益生菌耐受性對噴霧干燥后菌體活性的影響研究分析 生物技術(shù)專業(yè)

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1、 目 錄 摘 要 - 1 - Abstract - 2 - 第一章 前言 - 3 - 1.1 益生菌 - 3 - 1.1.1 益生菌的概念和常見益生菌的分類 - 3 - 1.1.2 益生菌的作用 - 3 - 1.1.3 人體內(nèi)的乳酸桿菌 - 4 - 1.2 噴霧干燥法制取活性益生菌干粉 - 4 - 1.2.1 活性益生菌干粉 - 4 - 1.2.2 噴霧干燥技術(shù) - 4 - 第二章 材料與方法 - 6 - 2.1 材料 - 6 - 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 - 7 - 2.2.1 實(shí)驗(yàn)所用溶液 - 7 - 2.2.2 溫度曲線的測定 - 7 - 2.2.4 菌種的轉(zhuǎn)

2、接 - 7 - 2.2.5 菌種的活化 - 7 - 2.2.6 擴(kuò)大菌含量進(jìn)行培養(yǎng) - 8 - 2.2.7 收集菌液 - 8 - 2.2.8 熱處理 - 8 - 2.2.9 革蘭氏染色法 - 8 - 2.2.9 噴霧干燥 - 9 - 2.3 測定方法 - 9 - 2.3.1 稀釋涂布平板法 - 9 - 2.3.2 存活率計(jì)算 - 10 - 第三章 結(jié)果與討論 - 11 - 3.2 溫度曲線的測定 - 12 - 3.3 LGG與LCBL23在RSM培養(yǎng)基中的生長狀況 - 13 - 3.4 LGG與LCBL23在RSM培養(yǎng)基中不同生長條件下的菌活 - 14 - 3.5

3、LGG與LCBL23在RSM培養(yǎng)基中不同生長條件下的熱處理存活率 - 15 - 3.6 噴霧干燥 - 16 - 第四章 結(jié)論 - 17 - 參考文獻(xiàn) - 18 - 致謝 - 19 - 摘 要 本課題采用鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）和干酪乳桿菌BL23（Lactobacillus casei BL23，LCBL23）作為模型菌株，研究不同的生長環(huán)境對益生菌耐受性的影響，并通過熱處理對益生菌耐受性進(jìn)行測量，以期設(shè)計(jì)一個(gè)良好的生長環(huán)境可以有效地提高噴霧干燥中益生菌的耐受性用以提高益生菌的存活率。 我們選用了在噴霧干燥

4、過程中擁有良好保護(hù)性的載體復(fù)溶脫脂奶（RSM）和葡萄糖溶液作為生長培養(yǎng)基，對比了LGG菌株和LCBL23菌株在RSM培養(yǎng)基中不同生長條件下的生長狀況和60 oC水浴中熱處理不同時(shí)間后的菌活，以了解RSM培養(yǎng)基在不同的生長條件下對益生菌耐受性的影響。在不同生長條件下的RSM培養(yǎng)基中的LGG和LCBL23的菌活的初始水平基本保持在108 cfu/mL，60 oC熱處理3 min后出現(xiàn)了活性的快速降低。在熱處理的后期，RSM菌液的溫度快速升高，在42 oC有氧條件下培養(yǎng)的LGG菌株表現(xiàn)出了相較于其他培養(yǎng)條件更好的耐受性，使用其他培養(yǎng)條件的菌體相較于42 oC有氧條件下培養(yǎng)的死亡率更高，可能是較嚴(yán)峻的

5、生長條件增強(qiáng)了菌株的耐受性，而LCBL23同樣在42 oC有氧條件下?lián)碛辛溯^其他生長條件更好的耐受性，筆者認(rèn)為出現(xiàn)這樣的情況同樣是因?yàn)橄鄬?yán)峻的生長條件增強(qiáng)了LCBL23菌株的耐受性。 本論文采用熱處理和噴霧干燥的方法探究益生菌耐受性對噴霧干燥后菌體活性的影響。對比不同生長條件下益生菌耐受性對熱處理后菌體活性的影響，得到用于噴霧干燥的益生菌的最佳生長條件，以期提高益生菌的耐受性，從而提高噴霧干燥益生菌粉末的產(chǎn)量。 關(guān)鍵詞：益生菌；噴霧干燥；熱處理；細(xì)胞活性；生長條件 Abstract In this study, different growth conditions were

