，不限工藝，也沒有給出特定質(zhì)量規(guī)格；日本公定書針對溶菌酶產(chǎn)品，工藝上涵蓋原衛(wèi)生部公告的溶菌酶產(chǎn)品，因此，本標準制定綜合考慮上述質(zhì)量標準給出本標準技術要求。對比情況見附表 1、附表 2。本標準的主要技術內(nèi)容說明如下： 本標準編寫符合 規(guī)定。 1. 酶活力 酶活力對于酶制劑產(chǎn)品即是性能指標也相當于鑒別指標。 據(jù)酶活力定義，直接測定計算溶菌酶活力，對活力大小沒有給出限值； 對鹽酸鹽工藝的溶菌酶，以純度指標表達相對酶活，并規(guī)定純度指標 ≥95%，原衛(wèi)生部 2010公告兩個指標全部規(guī)定，但酶活力指標的規(guī)定單位為企業(yè)申報的方法及單位。本標準認為活力指標與純度指標沒有必要同時設定， 活力測定方法快速、簡單，不依賴于標準酶的使用，因而酶活力采納 定義及計算，試劑的使用及溶液的配 制，考慮操作的方便，給出細微調(diào)整。 一個溶菌酶活力單位定義為 25℃ ， 件下，使用溶壁微球菌懸濁液在 450每分鐘引起吸光度變化為 溶菌酶的量。直接采納 活力單位定義。 2. 水分 原衛(wèi)生部 2010公告， 日本公定書對溶菌酶的水分要求均限定在 ≤6%（固體），本標準與之保持一致。檢測方法采用國標 品安全國家標準 食品中水分的測定》。 3. 灰分 與原衛(wèi)生部公告一致固體 ≤液體 ≤檢測方法采用國標 品安全國家標 準 食品中灰分的測定》。 4. 衛(wèi)生部公告值固體產(chǎn)品 體產(chǎn)品 本規(guī)定≥于該指標與工藝有關，且溶菌酶在酸性條件下化學性質(zhì)、熱穩(wěn)定性均較好，且該指標與安全性無直接關系，因此本標準綜合考慮 定在 范圍內(nèi)。溶液測定 5. 抑菌作用 在目前市場上溶菌酶有微生物發(fā)酵、蛋清提取等不同來源，來源不同抑菌 作用 也差別很大。為了確保溶菌酶的質(zhì)量，在《溶菌酶》行業(yè)標準中，增加定性抑菌試驗檢測 。 抑菌環(huán)直徑＞ 6 判為有抑菌作用；抑菌環(huán)直徑≤ 6 為無抑菌作用。 2 次重復試驗均有抑菌作用，判為合格。 6. 食品安全要求 應符合 國家相關 規(guī)定 。 7. 酶活力的測定 標準草稿中酶活測定方法等同轉(zhuǎn)化 方法，但實驗室在驗證時發(fā)現(xiàn)直接按 法獲得酶活測定結果，測定底物濃度與儀器初始濃度存在不匹配的問題，且實驗過程中必須規(guī)定相關細節(jié)才能保證實驗結果的準確、一致性。因此，本標準中的酶活測定方法參照 測定方法做適當調(diào)整，具體調(diào)整如下： ——測定用底物：為了保證酶活測定的準確性及一致性，必須指定測定用底物，其中定使用 壁微球菌，底物配制時按干菌粉給出配制方法及初始底物溶液吸光值； 接指定 同等分析效果的產(chǎn)品。作為一般企業(yè)或質(zhì)檢機構 種購進手續(xù)繁瑣，且存在被告知為國內(nèi)限制購入產(chǎn)品而無法購得的可能。 活菌制品，價格昂貴，且為一次性使用產(chǎn)品，對于企業(yè)連續(xù)測定成本較高。為了便于標準發(fā)布后測定方法的有效執(zhí)行，起草組委托食發(fā)院菌種中心引進 種，并接種培養(yǎng)配制成不同濃度，配合起草組各實驗室進行 法的有效轉(zhuǎn)化。起草過程中有關單位提出，菌種的接種培養(yǎng)及稀釋度的控制專業(yè)性較強，如果直接要求菌種中心提供合適濃度的菌懸液，又存在運輸困難且由于運輸、儲存條件的變化造成菌液不穩(wěn)定的情況。因此，本標準制定也考慮自制標準測定用菌粉的可能。經(jīng)實驗比對，文本給出 號及對應 種編號，同時考慮給出 粉編號。日本也是制定本國菌種編號及標準酶編號。 ——底物溶液： 空氣調(diào)分光光度計零點，底物溶液的吸光度， 450讀數(shù)應為 吸光度降低的速度應在 位 /標準以磷酸鹽緩沖液調(diào)分光光度計零點，然后測定底物溶液的吸光度， 450讀數(shù)應為 ——酶活力測定步驟：增加 “3內(nèi)初始吸光度值變化應小于等于 ，方可開始測定 ”，確保底物溶液的穩(wěn)定且沒有受到溶菌酶的污染；增加 “反應 1穩(wěn)定，計算時忽略最初 1讀數(shù) ”，以保證酶活測定 在有效的線性范圍內(nèi)，保證酶活測定的準確性。 