雞沙門氏菌的膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

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ICS?65.020.30 B 41 ????? DB37 山東省地方標(biāo)準(zhǔn) DB37/T XXXXX—XXXX ????? 雞沙門氏菌的膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)規(guī)程 Technical code of colloidal gold test strip for Avian Salmonella detection XXXX - XX - XX發(fā)布 XXXX - XX - XX實(shí)施 山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局???發(fā)布 DB37/T XXXXX—XXXX 前??言 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。 本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。 本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：泰安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：唐德宏、孫淑紅、王方昆、唐輝、孫建華、王莉莉、鞠孜敬、張富友、伊惠、樊麗。 引??言 沙門氏菌在自然界分布廣泛，能侵害人和動(dòng)物，是一種常見的人畜共患病原，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)中占有重要地位。傳統(tǒng)沙門氏菌的檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，操作步驟繁瑣，技術(shù)難度大，家禽養(yǎng)殖業(yè)和相關(guān)檢測(cè)機(jī)構(gòu)難以對(duì)雞沙門氏菌病做到準(zhǔn)確實(shí)時(shí)監(jiān)控。 本項(xiàng)目擬根據(jù)對(duì)國(guó)內(nèi)多種血清型、多種來源沙門氏菌檢測(cè)的基礎(chǔ)上，建立本檢測(cè)技術(shù)規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)將規(guī)定用兩步增菌法對(duì)疑似沙門氏菌感染樣品進(jìn)行增菌后，再使用膠體金試紙條進(jìn)行快速檢測(cè)的技術(shù)（30 h內(nèi)完成）。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于雞群中攜帶沙門氏菌的檢疫、流行病學(xué)調(diào)查、也可用于規(guī)?；N禽場(chǎng)沙門氏菌病的凈化。 5 雞沙門氏菌的膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)規(guī)程 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了雞沙門氏菌快速檢測(cè)技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定用兩步增菌法對(duì)疑似沙門氏菌感染樣品進(jìn)行增菌后，再使用膠體金試紙條進(jìn)行快速檢測(cè)的技術(shù)。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于沙門氏菌的檢疫、診斷、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，也可用于規(guī)模化種禽場(chǎng)中沙門氏菌的凈化。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682　分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 GB/T 27401　實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范　動(dòng)物檢疫 GB/T 19495.2　轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)　實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求 NY/T 541—2016　獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范 GB 4789.4—2016　食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品微生物學(xué)檢驗(yàn)　沙門氏菌檢驗(yàn) 3　 試劑或材料 3.1　 除另有規(guī)定外，所用化學(xué)試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用水均符合GB/T 6682二級(jí)水的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)中人員配置、實(shí)驗(yàn)室管理、儀器設(shè)備使用、樣品實(shí)驗(yàn)試劑和廢棄物處理等均符合GB/T 27401的規(guī)定。 