6、employed to culture model microorganisms of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and Lactobacillus casei BL23 (LCBL23), to study the effect of growth environment on the stress tolerance of probiotic cells, and to measure the probiotic tolerance during heat treatment. The objective was to design a good

7、growth condition that can effectively improve the tolerance of probiotics in spray drying, which results in the maximum survival of probiotics. Reconstituted skim milk (RSM) supplemented with glucose, which showed excellent protection during spray drying process, was used as growth medium. The growt

8、h profiles of LGG and LCBL23 cultured under different conditions were compared. The viability of the two strains after heat treatment at 60 oC in a water bath was used to understand the effect of different growth conditions. The initial viability of LGG and LCBL23 in RSM/Glu medium under all growth

9、conditions was maintained at 108 cfu/mL, and the viability declined rapidly after 3 min at 60 oC. At the later stage of heat treatment, the temperature of the cell culture rapidly increased, and the LGG strain cultured under aerobic conditions at 42 oC showed better tolerability than the cells under

10、 other culture conditions. When LGG culture obtained at other culture conditions was used, the mortality than the culture at 42 oC aerobic condition, which may indicate that the adverse growth conditions at 42 oC aerobic condition could enhance strain tolerance. Similarly, LCBL23 also showed higher

11、 tolerance when cultured under 42 oC aerobic condition. In this thesis, heat treatment and spray drying methods were used to explore the effect of probiotic tolerance on the viability of bacteria. Comparing the effects of probiotic tolerance under different growth conditions on the viability of bact

12、erial cells after heat treatment, the best growth conditions for probiotics for spray drying were determined as 42 oC aerobic condition, which can effectively increase the tolerance of probiotics and thus increase the survival of probiotics after spray drying. Keywords: probiotics, spray drying;

13、heat treatment; cell viability; growth condition 第一章 前言 1.1 益生菌 1.1.1 益生菌的概念和常見益生菌的分類 益生菌(probiotics)，又稱為益生素、活性菌、促生素、微生態(tài)制劑，是一類可以平衡并維持人體內(nèi)菌群，同時(shí)可以對人體的健康產(chǎn)生一定有益作用的活菌產(chǎn)品或者含有菌體代謝產(chǎn)物及菌體組分一些的死菌產(chǎn)品[1]。益生菌（probiotics）這一單詞最早源自于希臘文，它的意思是：對生命有益的一類微生物。目前常見的乳酸菌來自于九個(gè)屬：乳酸乳球菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、迷走球菌屬、片球菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、

14、肉食桿菌屬和孢子乳酸菌屬。前五個(gè)屬為球狀細(xì)菌，后四個(gè)屬為桿狀細(xì)菌[2]。 1.1.2 益生菌的作用 1903年，諾貝爾獎獲得者著名的俄國生物學(xué)家梅契尼柯夫（Elie Metchnikoff）開始研究衰老與長壽的關(guān)系并提出了“乳酸菌長壽說”。他發(fā)現(xiàn)在他進(jìn)行研究的很多國家和地區(qū)中，保加利亞地區(qū)居住的百歲老人的數(shù)量十分可觀。梅契尼柯夫?qū)@一發(fā)現(xiàn)非常感興趣，于是他開始研究其中的原因，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)厝藥缀趺刻於硷嬘盟崮?，因此梅契尼柯夫認(rèn)為保加利亞地區(qū)百歲老人的健康和長壽的原因是當(dāng)?shù)貜V泛食用的保加利亞酸奶中的微生物，所以他將酸奶中的微生物命名為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus Bulgar

