植物源花青素穩(wěn)定性和抗氧化活性研究分析生物技術(shù)專業(yè)

《植物源花青素穩(wěn)定性和抗氧化活性研究分析生物技術(shù)專業(yè)》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《植物源花青素穩(wěn)定性和抗氧化活性研究分析生物技術(shù)專業(yè)（33頁珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、 題 目 植物源花青素的穩(wěn)定性和抗氧化活性研究 摘要 所謂花青素，指的是在植物組織里存在的水溶性色彩。從界定范疇來說，花青素應(yīng)該被納入類黃酮化合物領(lǐng)域。其本身無毒、使用安全，有突出的保健功效，尤其是抗氧化表現(xiàn)，近年來受到專家學(xué)者等的廣泛關(guān)注?；ㄇ嗨鼐邆涞母呖寡趸钚?，不僅可以有效的滿足人類延緩衰老需求，同時(shí)在自由基清除以及抗腫瘤等方面也有突出的作用發(fā)揮。所以無論是從醫(yī)療、化妝品研發(fā)以及食品加工等產(chǎn)業(yè)發(fā)展來說，花青素的應(yīng)用前景十分看好。而且在研究的過程中，為更好的實(shí)現(xiàn)花青素的有效開發(fā)，本研究以藍(lán)莓提取物為植物源原料，對(duì)花青素的含量、穩(wěn)定性進(jìn)行了研究

2、。以自由基清除率的大小作為體外抗氧化能力強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)指標(biāo)，驗(yàn)證比較了藍(lán)莓花青素的抗氧化能力。本研究主要成果如下： （1）通過紫外可見光分光光度法確定藍(lán)莓提取物樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，運(yùn)用pH試差法測(cè)定本實(shí)驗(yàn)樣品中的花青素含量為2.188mg/g。 （2）藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性受室外日光影響較大10天后溶液顏色已消退至無色，花青素保存率只有12.65%。避光和室內(nèi)自然光條件下溶液的吸光度值下降程度較小，顏色消退速率較慢，10天后花青素保存率仍超過60%。藍(lán)莓花青素在低于60℃的環(huán)境中穩(wěn)定性較好，60℃下水浴放置2h其花青素保留率可達(dá)93.8％，但高溫環(huán)境下花青素保存率迅速下降，100℃時(shí)其保存

3、率只有29.5％?；ㄇ嗨厮釅A穩(wěn)定性受pH影響較大，溶液pH從1到10變化時(shí)，溶液顏色變化過程為：紅色—紫紅色—淺紫色—淺綠色—綠色—藍(lán)綠色。苯甲酸鈉對(duì)藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性影響較小，抗壞血酸、亞硫酸氫鈉能增強(qiáng)藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性，且提高的效果與濃度有關(guān)。檸檬酸對(duì)藍(lán)莓花青素具有穩(wěn)定的增色作用。金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)花青素的穩(wěn)定性的影響相對(duì)較小，金屬離子Fe3+和Cu2+使得花青素溶液的顏色發(fā)生明顯改變，對(duì)花青素的穩(wěn)定性有顯著的影響。 （3）在試驗(yàn)操作上，使用的是三類氧化模型，分別是羥基以及DPPH自由基兩個(gè)模型，以及DPPH自由基模型等。在研究過程中，使用抗壞血酸、α-生育酚、丁基

4、羥基茴香醚（BHA）作為對(duì)照，通過比較它們對(duì)自由基的清除率表現(xiàn)，進(jìn)而證實(shí)了在藍(lán)莓中提取的花青素有突出的抗氧化表現(xiàn)。基于模型分析，在采用超氧陰離子以及羥基自由基模型進(jìn)行分析上，可知無論是花青素還是抗壞血酸，都有較為出色的自由基清除效果。在使用DPPH自由基模型分析時(shí)，通過研究，可知藍(lán)莓花青素、抗壞血酸、α-生育酚、BHA對(duì)DPPH自由基IC50值分別為12.693ug/ml、15.478ug/ml、28.461ug/ml、79.469ug/ml，即對(duì)羥基自由基的清除能力的大小順序?yàn)椋核{(lán)莓花青素﹥抗壞血酸﹥BHA﹥?chǔ)烈簧印? 關(guān)鍵詞：植物源 花青素 穩(wěn)定性 抗氧化活性 Abstrac

5、t Anthocyanin is a kind of water-soluble pigment which is widely present in plant tissue, and belongs to the flavonoid compound. Because of its safety, non-toxic and anti-oxidation and other health-care effects, it has been widely concerned by experts and scholars in recent years. Anthocyanin ha

6、s high antioxidant activity, and has an important role in delaying aging, scavenging free radicals, and resisting tumor, and has great application prospect in the fields of medicine, cosmetics, food processing and the like. In order to develop plant source anthocyanin, the content and stability of a

7、nthocyanin were studied by using blueberry extract as the raw material of plant. The anti-oxidation ability of blueberry anthocyanin was compared with the value of free radical clearance as the evaluation index of the anti-oxidation ability in vitro. The main results of this study are as follows:

8、 (1) the detection wavelength of the blueberry extract sample is determined to be 520 nm by the ultraviolet visible light spectrophotometry, and the content of the anthocyanin in the test sample is 2.188 mg/ g by using the pH test method. (2) The stability of the blueberry anthocyanin is affected

9、by the outdoor sunlight for 10 days, the color of the solution is resolved to be colorless, and the retention rate of the anthocyanin is only 12.65%. Under the condition of light and indoor natural light, the decrease of the absorbance of the solution is small, the color fading rate is slow, and the

10、 preservation rate of the anthocyanin is still more than 60% after 10 days. The stability of anthocyanin in the environment was lower than 60 ℃. The retention rate of anthocyanin was 93.8% in water bath at 60 ℃, but the preservation rate of anthocyanin in high-temperature environment was decreased r

11、apidly, and the preservation rate was only 29.5% at 100 ℃. The stability of the acid-base of the anthocyanin is affected by the pH, and when the pH of the solution changes from 1 to 10, the color change process of the solution is as follows: red, purplish-red, light-purple, light-green, green and bl

12、ue-green. The effect of sodium benzoate on the stability of the blueberry anthocyanin is small, and the ascorbic acid and the sodium bisulfite can enhance the stability of the blueberry anthocyanin, and the effect is related to the concentration. The citric acid has a stable color-increasing effect

13、on the blueberry anthocyanin. The effect of metal ion Na +, K +, Ca 2 + and Mg 2 + on the stability of anthocyanin was relatively small, and the metal ions Fe3 + and Cu2 + make the color of anthocyanin solution obviously change, and has a significant effect on the stability of anthocyanin. (3) Thr

14、ee anti-oxidation models of the superoxide anion system, the hydroxyl radical system and the DPPH free radical system were used in this test. The antioxidant capacity of the blueberry anthocyanin is further defined by comparing their clearance to the free radicals. In the superoxide anion and hydrox