3.2　 BPW增菌液（參見附錄A.1）。 3.3　 SC增菌液（參見附錄A.2）。 3.4　 TTB增菌液（參見附錄A.3）。 3.5　 雞白痢沙門氏菌（CVCC535）和腸炎沙門氏菌（CVCC3377）作為陽性對(duì)照。 3.6　 滅菌水為陰性對(duì)照。 3.7　 沙門氏菌膠體金試紙條。 3.8　 營(yíng)養(yǎng)肉湯均質(zhì)袋。 4　 儀器設(shè)備 4.1　 冰箱（0 ℃～8 ℃）。 4.2　 生化培養(yǎng)箱（溫度范圍：5 ℃～50 ℃，溫度均勻度：≤1 ℃）。 4.3　 二級(jí)生物安全柜。 4.4　 控溫?fù)u床（溫度范圍：5 ℃～50 ℃）。 4.5　 高壓滅菌鍋（工作壓力：≤0.35 MPa，工作溫度：≤142 ℃）。 4.6　 組織研磨儀（干磨、濕磨及冷凍研磨均可）。 4.7　 電子天平（感量0.001）。 4.8　 微量移液器（量程50 μL～200 μL、300 μL～1 000 μL）。 5　 沙門氏菌快速檢測(cè)方法 整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照GB/T 27401、GB/T 19495.2和GB 4789.4—2016要求執(zhí)行。 5.1　 樣品采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存 取約0.5 g樣品（新鮮糞便或肝臟等組織）或500 μL卵黃囊液到均質(zhì)袋中，置于2 ℃～8 ℃保存，迅速送實(shí)驗(yàn)室待檢，運(yùn)輸或儲(chǔ)存需低溫冷藏。參見NY/T 541—2016。 5.2　 樣品處理 往均質(zhì)袋中加入4.5 mL BPW增菌培養(yǎng)基，放入均質(zhì)器中均質(zhì)2 min。整個(gè)過程無菌操作。肝臟等實(shí)質(zhì)性組織樣本需經(jīng)組織研磨儀處理備用。 5.3　 培養(yǎng)過程 5.3.1　 BPW增菌培養(yǎng)置于37 ℃搖床中，220 rpm 培養(yǎng)8 h～12 h。 5.3.2　 取培養(yǎng)后的增菌液500 μL分別加入到4.5 mL SC和TTB增菌液中，置于37 ℃搖床中，220 rpm 培養(yǎng)18 h～24 h。 6　 膠體金試紙條檢測(cè) 將5.3.2的培養(yǎng)物混合均勻，取1 mL到離心管內(nèi)，蓋嚴(yán)蓋子，置于沸水（100 ℃）中加熱10 min，后冷卻至室溫，搖勻，滴加3～4滴（約100 μL）至膠體金試紙條的樣本孔，反應(yīng)5 min～15 min，判讀結(jié)果，超過30 min顯色無效。雞白痢沙門氏菌（CVCC535）和腸炎沙門氏菌（CVCC3377）作為陽性對(duì)照。參見附錄B。 7　 判斷標(biāo)準(zhǔn) 7.1　 試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn) 30 min內(nèi)，C線和T線同時(shí)顯色或者只有C線顯色，則反應(yīng)成立。若C線不顯色，則測(cè)試失敗或檢測(cè)卡失效，為無效反應(yīng)。 7.2　 結(jié)果判定 陽性反應(yīng)：若C、T線均顯色，可判定待檢樣本為沙門氏菌陽性。 陰性反應(yīng)：若C線顯色，T線不顯色，可判定待檢樣本為沙門氏菌陰性。 A A 附　錄　A （資料性附錄） 培養(yǎng)基配制 A.1　 BPW增菌液 A.1.1　 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸氫二鈉(含12個(gè)結(jié)晶水) 9.0 g 磷酸二氫鉀 1.5 g 水 1 000 mL A.1.2　 制備 將各成分加熱溶解于1 000 mL水中，121 ℃高壓滅菌 15 min備用。 A.2　 SC增菌液 A.2.1　 成分 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 亞硒酸氫鈉 4.0 g 磷酸氫二鈉 10.0 g L-胱氨酸 0.01 g 水 1 000 mL A.2.2　 制備 將各成分加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，無菌操作分裝于滅菌三角瓶或試管中備用。當(dāng)天制備當(dāng)天使用，無需高壓滅菌。 A.3　 TTB增菌液 A.3.1　 成分 蛋白胨 9.0 g 牛肉粉 4.5 g 氯化鈉 2.7 g 碳酸鈣 40.5 g 膽鹽 5.0 g 硫代硫酸鈉 50.0 g 水 1 050 mL A.3.2　 制備 將各成分溶解于1 050 mL蒸餾水中，加熱煮沸，臨用前加入20 %碘液20 mL，0.1 % 煌綠10 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置。 B B 附　錄　B （資料性附錄） 膠體金檢測(cè)結(jié)果模式圖 膠體金檢測(cè)結(jié)果模式圖見圖B.1。 說明： 1——為沙門氏菌陰性； 2——為沙門氏菌陽性； 3——和4為無效反應(yīng)。 圖B.1　 沙門氏菌膠體金檢測(cè)圖片 _________________________________