15、icus）。梅契尼柯夫認(rèn)為酸奶中含有大量的益生菌，可以進(jìn)入人的體內(nèi)，改變腸道菌群并抑制對健康不利的細(xì)菌的生長，從而減少腸道內(nèi)有害菌產(chǎn)生的毒素，造就了保加利亞地區(qū)居民的長壽。 如今，很多人都在使用以益生菌為主要原料的食品或藥品進(jìn)行自我保健，這是一種利用乳酸菌、雙歧乳酸桿菌等益生菌作為主進(jìn)行疾病的預(yù)防或保健的新型自我保健方法。益生菌可以通過很多類型的發(fā)酵乳制品或者其他種類食品進(jìn)入人體調(diào)整腸道的微生態(tài)平衡，也可以作為藥品治療一些腸道疾病。 1.1.3 人體內(nèi)的乳酸桿菌 乳酸桿菌是人體腸道正常菌群重要的一類菌種，它們定植于人體腸道中，具有較強(qiáng)的耐酸性。目前發(fā)現(xiàn)在人體腸道環(huán)境中常見的乳菌桿菌有

16、如下種類：嗜酸乳桿菌群、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、植物乳桿菌、類植物乳桿菌、布氏乳桿菌和羅伊氏乳桿菌等[3]。但存在于人體腸道內(nèi)的所有乳酸桿菌因?yàn)榭茖W(xué)技術(shù)水平的原因尚不能全部鑒定分離，迄今為止我們發(fā)現(xiàn)的乳酸菌有18個(gè)屬152種[4]。 1.2 噴霧干燥法制取活性益生菌干粉 1.2.1 活性益生菌干粉 活性益生菌干粉有利于儲存產(chǎn)品和易于運(yùn)輸，同時(shí)可以在一定程度上滿足日益增長的市場需求，具有活性的益生菌干粉具有巨大的商業(yè)價(jià)值。相較于益生菌的液體產(chǎn)品而言，益生菌干粉具有菌種的活性保存時(shí)間更長、物流成本相對低廉、質(zhì)量更容易控制同時(shí)方便被進(jìn)一步加工等諸多優(yōu)點(diǎn)。

17、 1.2.2 噴霧干燥技術(shù) 噴霧干燥現(xiàn)代食品工業(yè)中應(yīng)用十分的悠久和廣泛的一種干燥方法，具有制粉快速和產(chǎn)量大的有點(diǎn)，是目前工業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的干燥手段[5]。具有活性的益生菌粉末在食品行業(yè)中有著十分重要的地位和可觀的商業(yè)價(jià)值。目前活性益生菌粉末的加工技術(shù)有噴霧干燥技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)和包埋技術(shù)。與冷凍干燥技術(shù)相比，噴霧干燥技術(shù)的設(shè)備便于操作、制粉成本低廉、制粉迅速且產(chǎn)量高。噴霧干燥的過程是首先將進(jìn)料液霧化成很多細(xì)小的液滴，然后在噴霧塔中與熱空氣充分混合使料液的溶劑蒸發(fā)，最后變成干燥的顆粒通過旋風(fēng)進(jìn)行分離或經(jīng)過自然沉降后被收集出塔。噴霧干燥技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要有[6]：第一，快速高效的制粉；第

18、二，噴霧干燥可以用于加工熱敏性材料；第三，噴霧干燥可以單步驟地生產(chǎn)分散顆粒與微膠囊；第四是噴霧干燥可以用于工業(yè)中大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)。因此工業(yè)制取益生菌粉末大部分都在采用噴霧干燥的生產(chǎn)方法[7]。 但益生菌在噴霧干燥過程中會收到諸多其他因素的影響，例如：1.菌體自身耐受性； 2.干燥過程中的載體選擇；3.干燥條件。所以，想要得到具有良好活性的益生菌粉需要改善噴霧干燥過程中的不利環(huán)境因素同時(shí)通過預(yù)處理提高菌體的耐受性，從而減少噴霧干燥過程中的菌活損失。因此，在噴霧干燥的實(shí)際生產(chǎn)中，由于我國乳酸菌飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為每毫升或每克至少含有益生菌活菌數(shù)為106 cfu/mL[8]，因此生產(chǎn)者會綜合利用各種