15、yl radical system, the scavenging ability of the anthocyanin and the ascorbic acid to the free radicals is obviously higher than that of the 1-tocopherol and the BHA. In the DPPH radical system, the IC50 values of blueberry anthocyanin, ascorbic acid, l-tocopherol and BHA on the DPPH radical were 12

16、.693 ug/ ml, 15.478 ug/ ml, 28.461 ug/ ml and 79.469 ug/ ml respectively. Key words: plant source; anthocyanidin; stability; antioxidant activity 目錄 摘要 I ABSTRACT II 1 緒論 1 1.1 花青素概述 1 1.2 花青素的定性定量方法 2 1.3 花青素穩(wěn)定性研究 3 1.3.1 PH影響 3 1.3.2 熱穩(wěn)定性 3 1.3.3 光穩(wěn)定性 4 1.4 花青素抗氧化活性研究 4 1.4.1 DP

17、PH自由基清除率的測(cè)定 4 1.4.2 超氧陰離子清除能力測(cè)定 4 1.4.3 羥自由基清除能力測(cè)定 5 1.5 本研究的目的意義及研究?jī)?nèi)容 5 1.5.1 研究目的及意義 5 1.5.2 本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容 5 2 植物源花青素穩(wěn)定性研究 7 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 7 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑 7 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 7 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 8 2.2.1 花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定 8 2.2.2 pH試差法測(cè)定花色苷含量 8 2.2.3 光照對(duì)植物源花青素的影響 8 2.2.4 溫度對(duì)植物源花青素的影響 9 2.2.5 pH對(duì)植物源花青素的影響 9 2.2

18、.6 添加劑對(duì)植物源花青素的影響 9 2.2.7 金屬離子對(duì)植物源花青素的影響 9 2.3 統(tǒng)計(jì)分析 9 2.4 結(jié)果與分析 10 2.4.1 花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定 10 2.4.2 pH試差法測(cè)定花色苷含量 10 2.4.3 光照對(duì)植物源花青素的影響 10 2.4.4 溫度對(duì)植物源花青素的影響 12 2.4.5 pH對(duì)植物源花青素的影響 13 2.4.6 不同食品添加劑對(duì)植物源花青素的影響 13 2.4.7 金屬離子對(duì)植物源花青素的影響 15 2.5 小結(jié) 15 3 植物源花青素抗氧化活性研究 17 3.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 17 3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

19、17 3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 17 3.2 試驗(yàn)方法 17 3.2.1 清除超氧陰離子自由基分析方法 17 3.2.2 清除羥基自由基分析方法 18 3.2.3 清除DPPH·自由基分析方法 19 3.3 統(tǒng)計(jì)分析 19 3.4 結(jié)果與分析 19 3.4.1 對(duì)超氧陰離子（O2ˉ?）的清除作用 19 3.4.2 羥自由基(·OH)清除作用 20 3.4.3 DPPH自由基清除作用 22 3.5 小結(jié) 23 4 結(jié)論與展望 24 4.1 結(jié)論 24 4.2 展望 25 參考文獻(xiàn) 26 致謝 29 1 緒論 1.1 花青素概述 在植物中，花青素是

20、一種非常關(guān)鍵的色彩，也正是因?yàn)榛ㄇ嗨卮嬖?，?dǎo)致植物的花朵或果實(shí)會(huì)有紅色、藍(lán)色、黃色和紫色等，但自然條件下游離的花青素極少見，往往通過糖基化等過程形成花色苷。 　 圖 1.1花青素架構(gòu)布局示意圖 花青素從屬性角度來說，應(yīng)該是一種類黃酮類，在下圖1.1里對(duì)其基本結(jié)構(gòu)做出了表述，為2– 苯基苯并吡喃環(huán)。對(duì)于花青素而言，多數(shù)通常在、、位存在羥基，同時(shí)對(duì)于位來說，會(huì)基于糖苷鍵模式實(shí)現(xiàn)與其它糖的結(jié)合?？紤]到不同碳對(duì)應(yīng)的取代基存在不同差異，所以花青素的類別也較多。結(jié)合研究結(jié)果，目前在自然界中，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的花青素類別就至少有500種以上。具體的類別和名稱在表1-1里做出了對(duì)應(yīng)表述[1]，主要的花青素類別

21、有天竺葵素、飛燕草素以及牽頭色素、矢車菊素、芍藥素等。 表 1.1自然界常見花青素名稱及取代基類別展示 花青素的一個(gè)顯著特點(diǎn)是其穩(wěn)定性易受到影響。由于花青素中通常會(huì)有不同的化學(xué)物質(zhì)存在，諸如甲基化、羥基數(shù)、以及糖類別及其連接位置差異等，導(dǎo)致花青素對(duì)植物的作用也會(huì)存在不同表現(xiàn)，致使植物會(huì)呈現(xiàn)出不同的色彩。 由于位羥基化的作用影響，致使花色苷在具體的色彩表現(xiàn)上有不同的顏色出現(xiàn)。此外、位羥基化的作用在于確保花色苷存在的穩(wěn)定性。此外對(duì)于位羥基化而言，在其影響下，會(huì)導(dǎo)致花色苷呈現(xiàn)出變黃的效果[2]。位以及位若出現(xiàn)花色苷甲基化，那么其會(huì)導(dǎo)致花色苷無法水解，因此其對(duì)花色

22、苷的穩(wěn)定也有突出意義[2]。對(duì)于花色素而言，會(huì)有不同糖基取代反應(yīng)發(fā)聲，通常發(fā)生位置是位[3]。此外在花青素里存在的單糖苷，多數(shù)情況下應(yīng)該為位連接糖基，此外二糖苷的連接主要是或是在、位分別進(jìn)行1個(gè)連接。而三糖苷的連接為位以及位，分別連接的是2個(gè)糖基、1個(gè)糖基，也可能是在位進(jìn)行3個(gè)糖基的連接[4]。糖基化對(duì)花青素的快速降解有一定的抑制作用?；ㄇ嗨仵；膶?shí)現(xiàn)基礎(chǔ)為糖基化?；诖?，其能夠促使花青素有更高穩(wěn)定表現(xiàn)，一般來說帶芳香?；葞е；幕ㄉ沼懈怀龅姆€(wěn)定表現(xiàn)，多酰比單?；ㄉ辗€(wěn)定性突出，基于芳香?；淖饔糜绊懀瑫?huì)致使花色苷呈現(xiàn)出藍(lán)色。但是對(duì)于脂酰化而言，基本上不會(huì)導(dǎo)致花色苷的顏色發(fā)生改變[4

