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1、第二章 發(fā)酵液的預處理和菌體的回收,固體顆粒沉降速度,,,與固液分離相關的微生物發(fā)酵液特性： 發(fā)酵產物濃度較低，大多為110，懸浮液中大部分是水，處理體積量大； 各類細胞的顆粒小，相對密度與液相相差不大； 細胞含水量大，可壓縮性大，一經(jīng)壓縮就會變形； 流變特性復雜，液相粘度大，吸附在濾布上； 性質不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。 動植物細胞沒有微生物細胞耐剪切，不適于離心。 因此，這些特性使得發(fā)酵液的過濾與離心相當困難。,工業(yè)技術中典型的固體粒子,,,,,發(fā)酵液的預處理,發(fā)酵液的預處理目的和內容： 改變發(fā)酵液的物理性質，促進從懸浮液中分離固形物的速度
2、，提高固液分離器的效率； 分離菌體和其他懸浮顆粒，除去部分可溶性雜質和改變?yōu)V液的性質，以利于提取和精制后繼各工序的順利進行。 發(fā)酵液的預處理主要包括： 發(fā)酵液過濾特性的改變； 相對純化。,,,濾餅的過濾速率,,,,,,（一）發(fā)酵液過濾特性的改變 目的：通過對發(fā)酵液進行適當?shù)念A處理，即可改善其流體性能，降低濾餅阻力，提高過濾與分離的速率。 方法：調酸(等電點)、熱處理、電解質處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質、添加反應劑、冷凍解凍及添加助濾劑等。,濾餅的過濾速率,1 降低液體粘度 加水稀釋法：能降低液體粘度，但會增加懸浮液的體積，加大后繼過程的處理任務。而且，單從過濾操作看，稀
3、釋后過濾速率提高的百分比必須大于加水比才能認為有效，即若加水一倍，則稀釋后液體的粘度必須下降50以上才能有效提高過濾速率。 升高溫度：可有效降低液體粘度，提高過濾速率。同時，在適當溫度和受熱時間下可使蛋白質凝聚，形成較大顆粒的凝聚物，進一步改善了發(fā)酵液的過濾特性。 注意事項：嚴格控制加熱溫度與時間。首先，加熱的溫度必須控制在不影響目的產物活性變質的范圍內；其次，溫度過高或時間過長，會使細胞溶解，胞內物質外溢，增加發(fā)酵液的復雜性，影響其后的產物分離與純化。,2 調整pH pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質的電離度和電荷性質，適當調節(jié)pH值可改善其過濾特性。此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預處理較
4、常用的方法之一。 如利用酸堿性來調液pH值使蛋白質等兩性物質達到等電點得以除去。又如過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質易與膜發(fā)生吸附，通過調整pH值改變易吸附分子的電荷性質，即可減少堵塞和污染。,,細 胞 組 成,3 凝聚與絮凝 采用凝聚和絮凝技術能有效改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質的分散狀態(tài)，使其聚結成較大的顆粒，便于提高過濾速率。除此之外，還能有效地除去雜蛋白質和固體雜質，提高濾液質量。因此，凝聚和絮凝是目前工業(yè)上最常用的預處理方法之一。常用于菌體細小而且粘度大的發(fā)酵液的預處理。,凝聚作用就是向膠體懸浮液中加入某種電解質，在電解質中異電離子作用下，膠粒的雙電層電位降低，使膠體體系
5、不穩(wěn)定，膠體粒子間因相互碰撞而產生凝集（1mm左右）的現(xiàn)象。 Al3+Fe 3+ H+ Ca2+ Mg2+ K + Na + Li + 。 常用的凝聚電解質有硫酸鋁(明礬)、氯化鋁、三氯化鐵、硫酸亞鐵、石灰、硫酸鋅、碳酸鎂等。,膠體雙電層的構造,絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產生橋架聯(lián)接時，形成粗大的絮凝團（10mm）的過程。絮凝是一種以物理的集合為主的過程。 絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質量可高達數(shù)萬至一千萬以上，它們具有長鏈狀結構，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團，這些基團通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的
6、作用，強烈地吸附在膠粒的表面。,絮凝劑的化學結構,1. 要求其分子必須含有相當多的活性官能團，使之能和膠粒表面相結合； 2. 具有長鏈的線性結構，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團， 3. 相對分子質量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。,根據(jù)其活性基團在水中解離情況的不同，絮凝劑可分為非離子型、陰離子型和陽離子型三類。 根據(jù)其來源的不同，工業(yè)上使用的絮凝劑又可分為如下三類： (1)有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙類衍生物。 (2)無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等。 (3)天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼
7、多糖等。,絮凝劑的分類,絮凝效果與絮凝劑的加量、相對分子質量和類型、溶液的pH、攪拌轉速和時間等因素有關。,,影響絮凝效果的因素,帶負電荷的菌體 或蛋白質,陽離子型高分子絮凝劑,非離子型和 陰離子型高分子絮凝劑,電解質,非離子型和 陰離子型高分子絮凝劑,,,,+,?,?,?,包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。,4 加入助濾劑 助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，吸附膠體，擴大過濾面積，濾速增大。 常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。 助濾劑的使用方法有兩種：一種是在過濾介質表面預涂助濾劑，另一種是直接加入發(fā)酵液，也可兩
8、種方法同時兼用。,助濾劑使用要點,根據(jù)目的產物選擇助濾劑品種 根據(jù)過濾介質和過濾情況選擇助濾劑品種 粒度選擇 使用量選擇,5 加入反應劑 利用反應劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應生成不溶性沉淀。 作用：生成的沉淀能防止菌絲體粘結，使菌絲具有塊狀結構，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，消除發(fā)酵液中某些雜質對過濾的影響，從而改善過濾性能。 舉例：如在新生霉素發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉。 環(huán)絲氨酸發(fā)酵液用氧化鈣和磷酸處理，生成磷酸鈣沉淀。,（二）發(fā)酵液的相對純化 高價無機離子的存在： 影響樹脂對生化物質的交換容量。 可溶性蛋白質的存在： 降低離子交換和吸附法提取
9、時交換容量和吸附能力；在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清；在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質堵塞或受污染，影響過濾速率。,,1 高價無機離子的除去 去除鈣離子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度較小，不適合用量較大的場合，可用其可溶性鹽，草酸價格昂貴，注意回收。 去除鎂離子：加入三聚磷酸鈉，與鎂離子形成絡合物。 用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。例如：環(huán)絲氨酸的提取。 去除鐵離子，可加入黃血鹽，使其形成普魯士藍沉淀而除去。,2 雜蛋白質的除去 (1) 沉淀法 蛋白質在酸性溶液中，能與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形
10、成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、 Cu2+ 、 Zn 2+、Fe 3+ 和Pb2+等形成沉淀。 (2) 吸附法 加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質而除去。 例如：在枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而可加快過濾速率。,(3)變性法 加熱，大幅度調節(jié)pH，加酒精等有機溶劑或表面活性劑等。 例如：在抗生素生產中，常將發(fā)酵液pH調至偏酸性范圍(pH2 3) 或較堿性范圍(pH89)使蛋白質凝固，一般以酸性下除去的蛋白質較多。 變性法的局限性：加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產物；極端pH也會導致
11、某些目的產物失活，并且要消耗大量酸堿；而有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。,二、固液分離 發(fā)酵液固液分離的主要是離心分離和過濾。 不同性狀的發(fā)酵液應選擇不同的固液分離方法 霉菌和放線菌發(fā)酵液：過濾方法 細菌和酵母菌發(fā)酵液（未經(jīng)預處理）：高速離心。 細菌和酵母菌發(fā)酵液（進行預處理）：過濾方法。 舉例：如菌體較小的氨基酸發(fā)酵液，采用絮凝和添加助濾劑等方法進行預處理后，即可用板框過濾機或帶式過濾機進行菌體分離,（一）離心分離 離心分離是利用轉鼓高速轉動所產生的離心力，來實現(xiàn)懸浮液、乳濁液分離或濃縮的分離的過程。 特點：分離速率快、分離效率高、液相澄清度好等優(yōu)點。