19、條件和方法以獲得最大菌活。 第二章 材料與方法 2.1 材料 實(shí)驗(yàn)所用儀器及藥品如表格所示。 表 1. 主要儀器 主要儀器 廠家 生物安全柜 上海力康 HFsafe-1200LC 搖床 希爾科（Thermo）SHKE6000-8CE 水浴鍋 精宏XMTE-8112 紅外燈 安勝（Essenscien） 培養(yǎng)箱 日本三洋（SANYO） 電子天平 梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO） T型熱電偶 美國Pico 掃描電子顯微鏡 日本日立 S-4700 表 2. 藥品 藥品 廠家 瓊脂粉 索萊寶（Solarbio） 蛋白胨粉

20、末 索萊寶（Solarbio） M.R.S培養(yǎng)基 Oxoid 葡萄糖粉末 上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司 復(fù)溶脫脂奶（RSM） 澳大利亞德運(yùn)（Devondale） 菌種：鼠李糖乳桿菌（LGG）、干酪乳桿菌 BL23(LCBL23) 在本實(shí)驗(yàn)中RSM培養(yǎng)基均在 110 oC下滅菌 10 min后進(jìn)行使用，實(shí)驗(yàn)用玻璃器及其他容器和溶液則在 121 oC下滅菌15 min后冷卻到室溫使用。 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 實(shí)驗(yàn)所用溶液 5.2 % （w/w）MRS液體培養(yǎng)基、MRS 固體培養(yǎng)基（含1.2 % （w/w）瓊脂粉和5.2 % （w/w）M.

21、R.S）、蛋白胨（0.5 % w/w）、R.S.M培養(yǎng)基：3.2 % （w/w） 復(fù)溶脫脂奶（RSM） + 2 % （w/w） 葡萄糖，所有溶液的配制使用超純水（水的電阻大約等于18 MΩ，來自Milli-Q 超純水系統(tǒng)）。 2.2.2 溫度曲線的測定 將LGG和LCBL23菌種活化后按1 % （v/v）的接種量接種于總固體含量為5.2 %的RSM培養(yǎng)基中37 oC（或42 oC）恒溫培養(yǎng)24 h后，混勻后取出1 ml菌液，置于2 ml離心管中，后放置于60 oC水浴鍋中，使用熱電偶進(jìn)行溫度測量，根據(jù)溫度數(shù)據(jù)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以溫度為縱坐標(biāo)繪制溫度曲線。 2.2.4 菌種的轉(zhuǎn)接

22、 從保存菌種的冰箱中取出一個(gè)接種完成的平板劃線培養(yǎng)基，在無菌環(huán)境下用接種環(huán)挑取單菌落，在滅菌過的固體M.R.S培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線操作，37 oC恒溫培養(yǎng)48 h后取出保存。每周進(jìn)行一次劃線轉(zhuǎn)接操作，以保證菌種活性。 2.2.5 菌種的活化 從冰箱中取出劃線平板在無菌操作環(huán)境下用接種環(huán)挑取1 個(gè)單菌落接入已經(jīng)滅菌的10 ml液體MRS培養(yǎng)基中，在37 oC恒溫培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化。按照上述步驟活化2瓶菌液以備用。 2.2.6 擴(kuò)大菌含量進(jìn)行培養(yǎng) 將活化完成的菌液以1 % （v/v）的接種量接入總固體含量為5.2 %的RSM培養(yǎng)基，不同的生長條件下恒溫培養(yǎng)24 h，生長條件