23、]。 花青素的另一個(gè)突出優(yōu)勢(shì)是有出色的抗氧化獲刑表現(xiàn)，主要是因?yàn)樵谄涠喾永锎嬖谟休^多的酚類羥基，而且酚羥基數(shù)量越多，則會(huì)導(dǎo)致分子量隨之增加，其抗氧化表現(xiàn)也就更突出。對(duì)花青素分子來說，其含有的酚羥基能夠?qū)崿F(xiàn)活性氧的去除操作，進(jìn)而能夠?qū)崿F(xiàn)態(tài)氧分子到基態(tài)氧原子的還原操作，致使氧自由基產(chǎn)生的概率下降[5]。 1.2 花青素的定性定量方法 在當(dāng)前學(xué)術(shù)界對(duì)花青素進(jìn)行定性分析實(shí)現(xiàn)上，有較多的分析對(duì)策，諸如紫外、紅外吸收光譜，紙、薄層層析以及核磁共振、現(xiàn)代技術(shù)質(zhì)譜以及高效液相色譜等。在既有的定性研究方式運(yùn)用上，其中對(duì)于紙層析與薄層層析方式來說，其是最早進(jìn)行花青素定性研究的對(duì)策，是立足色彩完成花青素組成

24、分析的方式。而且結(jié)合色帶的大小差異，也可以對(duì)花青素中不同成分的占比做出相應(yīng)的判定。紫外可見吸收光譜法常用于花青素結(jié)構(gòu)的初步鑒定。紅外吸收光譜法可以確定分子官能團(tuán)的特征。質(zhì)譜的作用在于對(duì)分析的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)，以及分子量進(jìn)行解讀?；诤舜殴舱穹绞竭M(jìn)行分析，則可以實(shí)現(xiàn)化合物結(jié)構(gòu)的清晰分析，其通?？梢越柚詈弦约拔灰瞥?shù)來完成分析研究。 在定量研究方式的運(yùn)用上，結(jié)合學(xué)術(shù)界的研究現(xiàn)狀來說，多數(shù)學(xué)者認(rèn)同可以借助花青素光學(xué)定律以及比爾定律來實(shí)現(xiàn)花青素的定量研究，主要的對(duì)策包括單一PH值或是PH示差等方式。在進(jìn)行花青素里花色苷單體含量的測(cè)量分析上，一般采用高效液相色譜法完成。在對(duì)新鮮植物進(jìn)行花青素提取量分析上，主

25、要是運(yùn)用單一PH值。這是因?yàn)樵谛迈r植物的花青素提取操作上，雜質(zhì)本身不會(huì)影響到吸光度值。所以基于相應(yīng)波長(zhǎng)吸光度值的認(rèn)定，就可以在界定的范疇里完成花青素含量分析。若有干擾物質(zhì)的存在，PH示差是一種有效的花青素含量分析方式。在實(shí)現(xiàn)上，只需在花青素最大吸收波長(zhǎng)處獲取兩個(gè)值，同時(shí)強(qiáng)調(diào)其可以實(shí)現(xiàn)最大吸光度值差異，則可以完成花青素含量的計(jì)算分析。 1.3 花青素穩(wěn)定性研究 花青素在食品工業(yè)方面受到多重限制，這主要是因?yàn)樗资芄庹?、溫度、pH因素影響而褪色或發(fā)生降解[10]，基于化學(xué)結(jié)構(gòu)布局而言，花青素由于電子特性缺失，因此容易被自由電子或是活性氧基團(tuán)攻擊進(jìn)而降解[9]。 1.3.1 PH影響 由于

26、PH 值改變，也會(huì)對(duì)花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響，導(dǎo)致其化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化[11]。若是在水溶液里，花青素存在的方式主要是有四類，分別是醌型堿、黃鹽陽離子、黃鹽陽離子以及假堿等。由于水溶液PH 值的改變，以上形式也會(huì)有有可逆改變出現(xiàn)，因此這也會(huì)導(dǎo)致由于花青素結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致水溶液的色彩也會(huì)有相應(yīng)的變化[12]。 圖 1.2pH對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響 1.3.2 熱穩(wěn)定性 一般情況下，花青素和其他天然色素可以在低溫下保存很長(zhǎng)時(shí)間，隨著溫度的升高，其分子的內(nèi)部運(yùn)動(dòng)加快，由于高溫因素的作用影響，導(dǎo)致花色苷位對(duì)應(yīng)的糖苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，

27、進(jìn)而有熱降解情況出現(xiàn)[13]，由于溫度的上升的，導(dǎo)致花色苷去糖基化、進(jìn)而發(fā)生裂解，獲取到酚酸、酚醛等[14]。而且在高溫作用下，水溶液里花色苷的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化，變?yōu)椴槎賶A結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)十分不穩(wěn)定。因此當(dāng)溫度較高時(shí)，花青素會(huì)失去原有的色澤[15]。 1.3.3 光穩(wěn)定性 光照對(duì)花青素穩(wěn)定性有一定的影響。謝程程等研究發(fā)現(xiàn)，在位，由于誘導(dǎo)作用影響，導(dǎo)致花青素碳骨架發(fā)生斷裂，進(jìn)而催生羥基降解的中間產(chǎn)物，在相關(guān)作用影響下，這些產(chǎn)物經(jīng)過氧化，變成查耳酮。在進(jìn)一步氧化作用影響下，此時(shí)查耳酮可以生成苯甲酸或是－三羥基苯甲醛等產(chǎn)物。也正是因?yàn)檫@些作用的存在，花青素會(huì)發(fā)生褪色現(xiàn)象[18]。所以這也就意

28、味著在進(jìn)行花青素存儲(chǔ)的過程中，盡可能是避光存儲(chǔ)。于文娟等在研究中發(fā)現(xiàn)，花青素穩(wěn)定性會(huì)受到室內(nèi)散射光因素的影響，而且這種因素對(duì)其影響較大。其在研究中引入木棗果皮花青素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，證實(shí)了在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的散光照射后，果皮吸光度表現(xiàn)直線下降[19]。 1.4 花青素抗氧化活性研究 人們會(huì)將花青素看作是一種非常出色的抗氧化劑?；诨ㄇ嗨氐氖褂?，可以實(shí)現(xiàn)人體內(nèi)多余自由基的清除，促使人體更好完成新陳代謝，同時(shí)也可以有效預(yù)防相應(yīng)疾病。經(jīng)過大量的研究結(jié)果可知，花青素有較為出色的自由基清除表現(xiàn)，這一點(diǎn)甚至比維生素、更為出色[26]，在抗氧化能力表現(xiàn)上，花青素分別是維生素、的20倍、50倍[27]。在進(jìn)行體外的

29、抗氧化活性檢測(cè)操作上，核心就是分析在進(jìn)行DPPH以及羥自由基、超氧陰離子等方面的清除表現(xiàn)。 1.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 1，1．二苯基．2-苦肼基為基于氮為核心的穩(wěn)定自由基，其能夠在乙醇里進(jìn)行溶解，溶解后獲取到紫色的溶液，可以實(shí)現(xiàn)517nm最大吸收波長(zhǎng)。將自由基清除劑倒進(jìn)DPPH溶液，此時(shí)在作用影響下，會(huì)出現(xiàn)孤對(duì)電子配對(duì)的情況，因此也會(huì)削弱其吸收能力，最終導(dǎo)致溶液的色彩逐步變淺，或是色彩變黃。對(duì)于吸光度值的變化來說，一般其會(huì)和自由基清除的情況有較為緊密的線性關(guān)系。童丹等對(duì)馬鈴薯花青素的研究證實(shí)，花青素的抗氧化效果突出，而且有越高的花青素含量，在進(jìn)行DPPH自由基清除方面的效果