附表 1：國內(nèi)外溶菌酶質(zhì)量規(guī)格指標對照表 項目 標準 本標準 原 衛(wèi)生部 2010公告 日本公定書 第八版 （溶菌酶） 992（鹽酸鹽溶菌酶） 范圍 本標準適用于從雞蛋清中提取、精制等工藝制得的工業(yè)用溶菌酶 用離子交換樹脂從雞蛋清中提取溶菌酶，然后經(jīng)洗脫、離心過濾、低壓反滲透過濾、巴氏殺菌制得液體型溶菌酶產(chǎn)品；將液體型溶菌酶進行噴霧干燥制得粉末型溶菌酶產(chǎn)品 能溶解細菌細胞壁物質(zhì)的一種酶制劑，來源于蛋清，用堿性水溶液或鹽溶液處理后用樹脂純化，或用柱 純化，或樹脂純化后再結晶，或加鹽處理 從雞蛋蛋清中提取的，由 129 個氨基酸組成的多肽，分子量大約為 14000，有酶活性 ，可以水解細菌，尤其是革蘭氏陽性細菌的外膜中的連接 （ 1；通常以鹽酸鹽型的形式獲取，用于食品加工。必須符合食品加工處理所用酶制品的通用技術指標 性狀 白色至淡黃色粉末；淺 黃色至深褐色液體 白色至淡黃色粉末；淺黃色至深褐 色液體 無味白色粉末 白色無味粉末 鑒別 — — B： 酸鹽緩沖液于 279281有最大吸收 A：可溶于水，不溶于有機溶劑和濃鹽溶液 B： 2500溶液，紫外吸光度值252281量測定（純度） — ≥95% — ≥95% 溶液透明度 — — ≥ 51%溶液，要時可用稀鹽酸調(diào) — 體） ≥200） 分， % ≤6（固體） ≤6（固體） ≤體） ≤6（固體） 總干物質(zhì) — ≥94%； ≥22%（液體） — — 項目 標準 本標準 原 衛(wèi)生部 2010公告 日本公定書 第八版 （溶菌酶） 992（鹽酸鹽溶菌酶） 酶活力 符合聲稱 ≥07g； ≥9×106g 以干基計酶活性不小于 灰分 ， % ≤體） ≤體） ≤體） ≤體） — ≤菌作用 合格 — — — 氮， % — ， % — ≤體） ≤， % — ≤ ≤表 2： 國內(nèi)外溶菌酶標準試驗方法對照表 標準 項目 本標準 日本公定書第八版（溶菌酶） 中國藥典 （ 水分 ， % 取樣 膠減壓 2 小時 減壓干燥 酶活力 修改采用始吸光度 照藥典） 比濁法，以溶壁微球菌培養(yǎng)液為底物，溶菌酶可以溶解溶壁微球菌，使吸光度降低，且其降低程度與溶菌酶的活性成正比。緩沖液 25℃ ）底物溶液球菌濃度 30～4000 對照標準溶液和樣品溶液濃度 1mg/將1色皿放入分光光度計，調(diào)整吸光度零點；吸 物溶液于比色皿；最初 450 準制備液加入底物溶液，充分混合。記錄 3吸光度的降低，每 15s 記錄一次吸光值，吸光值得變化應呈線性，每分鐘的變化范圍應在 復操作測定樣品溶液 . 1 個溶菌酶活力單位定義為 25℃， 件下，使用溶壁微球菌懸濁液在 450每分鐘引起吸光度變化為 溶菌酶的量。 分析 1 分鐘后穩(wěn)定，計算時忽略最初 1 分鐘的讀數(shù)。用曲線的線性部分（通常在后 2 分鐘）確定每分鐘吸光度變化的平均值。 精確稱取相當于 50力效能的樣品（以干基計）用 酸緩沖液配制成一定濃度的樣品溶液；用真空干燥器烘干 標樣 2 小時，精確稱取相當于 50力效能的標準參考酶，用 酸緩沖液配制成一定濃度的標準溶液。準確吸取3物溶液至試管 35℃ 預熱3物溶液，樣品溶液，標準溶液 35℃ 預熱 3確吸取 3熱過的溶液至試管中 35℃ 反應10640定吸光度，計算酶活力 A ????00樣品質(zhì)量酶標準品質(zhì)量活力底物懸浮液的制備 稱取溶酶小球菌 30?40磷酸鹽緩沖液 (1研缽內(nèi)研磨 3 分鐘，再加磷酸鹽緩沖液 (量，使總體積約為 100懸浮液于 25±時，在 450波長處測得的吸收度為 用前配制 )。 測定法 精密量取 25±的底物懸浮液 3 1色池中，在 450波長處測定吸收度，作為零秒的讀數(shù) A，然后精密量取 25±供試品溶液 當于溶菌酶 加到上述比色池中，迅速混勻，用秒表計時 ,至 60 秒時再測定吸收度 A；同時精密量取磷酸鹽緩沖液(法操作，做為空白試驗，測得零秒 的讀數(shù) A'及 60 秒的讀數(shù) A'。 活力單位定義 在室溫 25℃ 、 ，在波長 450，每分鐘引起吸收度下降 一個酶活力單位 灰分 ， % — 灼燒殘渣 溶液 — 溶液 1%水溶液 抑菌作用 抑菌環(huán)試驗 — — —