23、分別為：1.厭氧條件下37 oC恒溫培養(yǎng)24 h；2.在20 rpm的條件下37 oC恒溫培養(yǎng)24 h；3.厭氧條件下42 oC恒溫培養(yǎng)24 h；4. 20 rpm的條件下42 oC恒溫培養(yǎng)24 h。 2.2.7 收集菌液 將培養(yǎng)后的菌液在無菌環(huán)境下混勻后取出1 ml菌液置于2 ml離心管中。按照此步驟取樣若干瓶菌液以備用。 2.2.8 熱處理 將收集好的菌液置于離心管中后，分別置于60 oC水浴鍋中恒溫?zé)崽幚? min、4 min、6 min、8 min、10 min后使用稀釋涂布平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并與0 s時(shí)涂布所得到的菌活進(jìn)行比較，得到不同生長環(huán)境中所得到的菌液經(jīng)

24、熱處理后的存活率。 2.2.9 革蘭氏染色法 1．制片 將待檢驗(yàn)的菌制作涂片，待干燥后固定，固定時(shí)通過酒精燈火焰一至二次。 2．染色 （1）初染：將結(jié)晶紫滴加到載玻片上約一分鐘，然后用清水洗凈； （2）媒染：滴加碘液到載玻片上保持覆蓋約一分鐘，用清水洗滌； （3）脫色：將載玻片上面的水清理干凈，使用酒精清洗至流出的酒精不再出現(xiàn)紫色時(shí)為止，之后立即用清水沖洗干凈； （4）復(fù)染：將番紅液覆蓋至載玻片上染一至二分鐘，用清水洗凈； （5）鏡檢：待載玻片干燥后，置于油鏡下觀察。 2.2.9 噴霧干燥 在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的新型微流體噴霧塔（MFJSD）上進(jìn)行噴霧干燥實(shí)驗(yàn)。以30

25、% （w/w）RSM作為保護(hù)性載體，將37 oC MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的菌液與42 oC MRS液體培養(yǎng)得到菌液與42 oC RSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得到的菌進(jìn)行噴霧干燥。其中，進(jìn)口空氣溫度分別控制在82 oC、97 oC、82 oC，出口空氣溫度分別在55 oC、58 oC、61 oC。將得到的粉末稀釋，并在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板，然后置于37 oC恒溫培養(yǎng)48 h，計(jì)算菌活。 2.3 測定方法 2.3.1 稀釋涂布平板法 ①．制備菌液稀釋液：混勻菌液后在無菌環(huán)境下使用移液槍取出菌液0.5 mL，放入裝有4.5 mL滅菌過的蛋白胨溶液小瓶中，混勻，使細(xì)胞分散開，即為稀釋了

26、101的菌液；然后再使用移液槍取出1 mL 101稀釋液，轉(zhuǎn)移到裝有9 mL無菌蛋白胨溶液中，混勻，得到稀釋倍數(shù)為102的稀釋液；重復(fù)此步驟進(jìn)行連續(xù)稀釋，制成稀釋度為104、105、106等濃度的菌液。 ②．涂布平板：取100 μL菌液，在標(biāo)記好稀釋度的無菌MRS固體培養(yǎng)基上使用一次性無菌涂棒進(jìn)行涂板操作。 ③．將完成涂板的培養(yǎng)基置于37 oC恒溫環(huán)境中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。 計(jì)算方法： 1 mL菌液中的菌含量N（cfu/mL） = 菌落數(shù) x 稀釋倍數(shù) x 10 （1） 2.3.2 存活率計(jì)算 細(xì)胞熱處理后存活率（%） = 熱處理后的菌活N / 初始菌活

27、N0 x 100 （2） 第三章 結(jié)果與討論 3.1 革蘭氏染色的結(jié)果 將所用的LGG與LCBL23菌種進(jìn)行革蘭氏染色，將染色后的菌置于光學(xué)顯微鏡下觀察。得到的光學(xué)顯微圖像如圖 1。可以看出，LGG與LCBL23為典型的革蘭氏陽性菌在顯微鏡下呈紫色，同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)出了桿菌的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)過程中LGG與LCBL23均未遭受嚴(yán)重的污染，在顯微鏡下未觀察到雜菌。 a b