30、也就越突出[28]。張文彥等在對(duì)云南墨江紫米花青素進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)墨江紫米中花青素的濃度隨花青素濃度的增加而逐漸增加[29]。DPPH方法快速，簡(jiǎn)便，靈敏，易于檢測(cè)，直接可行，該方法能直接作用于DPPH自由基且不受葡萄糖等外界因素的干擾，廣泛應(yīng)用于抗氧化劑的研究。 1.4.2 超氧陰離子清除能力測(cè)定 若是處于堿性因素影響，那么此時(shí)基于鄰苯三酚的氧化作用，會(huì)實(shí)現(xiàn)超氧化物陰離子的釋放，進(jìn)而生成有色中間體，其有更為突出的吸光度表現(xiàn)。在其中進(jìn)行氧化劑的加入，此時(shí)基于催化作用，會(huì)有過氧化氫生成，其不利于中間體生成，所以也會(huì)影響到吸光度值，導(dǎo)致其下降，從而也降低了鄰苯三酚自氧化速率?；趯?duì)待測(cè)物的吸光度

31、值測(cè)定判斷待測(cè)物對(duì)超氧陰離子的清除水平。玄紅專運(yùn)用鄰苯三酚自氧化法驗(yàn)證了蜂膠、蜂花粉、蜂王漿、蜂蜜對(duì)超氧陰離子基均有較好的清除效果[34]。程德竹等設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了生姜提取物對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生的超氧化物自由基的清除作用且清除率與提取液濃度呈線性關(guān)系[35]。 1.4.3 羥自由基清除能力測(cè)定 和鄰菲羅啉作用，則能夠獲取到紅色配合物。此時(shí)進(jìn)的加入，則會(huì)有Fenton反應(yīng)出現(xiàn)，即。生成的羥自由基可以對(duì)-鄰菲羅啉進(jìn)行氧化，進(jìn)而獲取到-鄰菲羅啉。在這種情況下，其吸光度也會(huì)對(duì)應(yīng)下降，甚至不再有吸光度表現(xiàn)?；诳寡趸镔|(zhì)在加入，由于在抗氧化物質(zhì)中會(huì)有活性組份存在，其通常會(huì)優(yōu)先與羥自由基進(jìn)行反應(yīng)，

32、因此這也就會(huì)削弱自由基的氧化作用。Fenton 反應(yīng)具有反應(yīng)速度快、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單方便、效率高、自動(dòng)絮凝等優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。丁利君等通過Fe2+催化H202氧化體系，發(fā)現(xiàn)在50-400ug/ml的范圍內(nèi)黃芪提取物清除率與濃度劑量呈正相關(guān)[36]。黃鎖義等參照Fenton反應(yīng)的方法建立了一個(gè)反應(yīng)體系模型，測(cè)定了茉莉花莖總黃酮對(duì)羥基自由基的強(qiáng)清除作用[37]。 1.5 本研究的目的意義及研究?jī)?nèi)容 1.5.1 研究目的及意義 隨著消費(fèi)者保健安全意識(shí)的提升，開發(fā)和研究食用天然色素已成為當(dāng)今的探討熱點(diǎn)?；ㄇ嗨刈鳛樘烊簧氐囊环N，植物源頭豐富，具有的較高的抗氧化活性及健康促進(jìn)作用，

33、專家學(xué)者們對(duì)花青素的開發(fā)應(yīng)用都給予了廣泛關(guān)注。在研究中發(fā)現(xiàn)目前花青素的穩(wěn)定性是制約它應(yīng)用生產(chǎn)的主要原因，花青素在加工或保存環(huán)境的pH、溫度、光照、氧濃度等外界條件的作用下，易解離，褐變或褪色，溶液原有的顏色和透明度也可能發(fā)生改變，同時(shí)花青素的穩(wěn)定性也影響著它的抗氧化性和生物可利用度。結(jié)合學(xué)術(shù)界的研究來說，在進(jìn)行花青素研究上，學(xué)者更關(guān)注的是其提取，以及如何采用技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)純化，關(guān)于花青素的穩(wěn)定性探討，既有的研究主要是從光照、溫度、pH等因素觸發(fā)分析，抗氧化性的研究多關(guān)注紫薯、葡萄等植物源。本研究旨在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探討多種食品添加劑、金屬離子等外在因素對(duì)植物源花青素的影響，并運(yùn)用多種抗氧化活性指標(biāo)驗(yàn)證評(píng)

34、價(jià)花青素的抗氧化能力，為花青素在食品、醫(yī)療、美容等行業(yè)的應(yīng)用和發(fā)展提供理論依據(jù)。 1.5.2 本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容 （1）花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定。本實(shí)驗(yàn)選用植物源性較強(qiáng)的藍(lán)莓提取物作為研究材料，采用紫外分光光度法確定其最大吸收波長(zhǎng)。 （2）花青素的定量分析。利用pH試差法，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定在花青素的最大吸收波長(zhǎng)處的兩個(gè)吸光度值，據(jù)公式計(jì)算出花青素的總量。 （3）花青素的穩(wěn)定性研究。研究溫度，pH值，光照，Na+、K+、Ga2+、Fe3+、Mg2+、Cu2+六種金屬離子以及維生素C、檸檬酸、苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉等添加劑可能給藍(lán)莓花青素帶來的影響作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)確?；ㄇ嗨胤€(wěn)定條件的研究分析。 （

35、4）花青素抗氧化活性的研究。通過比較植物源花青素、抗壞血酸、α-生育酚、丁基羥基茴香醚在不同自由基清除方面的效果，就植物花青素的抗氧化表現(xiàn)展開論述。 2 植物源花青素穩(wěn)定性研究 由于花青素缺少一個(gè)電子而具有一定的還原能力，易受到若干因素產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或自由電予攻擊而失去還原能力，如pH、溫度、化學(xué)結(jié)構(gòu)、光、氧化還原劑、金屬離子等。本實(shí)驗(yàn)通過紫外可見光分光光度法確定藍(lán)莓花青素的最大吸收波長(zhǎng), 用pH試差法測(cè)定藍(lán)莓樣品的花色苷含量。分別設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究了光照，溫度，pH值，維生素C、檸檬酸、亞硫酸氫鈉、苯甲酸鈉等添加劑及離子在藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性表現(xiàn)方面的作用。 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 2