12、 缺點：設備投資高、能耗大，此外連續(xù)排料時，固相干度不如過濾設備。,碟片式離心機,按卸料方式的不同，碟片式離心機分為: 人工卸料 自動間歇排料 噴嘴連續(xù)排料 特點：前兩種適合于懸浮液固形顆粒含量較少的場合。間歇式操作，固相干度較好；而連續(xù)操作固相含液量較大，其固相仍具有流動性。,適用范圍,碟片式離心機適應于細菌、酵母菌、放線菌等多種微生物細胞懸浮液及細胞碎片懸浮液的分離。 它的生產能力較大，最大允許處理量達300m3h，一般用于大規(guī)模的分離過程。,管式離心機,管式離心機也是一種沉降式離心機，可用于液液分離和固液分離。當用于液液分離時為連續(xù)操作，而用于固液分離時則為間歇操作，操作一段時間后
13、需將沉積于轉鼓壁上的固體定期人工卸除。,管式離心機的轉鼓直徑較小，容量有限，因此生產能力較小。轉速相對較低的管式離心機最大處理量可達10m3h。 管式離心機除可用于微生物細胞的分離外，還可用于細胞碎片、細胞器、病毒、蛋白質、核酸等生物大分子的分離。 管式離心機設備簡單，操作穩(wěn)定，分離效率高。在生物工業(yè)中，特別適合于一般離心機難以分離而固形物含量<1的發(fā)酵液的分離。對于固形物含量較高的發(fā)酵液，由于不能進行連續(xù)分離，需頻繁拆機卸料，影響生產能力，且易損壞機件。,傾析式離心機 靠離心力和螺旋的推進作用自動連續(xù)排渣，因而也稱為螺旋卸料沉降離心機。傾析式離心機的轉動部分由轉鼓及裝在轉鼓中的螺旋輸送器
14、組成，兩者以稍有差別的轉速同向旋轉。在離心力作用下，固體顆粒發(fā)生沉降分離，沉積在轉鼓內壁上。堆積在轉鼓內壁上的固相靠螺旋推向轉鼓的錐形部分，從排渣口排出。,優(yōu)點：具有操作連續(xù)、適應性強、應用范圍廣、結構緊湊和維修方便等優(yōu)點，特別適合于含固形物較多的懸浮液的分離。 缺點：這種離心機的分離效果較差，因而不適合于細菌、酵母菌等微小微生物懸浮液的分離。此外，液相的澄清度也相對較差。,常用離心機的特性及選用,（二）過濾 根據(jù)過濾機理的不同，過濾操作可分為澄清過濾和濾餅過濾兩種。 澄清過濾:將過濾介質填充于過濾器內構成過濾層，當懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，這種方法叫
15、做澄清過濾。 過濾介質：硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒等，也有用燒結陶瓷、燒結金屬、粘合塑料及用金屬絲繞成的管子等組成的成型顆粒濾層。 適合于固體含量少于0.1gl00ml、顆粒直徑在5100m的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。,濾餅過濾：過濾介質為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布，及氈、石棉板、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布所阻攔而逐漸形成濾餅(或稱濾渣)。當濾餅至一定厚度時即起過濾作用，此時即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾或濾渣過濾。 此種方法適合于固體含量 0.1g100ml的懸浮液的過濾分離。 濾餅過濾按
16、推動力的不同可以分為四種，即重力過濾、加壓過濾、真空過濾和離心過濾。,板框過濾機是一種傳統(tǒng)的過濾設備，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛應用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。,板框過濾機,特點： 優(yōu)點：結構簡單，裝配緊湊，過濾面積大；過濾的推動力(壓力差)能大幅度調整，并能耐受較高的壓力差，因而固相含水分低，并能適應不同過濾特性的發(fā)酵液的過濾；輔助設備少、維修方便、價格低和動力消耗少等。 缺點：設備笨重、間歇操作、勞動強度大、衛(wèi)生條件差、輔助時間多和生產效率低。 板框過濾機比較適合于固體含量110的懸浮液的分離。,特點： 自動化程度高、操作連續(xù)和處理量大適合于固體含量較大(1
17、0)的懸浮液的分離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母菌發(fā)酵液或細胞懸浮液的過濾分離。 由于受推動力(真空度)的限制，真空轉鼓過濾機一般不適于菌體較小和粘度較大的細菌發(fā)酵液的過濾。此外，采用真空轉鼓過濾機過濾所得固相的干度不如加壓過濾。,真空轉鼓過濾機,又稱錯流過濾、交叉過濾和十字流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術。其操作特點是使懸浮液在過濾介質表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質表面的固體(濾餅)移走。當移走固體的速率與固體的沉積速率相等時，過濾速濾就近似恒定。,,切向流過濾,這種方式目前僅用于實驗室規(guī)模，處理量較少。 它的特點是靈活、操作方便; 可以維持較高的過濾速率。 目前切向流過濾的缺點還有： 過濾面積小，剪切力不均勻。 能耗比一般過濾高，大部分用來使流體產生快速流動。 固相的含水量較高，主要是起濃縮作用。當固相濃度較高而使流動性能下降時，過濾速率迅速下降。 不能避免過濾介質的污染和堵塞。,,其它分離方法： 4 雙水相萃取 5 吸附法,
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