28、 圖1 革蘭氏染色圖。（a）鼠李糖乳桿菌（LGG）；（b）干酪乳桿菌（LCBL23）。 3.2 溫度曲線的測定 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，溫度為縱坐標(biāo)繪制溫度曲線。圖 2（a）展現(xiàn)的是鼠李糖乳桿菌LGG在總固體含量為5.2 %的RSM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后取1 mL菌液在60 oC水浴鍋中的進(jìn)行水浴加熱時(shí)的溫度曲線；圖 2（b）展現(xiàn)的是干酪乳桿菌 BL23在總固體含量為5.2 %的RSM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后取1 mL菌液在60 oC水浴鍋中的進(jìn)行水浴加熱時(shí)的溫度曲線。其中LGG菌液達(dá)到

29、60 oC需要141 s，LCBL23達(dá)到60 oC需要148 s，兩種菌液加熱至60 oC的時(shí)間相差不大。 a b 圖 2 熱處理過程中菌液溫度變化曲線。熱處理?xiàng)l件：60 oC，（a）LGG和（b）LCBL23在3.2 % RSM +2%葡萄糖中培養(yǎng)24 h后的菌液1 mL。. 3.3 LGG與LCBL23在RSM培養(yǎng)基中的生長狀況 很多研究者在益生菌的噴霧干燥實(shí)驗(yàn)中選用RSM作為保護(hù)載體[9-10]。為了保證菌種在RSM載體中的存活率，本實(shí)驗(yàn)采用總固體含量

30、為5.2 %（w/w）的RSM液體作為培養(yǎng)基。其中3.2 %的RSM和2 %的葡萄糖為菌種提供了足量的氮源和能量。在RSM培養(yǎng)基中，LGG和LCBL23菌種均可以利用其營養(yǎng)成分發(fā)酵。LGG在RSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后可以得到具有清晰分層現(xiàn)象的奶酪狀固體，其中上半層為澄清液體， 下半層為白色不透明奶酪狀固體。LCBL23在RSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后發(fā)酵產(chǎn)物依然為白色不透明液體，與培養(yǎng)前的無菌RSM培養(yǎng)基具有相似的性狀。LCBL23和LGG在總固體含量為5.2 %RSM培養(yǎng)基中在不同生長條件下培養(yǎng)24 h后所得到的初始菌活如圖 3所示。從圖 3中可知，LCBL23與LGG在總固體含量為5.2

31、%的RSM培養(yǎng)基中初始菌活基本保持在108 cfu/mL，而在20 rpm條件下培養(yǎng)的LCBL23菌種的初始菌活保持在107 cfu/mL。相比較發(fā)現(xiàn)，LGG在總固體含量為5.2 %（w/w）的RSM液體培養(yǎng)基中的初始菌活比LCBL23更高，說明LGG相較于LCBL23有著更好的環(huán)境耐受性。 圖 3.LGG與LCBL23在3.2 % RSM +2%葡萄糖中培養(yǎng)24 h后的初始菌活 3.4 LGG與LCBL23在RSM培養(yǎng)基中不同生長條件下的菌活 將LGG在RSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的菌液收集并進(jìn)行熱處理不同的時(shí)長，然后采用稀

32、釋涂布平板法在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行再生長涂板，并放置在37 oC培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h后取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并按照1 mL中含菌量=菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)x10進(jìn)行菌落計(jì)算，按照相同的步驟處理LCBL23并進(jìn)行計(jì)算。LGG熱處理不同時(shí)長后的菌活如圖 4所示，LCBL23熱處理不同的時(shí)長的菌活如圖 5所示。 從圖中的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，LGG相較于LCBL23有更強(qiáng)的耐受性，在熱處理相同的時(shí)長后，LGG的菌活更高，證明LGG相較于LCBL23耐受性更好。 圖 4. LGG熱處理不同時(shí)長后的菌活 圖 5. LC