36、.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑 表 2.1主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 表 2.2主要實(shí)驗(yàn)儀器 名稱 型號(hào) 生產(chǎn)廠家 超純水儀 電子天平 ATY124 菲律賓制造 pH計(jì) 紫外可見光分光光度計(jì) T6新世紀(jì) 北京普析通用儀器有限公司 HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-2 金壇市科析儀器有限公司 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定 稱取1.00克藍(lán)莓提取物，充分溶解，而后將其放置到100ml容量瓶里，定容。隨后從中進(jìn)行適度溶液提取，基于紫外可

37、見光分光光度計(jì)來進(jìn)行該提取溶液在450－600 nm區(qū)間吸收光譜分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)最大吸收波長(zhǎng)的界定。 2.2.2 PH試差法測(cè)定花色苷含量 ①緩沖溶液的配置 pH=1.0緩沖液：將0.2mol·和0.2mol·進(jìn)行混合，二者的比例是25∶67。 緩沖液：實(shí)現(xiàn)1·、1·以及進(jìn)行混合，比例是。 ②pH示差法測(cè)定藍(lán)莓花色苷的含量 用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液將2ml藍(lán)莓提取物溶液稀釋至10 ml具塞試管中，振蕩搖勻，避光平衡90分鐘。利用花色苷的結(jié)構(gòu)特性：在pH1.0的環(huán)境中在520nm波長(zhǎng)下有特征吸收，但是在pH4.5的情況下，此時(shí)花色苷存在結(jié)構(gòu)變黃的情況，變化后變成了五色

38、的物質(zhì)，且520nm無吸收峰，溶液里的其他共存的有機(jī)酸類、黃酮類、多酚類等干擾物質(zhì)不會(huì)隨pH的改變而發(fā)生變化。因此通過測(cè)得兩個(gè)pH下的吸光值差，即可確定花色苷的含量。藍(lán)莓花色苷含量計(jì)算公式為： C（mg·g-1）=（A0-A1）×V×n×M/（ε×m）（濕重） （2.1） 其中，A0、A1分別代表的是在PH分別是1.0、4.5情況下，花色苷吸光度值情況。提取液的體積是V，稀釋的倍數(shù)為n，同時(shí)M、ε分別代表的是Cy-3-Glu相對(duì)分子質(zhì)量、消光系數(shù)，取值分別是449.2、26900。樣品的質(zhì)量用m表述。 2.2.3 光照對(duì)植物源花青素的影響 稱取3份1.00克藍(lán)莓提取物

39、,溶解定容至100ml容量瓶中，分別置于室外日光、室內(nèi)自然光、室內(nèi)避光的條件下，自然放置10天，每隔兩天采樣一次，觀察其顏色變化并在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。 2.2.4 溫度對(duì)植物源花青素的影響 取10．00ml已配制好的植物源花青素溶液6份于具塞試管，密封并分別在40~100℃范圍內(nèi)設(shè)置6個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)，每升高10℃為一個(gè)梯度，將花青素溶液在水浴恒溫鍋中恒溫加熱兩小時(shí)，選擇最大吸收波長(zhǎng)完成吸光度的測(cè)定分析。而后對(duì)色素保存率R進(jìn)行計(jì)算： （2.2） 其中，Ao、A分別代表的是初始以及樣液吸光度。 2.2.5 pH對(duì)植物源花青素的影響 取1

40、0．0ml已配制的植物源花青素溶液10份于具塞試管，分別使用1mol/LHC1或NaOH溶液進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，使pH在1~l0的范圍內(nèi)進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，每相差一個(gè)pH值為一個(gè)梯度，密封靜置十二小時(shí)，取樣在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并觀察其顏色變化。 2.2.6 添加劑對(duì)植物源花青素的影響 各取10．0ml已配制好的植物源花青素溶液于具塞試管，分別將濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、檸檬酸、苯甲酸鈉溶液1ml添加進(jìn)具塞試管，密封靜置兩小時(shí)，取樣在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。 2.2.7 金屬離子對(duì)植物源花青素的影響 各取10．0ml已配制好的植物源花

41、青素溶液于具塞試管，分別將濃度為0．01mol/L的氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、三氯化鐵、氯化鎂、硫酸銅溶液1ml添加進(jìn)具塞試管，室溫下放置半小時(shí)，選擇最大吸收波長(zhǎng)完成吸光度的測(cè)定分析。 2.3 統(tǒng)計(jì)分析 基于Excel完成試驗(yàn)結(jié)果的處理和研究，在進(jìn)行數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)上，基于均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，要對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行3次的重復(fù)處理操作。 2.4 結(jié)果與分析 2.4.1 花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定 圖 2.1花青素最大吸收波長(zhǎng) 本實(shí)驗(yàn)選擇在450~600nm的可見光條件下測(cè)定藍(lán)莓花青素的最大吸收波長(zhǎng)。由圖 2.1可知藍(lán)莓花青素在450~600nm范圍內(nèi)，所測(cè)得的吸光度值先增大后減小，在500~

42、550nm范圍內(nèi)出現(xiàn)最大值，這與田喜強(qiáng)[38]劉妍[39]等人對(duì)多種植物源花青素的研究結(jié)果一致。分析可知本藍(lán)莓提取物樣品最大吸收峰處的波長(zhǎng)為520nm，因此可選擇520nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。 2.4.2 pH試差法測(cè)定花色苷含量 表 2.3花色苷含量測(cè)定結(jié)果 序號(hào) 吸光度值 花色苷含量mg/g 平均花色苷含量mg/g A0 A1 1 0.292 0.030 2.188 2.188 2 0.291 0.030 2.179 3 0.291 0.028 2.196 在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作的過程中，對(duì)藍(lán)莓花青素溶液520nm處吸光度值的測(cè)定，主要采用的是紫外可見分光光

43、度計(jì)，由表 2.3花色苷含量測(cè)定可知，通過測(cè)得的兩個(gè)pH下的吸光值差，計(jì)算得出本藍(lán)莓提取物樣品的花色苷含量為2.188mg/g，略高于胡雅馨[40]等所研究的藍(lán)莓花青素含量范圍，原因可能是研究的藍(lán)莓品種存在差異。 2.4.3 光照對(duì)植物源花青素的影響 表 2.4光照對(duì)花青素的影響 時(shí)間/天 室外日光 室內(nèi)自然光 室內(nèi)避光 A0 A 保存率% A1 A 保存率% A2 A 保存率% 0 0.245 0.241 98.37 0.241 0.238 98.43 0.242 0.240 99.17 2 0.208 84.90 0.227

44、 93.88 0.231 95.45 4 0.157 64.08 0.206 85.19 0.223 92.15 6 0.116 47.35 0.187 77.34 0.215 88.84 8 0.063 25.71 0.172 71.13 0.207 85.54 10 0.031 12.65 0.153 63.28 0.192 79.34 表 2.5花青素溶液的色彩變化情況分析 時(shí)間/天 樣液顏色 室外日光 室內(nèi)自然光 室內(nèi)避光 0 紫色 紫色 紫色 2 紅色 紫色 紫色 4 淺紅 紅色 紫紅