33、BL23熱處理不同的時(shí)長的菌活 3.5 LGG與LCBL23在RSM培養(yǎng)基中不同生長條件下的熱處理存活率 將熱處理不同時(shí)間后的LGG于LCBL23得到的菌活按照細(xì)胞熱處理后按照存活率的公式（公式2）進(jìn)行計(jì)算，并將不同的生長環(huán)境下生長的菌的熱處理存活率按熱處理時(shí)間制圖，如圖 6—7所示。從圖中發(fā)現(xiàn)，LCBL23與LGG均在42 oC，20 rpm的條件下獲相較于其他生長條件更高的存活率。我認(rèn)為是有氧條件略微增強(qiáng)了菌種的耐受性，從而提高了熱處理后菌種的存活率，同時(shí)，42 oC相較于最適生長溫度（37 oC）更高，因此更高的生長溫度可能也在一定程度上提高了LGG與LCBL23的耐受性，使得菌

34、種經(jīng)過熱處理后的菌活得到了提高。 圖 6. 不同的生長環(huán)境下LGG的熱處理存活率 圖 7. 不同的生長環(huán)境下LCBL23的熱處理存活率 圖 8.不同生長條件下培養(yǎng)的LGG噴霧干燥后存活率 3.6 噴霧干燥 將37 oC MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的LGG菌液、4

35、2 oC MRS液體培養(yǎng)得到的LGG菌液與42 oC RSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到LGG菌液以30 %的RSM作為載體進(jìn)行噴霧干燥后進(jìn)行再生長涂板得到的菌存活率如圖 8所示?？梢园l(fā)現(xiàn)在在30 %的RSM載體中進(jìn)行噴霧干燥的菌經(jīng)過42 oC生長環(huán)境的存活率明顯高于在37 oC環(huán)境中培養(yǎng)的菌，其中以在RSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌噴霧干燥后存活率最高，高達(dá)216.14 %。由于時(shí)間原因，無法再進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。但從已有的數(shù)據(jù)中可以看出在較為苛刻的生長溫度條件下LGG的耐受性得到了提高，同時(shí)在RSM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的LGG噴霧干燥后存活率極高?？赡苁荝SM中的某些成分具有一定的保護(hù)性或修復(fù)性，也可能是RSM載體中培養(yǎng)

36、的LGG的耐受性得到了更大的提高。 第四章 結(jié)論 本研究采用了一種RSM培養(yǎng)基同時(shí)通過改變不同的生長環(huán)境對LGG和LCBL23菌種進(jìn)行預(yù)處理，以期提高菌種在噴霧干燥后的菌體活性。由于在很多噴霧干燥采取的出口溫度一般為60 oC，故本實(shí)驗(yàn)采用60 oC進(jìn)行熱處理，以期對真實(shí)的噴霧干燥條件進(jìn)行模擬。同時(shí)依據(jù)熱處理后所得到的菌活對LGG和LCBL23用于噴霧干燥的最適生長條件進(jìn)行摸索判斷，希望可以通過改變菌種的生長環(huán)境以提高耐受性，從而提高噴霧干燥后的菌體活性。在后期的噴霧干燥實(shí)驗(yàn)中，我們選用了37 oCM.R.S液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的LGG菌液與42 oCM.R.S液體培養(yǎng)得到的LGG菌液

37、與42 oCRSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到LGG菌液在包埋30 %的RSM載體中進(jìn)行噴霧干燥。結(jié)果表明，在42 oC和20 rpm條件下培養(yǎng)出來的LGG及LCBL23具有相對于其他生長環(huán)境更好的耐受性。同時(shí)在42 oCRSM中培養(yǎng)出的LGG表現(xiàn)出了極高的噴霧干燥存活率。這項(xiàng)工作為益生菌噴霧干燥實(shí)際運(yùn)用的生長條件開發(fā)開辟了新的途徑，可以確保在培養(yǎng)的過程中菌耐受性方面有所提高。這也將讓益生菌粉末更加可持續(xù)更加節(jié)能的生產(chǎn)，因?yàn)閲婌F干燥的能量消耗遠(yuǎn)低于目前使用的冷凍干燥。 參考文獻(xiàn) [1] 吳克剛,柴向華. 食品徽膠囊技術(shù)[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社. 2006 [2] 楊汝德,

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