45、6 淺紅 紅色 紫紅 8 無色 淺紅 紅色 10 無色 淺紅 紅色 圖 2.2花青素保存率 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同的光照條件下，藍(lán)莓花青素的吸光度不同，均呈不同程度的下降，其中避光和室內(nèi)自然光的吸光避光條件下，10天后藍(lán)莓花青素的保存率可接近80％，顏色仍可保持為紅色。室內(nèi)自然光條件下，10天后藍(lán)莓花青素的保存率可超過60％，顏色可保持為淺紅色。室外日光對(duì)藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性影響較顯著，6天后藍(lán)莓花青素的保存率只有47.35％，10天后顏色已消退呈無色。結(jié)果表明室外日光對(duì)藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性影響較大，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是長(zhǎng)期高能量的光照使藍(lán)莓花青素因被氧化而

46、降解，生成C4羥基的中間產(chǎn)物并繼續(xù)在C2位上被水解，最終導(dǎo)致查耳酮的生成，查爾酮可以實(shí)現(xiàn)再次分解，進(jìn)而獲取到苯甲酸，以及—三羥基苯甲醛，進(jìn)而會(huì)影響到色彩的變化。所以要求在進(jìn)行花青素存儲(chǔ)上盡量避光。 2.4.4 溫度對(duì)植物源花青素的影響 表 2.6溫度對(duì)花青素的影響 溫度℃ A0 A 保存率% 40 0.242 0.235 97.1 50 0.238 0.230 96.6 60 0.240 0.225 93.8 70 0.240 0.160 66.7 80 0.239 0.116 48.5 100 0.241

47、 0.071 29.5 圖 2.3花青素保存率 溫度對(duì)藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性影響如圖 2.3所示。藍(lán)莓花青素在低溫下有較好的穩(wěn)定性，在40℃~60℃范圍內(nèi)保存率較高，楊艷[17]等在對(duì)黑蘿卜花青素進(jìn)行研究時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在40℃和60℃下放置的黑蘿卜花青素的保存率沒有明顯變化。本試驗(yàn)中40℃以下放置2h藍(lán)莓花青素的保存率可達(dá)97.11％，60℃下放置2h其保存率可達(dá)93.8％，80℃時(shí)其保存率為48.5％，100℃時(shí)其保存率只有29.5％。這是由于高溫可加快分子運(yùn)動(dòng)，花青素的結(jié)構(gòu)與功能被破壞的速度也加快，使得藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性變差。隨著溫度的升高，其分子的內(nèi)部運(yùn)動(dòng)

48、加快，導(dǎo)致花色苷位對(duì)應(yīng)的糖苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而有熱降解情況出現(xiàn)[13]，由于溫度的上升的，導(dǎo)致花色苷去糖基化、進(jìn)而發(fā)生裂解，獲取到酚酸、酚醛等[14]。而且在高溫作用下，水溶液里花色苷的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化，變?yōu)椴槎賶A結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)十分不穩(wěn)定。 2.4.5 pH對(duì)植物源花青素的影響 表 2.7pH對(duì)花青素的影響 PH 吸光值 顏色 1 0.316 紅色 2 0.289 紅色 3 0.273 紅色 4 0.251 紫紅 5 0.221 淺紫色 6 0.217 淺紫色 7 0.210 淺紫色 8 0.233 淺綠色 9 0.261

49、綠色 10 0.314 藍(lán)綠 pH對(duì)藍(lán)莓花青素影響很大。當(dāng)pH在1~3時(shí)，花青素溶液顯紅色；當(dāng)pH為4時(shí)，藍(lán)莓花青素溶液顏色變淺。pH在5~7時(shí)，花青素溶液褪色的現(xiàn)象愈加明顯，已然從酸性條件下的紅色變成了淺紫色，在pH7時(shí)達(dá)到吸光度的最小值。pH值為8時(shí)，溶液開始顯現(xiàn)為綠色，當(dāng)溶液pH為10呈強(qiáng)堿性時(shí)，顏色加深變?yōu)樗{(lán)綠色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藍(lán)莓花青素的空間結(jié)構(gòu)可能在強(qiáng)酸強(qiáng)堿的條件下發(fā)生變化，從而使溶液顏色產(chǎn)生變化。婁文娟[41]等在研究紫薯花青素時(shí)發(fā)現(xiàn)花青素的保存率在pH為1～5范圍時(shí)下降并不明顯，隨著pH的繼續(xù)升高，花青素的損失率急劇增大，而當(dāng)pH為11時(shí)，花青素的損失率高達(dá)84.6%，表

50、明花青素在堿性條件會(huì)下迅速分解。 2.4.6 食品添加劑對(duì)植物源花青素的影響 表 2.8添加劑對(duì)花青素影響分析 濃度% 吸光度值 亞硫酸氫鈉 苯甲酸鈉 檸檬酸 抗壞血酸 0.00 0.236 0.236 0.236 0.236 0.20 0.315 0.281 0.260 0.298 0.40 0.334 0.270 0.275 0.304 0.60 0.351 0.251 0.296 0.319 0.80 0.271 0.247 0.298 0.269 1.00 0.2

51、34 0.229 0.323 0.245 圖 2.4添加劑對(duì)花青素的影響 結(jié)果表明，抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、苯甲酸鈉、檸檬酸四種不同的食品添加劑對(duì)藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性都有一定的影響。由圖 2.4分析比較可知，加入的亞硫酸氫鈉溶液的濃度在0.6%以下時(shí)，花青素的吸光度為增加趨勢(shì)，但當(dāng)亞硫酸氫鈉的濃度提高到0.6%以上時(shí)，出現(xiàn)了顯著的下降趨勢(shì)，原因可能是亞硫酸氫鈉與藍(lán)莓花青素之間進(jìn)行加成反應(yīng)生成了穩(wěn)定的無色化合物。添加抗壞血酸后，花青素溶液的吸光度出現(xiàn)了和亞硫酸氫鈉加入后的相同變化趨勢(shì)，但吸光度的增強(qiáng)效果不如亞硫酸氫鈉，這是因?yàn)橛捎诖嬖谳^多的抗壞血酸，因此在降解過程中，其生成的過

52、氧化物直接氧化藍(lán)莓花青素，進(jìn)而導(dǎo)致二者均被降解。苯甲酸鈉對(duì)花青素吸光度的影響不顯著，濃度為1%時(shí)的溶液吸光度與未添加時(shí)溶液吸光度差異不大。檸檬酸溶液在所配置的濃度范圍內(nèi)是花青素溶液的吸光度值升高，存在一定的增色效應(yīng)，這可能是因?yàn)闄幟仕嶙鳛樗嵛秳?，可以降低溶液的pH值，有利確?；ㄇ嗨赜懈叩姆€(wěn)定表現(xiàn)。 2.4.7 金屬離子對(duì)植物源花青素的影響 表 2.9金屬離子對(duì)花青素影響研究 離子類別 未添加 Na+ K+ Ca2+ Fe3+ Mg2+ Cu2+ 吸光度值 0.232 0.227 0.231 0.221 0.384 0.219 0.271 顏色 紫紅

53、色 紫紅色 紫紅色 紫紅色 黑紫色 紫紅色 紫色 圖 2.5不同金屬離子對(duì)花青素的影響 結(jié)合圖 2.5的結(jié)果，證實(shí)了等對(duì)花青素的穩(wěn)定性影響表現(xiàn)不大，所以在完成添加后溶液顏色沒有變化。溶液受金屬離子Fe3+和Cu2+的影響，發(fā)生了明顯改變，由紫紅色變?yōu)楹谧仙蜃仙?，說明藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性受到了Fe3+和Cu2+的顯著的影響。造成這一現(xiàn)象的原因可能是藍(lán)莓花青素B環(huán)上的鄰位羥基與Fe3+和Cu2+反應(yīng)生成了深色絡(luò)合物。 2.5 小結(jié) 藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性受光照影響較大，長(zhǎng)時(shí)間的光照會(huì)加速花青素的破壞速率，加快降解過程，從而導(dǎo)致顏色消退。藍(lán)莓花青素溶液的顏色隨著pH變化而變

54、化，由紅色到紫色再到藍(lán)綠色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明花青素在酸性條件下更穩(wěn)定。藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性易受溫度影響，在40~60℃時(shí)較穩(wěn)定，而在80℃時(shí)花青素的保存率明顯下降。所以高溫、長(zhǎng)時(shí)間光照以及堿性環(huán)境均不利于花青素的保存?？箟难?、亞硫酸氫鈉、苯甲酸鈉、檸檬酸四種添加劑對(duì)藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性都有一定的影響。通過對(duì)四種不同食品添加劑的研究比較發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉對(duì)藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性影響較??；抗壞血酸、亞硫酸氫鈉能在一定程度上提高藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性，且存在一定的量效關(guān)系。檸檬酸則對(duì)藍(lán)莓花青素具有增色效應(yīng)。金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+對(duì)花青素溶液的穩(wěn)定性影響不明顯，而Fe3+、Cu2+等則會(huì)破壞花青素穩(wěn)定性。

55、 3 植物源花青素抗氧化活性研究 從花青素的結(jié)構(gòu)可以看出，它具有大量的酚羥基官能團(tuán)，有很強(qiáng)的抗氧化活性， 本研究以藍(lán)莓提取物為實(shí)驗(yàn)原材料，對(duì)其體外抗氧化活性做出論述。在進(jìn)行研究上主要是結(jié)合藍(lán)莓花青素在DPPH、羥基自由基以及超氧陰離子等方面的表現(xiàn)等展開論述。 3.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 表 3.1主要實(shí)驗(yàn)試劑 3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 表 3.2 試驗(yàn)過程中主要使用的儀器 3.2 試驗(yàn)方法 3.2.1 清除超氧陰離子自由基分析方法 ①溶液配制 1）0.1mol/L HCL溶液：將4.2ml濃

56、鹽酸放入500ml容量瓶并用超純水溶解定容。 2）0.1mol/L Tris溶液：將三羥甲基氨基甲烷1.2114g放入100ml容量瓶并用超純水溶解定容。 3）0.05mol/L Ph8.2的Tris-HCL溶液：量取50ml0.1mol/L Tris以及22.9ml0.1mol/L HCL溶兩種溶液，在充分混合后，加入100ml容量瓶并用超純水溶解定容。 4）0.01mol/L HCL溶液：取已配制好的0.1mol/L HCL溶液進(jìn)行10倍稀釋操作。 5）25mmol/L鄰苯三酚溶液：將0.1576g鄰苯三酚放入50ml棕色容量瓶加入0.01mol/L HCL溶液，使其充分溶解，而后

57、進(jìn)行25℃水浴。 6）8mol/LHCL溶液：將4.2ml濃鹽酸放入100ml容量瓶并用超純水定容。 ②實(shí)驗(yàn)操作步驟 選擇0.05mol/LpH8．2的Tris—HCI緩沖溶液4．5m1，在25℃進(jìn)行恒溫水浴20分鐘。進(jìn)行1ml樣品以及0．5ml25mmol/L鄰苯三酚溶液混合，在25℃進(jìn)行恒溫水浴5分鐘。隨后在其中加入8mol/LHC1溶液1ml停止反應(yīng)。參比是Tris—HCI緩沖溶液，空白對(duì)照組是超純水，對(duì)照組是抗壞血酸、α-生育酚、丁基羥基茴香醚，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)操作。用T6型紫外可見光分光光度計(jì)完成425nm處吸光度測(cè)定，進(jìn)行3次測(cè)試結(jié)果的平均值求取，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)清除率的計(jì)算。

58、 超氧陰離子自由基清除率(%)= （3.1） A0、A分別是空白以及樣品或是對(duì)照品對(duì)應(yīng)的平均吸光度。 3.2.2 清除羥基自由基分析方法 ①溶液配制 1）溶液：將0.2502g七水硫酸亞鐵放入100ml容量瓶并用超純水溶解定容。 2）水楊酸一乙醇溶液：將0.1243g水楊酸放入100ml容量瓶并用無水乙醇溶解定容。 3) 溶液：將0.1ml 30%過氧化氫放入100ml容量瓶并用超純水溶解定容。 ②實(shí)驗(yàn)操作步驟 分別在試管里加入9mmol/LFeSO4溶液、水楊酸一乙醇溶液、樣品溶液、各1ml，選擇37℃進(jìn)行恒溫水浴半小時(shí)。參比是雙蒸水，空白對(duì)照組是超純水，對(duì)照組

59、是抗壞血酸、α-生育酚、丁基羥基茴香醚，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)操作。使用T6型紫外可見光分光光度計(jì)完成510nm處吸光度測(cè)定，進(jìn)行3次測(cè)試結(jié)果的平均值求取，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)清除率的計(jì)算。 羥基自由基的清除率(%)= （3.2） A0、A分別是空白以及樣品對(duì)應(yīng)的平均吸光度。 3.2.3 清除DPPH·自由基分析方法 ①溶液配制 0．04mg/mlDPPH溶液：選擇0.0020g DPPH，而后將其在乙醇里進(jìn)行充分溶解，選擇50ml棕色容量瓶對(duì)完成溶解的溶液進(jìn)行定容。 ②實(shí)驗(yàn)操作步驟 在試管里進(jìn)行0.04mg/mlDPP以及樣品溶液分別2ml?？瞻捉M是0.04mg/mlDPP以

60、及超純水分別是2ml。對(duì)照組在樣品溶液的使用上，分別是抗壞血酸、α-生育酚、丁基羥基茴香醚。進(jìn)行3次重復(fù)的試驗(yàn)操作，并完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄，分別進(jìn)行517nm處吸光度測(cè)量。則其在DPPH·清除率方面表現(xiàn)計(jì)算公式為： DPPH·的清除率(%)=[1—(Ai一Aj)/Ac]×100 （3.3） Ai、Aj以及Aj分別是DPPH+待測(cè)溶液、測(cè)溶液+溶劑以及DPPH溶液+溶劑分別對(duì)應(yīng)的的吸光度值。 3.3 統(tǒng)計(jì)分析 基于Excel、SPSS Statistics V22.0完成試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和研究，在進(jìn)行數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)上，基于均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，要對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)

61、行3次的重復(fù)處理操作。 3.4 結(jié)果與分析 3.4.1 對(duì)超氧陰離子（O2ˉ?）清除作用 圖 3.1對(duì)超氧陰離子清除作用 若有過涼的超氧陰離子自由基存在，容易導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化情況出現(xiàn)，甚至在細(xì)胞內(nèi)造成DNA損傷[42]，所以進(jìn)行超氧陰離子自由基清除的價(jià)值十分突出。結(jié)合圖3.1的結(jié)果，藍(lán)莓花青素、抗壞血酸、BHA都可對(duì)O2ˉ?進(jìn)行清除作用，且隨著濃度的升高，清除率逐漸増大。藍(lán)莓花青素和抗壞血酸清除O2ˉ?的能力明顯高于BHA?？箟难嵩谳^低的質(zhì)量濃度時(shí)，表現(xiàn)出較好的清除效果。在100ug/ml時(shí)，抗壞血酸對(duì)O2ˉ?的清除率可達(dá)到35%左右，而藍(lán)莓花青素僅為25%。但若是濃度為4000

62、ug/ml，則其清除能力十分突出，要比抗壞血酸高。程錚等在研究紫甘薯花青素的抗氧化活性時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)花青素有較低濃度的情況下，在自由基清除方面效果不及抗壞血酸。但是若其濃度超出0.23mg/ml，則有較為出色自由基清除表現(xiàn)，效果要比抗壞血酸顯著高出不少[43]。 3.4.2 羥自由基(·OH)清除作用 圖 3.2對(duì)羥基自由基的清除作用 圖 3.3對(duì)羥基自由基清除作用 通過結(jié)果研究，藍(lán)莓花青素、丁基羥基茴香醚、抗壞血酸、α-生育酚均表現(xiàn)出一定的對(duì)?OH的清除能力，且隨著加入的抗氧化劑濃度的升高，清除率出現(xiàn)增大趨勢(shì)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。藍(lán)莓花青素和抗壞血酸對(duì)?OH的清除能力明顯高于丁

63、基羥基茴香醚與α-生育酚。使用SPSS Statistics V22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果的的研究，在進(jìn)行50%羥基自由基清除表現(xiàn)上，藍(lán)莓花青素、抗壞血酸對(duì)應(yīng)的IC50值分別是0.075mg/ml、0.219mg/ml，因此在清除能力表現(xiàn)上，藍(lán)莓花青素更突出。若是0.01mg/ml濃度，此時(shí)花青素在自由基清除上可以實(shí)現(xiàn)60%的清除效率，而抗壞血酸對(duì)羥基自由基的清除率不足20%。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)羥基自由基的清除能力的大小順序?yàn)椋核{(lán)莓花青素﹥抗壞血酸﹥BHA﹥?chǔ)烈簧??？箟难犭m也具備一定的清除能力，但自氧化過程生成的過氧化氫會(huì)促進(jìn)Fenton反應(yīng)中?OH的生成，因此清除能力相對(duì)較弱。 3.

64、4.3 DPPH自由基清除作用 圖 3.4對(duì)DPPH自由基的清除作用 圖 3.5DPPH自由基清除作用 結(jié)合上圖圖 3.4－圖 3.5，主要是就花青素、抗壞血酸、α-生育酚以及丁基羥基茴香醚在自由基清除方面的效果表現(xiàn)做出了分析和論述，基于試驗(yàn)可知，四種物質(zhì)均可以完成自由基清除，其中花青素和抗壞血酸清除DPPH·自由基效果要比α-生育酚、丁基羥基茴香醚更突出，優(yōu)勢(shì)十分明顯。其中在自由基清除上，丁基羥基茴香醚效果最不理想?；赟PSS Statistics V22.0對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行研究，進(jìn)而能夠獲取藍(lán)莓花青素、抗壞血酸、α一生育酚、丁基羥基茴香醚對(duì)DPPH·自由基的清除率達(dá)到50%

65、時(shí)的IC50值分別為12.693ug/ml、15.478ug/ml、28.461ug/ml、79.469ug/ml。濃度大于50ug/ml時(shí)，花青素和抗壞血酸的幾乎可以完全清除DPPH?自由基，總體差異不明顯。 3.5 小結(jié) 在這部分的試驗(yàn)分析上，使用的是三類氧化模型，分別是羥基以及DPPH自由基兩個(gè)模型，以及DPPH自由基模型等，鑒定了藍(lán)莓花青素具有強(qiáng)大的抗氧化活性，并對(duì)比了藍(lán)莓花青素、抗壞血酸、α-生育酚、丁基羥基茴香醚在各體系中的抗氧化能力大小。藍(lán)莓花青素在3個(gè)不同抗氧化體系中都表現(xiàn)出清除能力，藍(lán)莓花青素濃度越大，抗氧化活性越強(qiáng)。 在清除超氧陰離子的體系中，花青素與抗壞血酸對(duì)O2

66、-·的清除能力明顯高于丁基羥基茴香醚。濃度較低時(shí)，抗壞血酸的清除表現(xiàn)要比藍(lán)莓花青素略微出色。但是在濃度是400ug/ml情況下，此時(shí)藍(lán)莓花青素的自由基清除表現(xiàn)更為出色。對(duì)于羥基自由基而言，藍(lán)莓花青素、抗壞血酸在自由基清除方面的效果要顯著高于丁基羥基茴香醚與α-生育酚。基于自由基清除的能力從高到低進(jìn)行排序，應(yīng)該是：藍(lán)莓花青素﹥抗壞血酸﹥丁基羥基茴香醚﹥?chǔ)?生育酚。在清除DPPH自由基的體系中，藍(lán)莓花青素和抗壞血酸仍體現(xiàn)出較高的羥基自由基的清除能力。 4 結(jié)論與展望 4.1 結(jié)論 近年來，隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)花青素類安全性高，擁有多種生理活性的天然產(chǎn)物及其衍生產(chǎn)品的要求也越來越高。本文以藍(lán)莓提取物為研究對(duì)象對(duì)其中花青素含量情況做出了研究，同時(shí)海分析了花青素的穩(wěn)定性表現(xiàn)，并就藍(lán)莓提取物抗氧化作用進(jìn)行了探討，得出以下主要結(jié)論： （1）本研究通過紫外可見光分光光度法在 450~600nm的可見光條件下測(cè)定藍(lán)莓花青素的最大吸收波長(zhǎng)為520nm，由此確定了針對(duì)本實(shí)驗(yàn)中藍(lán)莓提取物樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm。 （2）本研究使用T6型紫