倫敦大學(xué)帝國學(xué)院igem項(xiàng)目之 學(xué)習(xí)筆記

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1、倫敦大學(xué)帝國學(xué)院igem項(xiàng)目之 學(xué)習(xí)筆記 一：荒漠化 土壤侵蝕和荒漠化是全球范圍內(nèi)的問題。導(dǎo)致耕地的損失，經(jīng)濟(jì)困難和環(huán)境退化。我們的項(xiàng)目側(cè)重于解決這些嚴(yán)重問題的工程菌，以提高植物根系生長。我們正計(jì)劃來實(shí)現(xiàn)我們的細(xì)菌帶入一個種皮，以幫助重新植被的土地侵蝕的風(fēng)險(xiǎn)。樹木和植物有助于保持土壤和防止水土流失，導(dǎo)致荒漠化。 荒漠化是下降的，其中包括干旱，半干旱和亞濕潤干旱地區(qū)的干旱地區(qū)。干旱地區(qū)近40％的地球陸地約兩個億人，其中大部分生活在發(fā)展中國家。旱地土壤維持一個脆弱的生態(tài)系統(tǒng)，適應(yīng)罕見的降水和劇烈的溫度變化。過度開發(fā)旱地種植和原料用途的土壤呈現(xiàn)無益的，強(qiáng)迫遷移的社區(qū)搜索肥沃的土地，離開貧瘠

2、的土地裸露，容易受到侵蝕力。在許多發(fā)展中國家的糧食供給缺乏強(qiáng)制的土地短期收益，以及砍伐森林，耕地不斷培養(yǎng)。 影響：土壤侵蝕影響的氣候和生物多樣性，往往會導(dǎo)致不可逆的荒漠化。羅茨提高土壤的穩(wěn)定性和防止水土流失 。此外，樹木提供掩護(hù)和保護(hù)附近的動物和植物。在容易發(fā)生水土流失的區(qū)域，這是特別重要的，因?yàn)榻涤晖呛币姷?，但是?dāng)它發(fā)生，它往往是非常激烈的，很容易造成表土被沖走。 二：植物路線 趨化性是根據(jù)吸引或排斥的化學(xué)品的細(xì)菌的運(yùn)動。根系分泌多種化合物，大腸桿菌 大腸桿菌不會被吸引到自然。因此，我們設(shè)計(jì)了一種化學(xué)感受器到我們的底盤，可以感知蘋果酸鹽，一個共同的根滲出物中，以便它可以向根游泳。此

3、外，E. 大腸桿菌都在積極采取了由植物的根，這將使成根，我們的系統(tǒng)，有針對性的IAA交付。 主要由細(xì)菌運(yùn)動對植物根系的植物路由模塊。細(xì)菌運(yùn)動的根源，微生物到自己的根。事實(shí)上，細(xì)菌，它們被用來對營養(yǎng)物質(zhì)的植物，在植物的根，是一個新的發(fā)現(xiàn)，去年只當(dāng)Paungfoo Lonhienne等 。非致病性大腸埃希氏菌的吸收到根的擬南芥（豆瓣）和番茄（番茄植物）。他們已經(jīng)成功地復(fù)制了這些調(diào)查結(jié)果。為他們的項(xiàng)目，這是特別有趣的，將暴露于作為植物內(nèi)的根細(xì)胞，這顯著影響的細(xì)菌濃度的IAA需要產(chǎn)生的，以實(shí)現(xiàn)最佳的根生長的細(xì)菌的生長素。此外，植物路線有可能被用來作為一個平臺，提供化合物，自然不會發(fā)生在工廠，

4、沒有基因改造植物本身的根。 （1）細(xì)菌趨 他們的主要底盤，濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)是大腸埃希氏菌。趨化性E. 大腸桿菌是有據(jù)可查的。這些細(xì)菌可以執(zhí)行兩種類型的運(yùn)動，翻滾和光滑游泳。兩者之間的差異被確定由鞭毛運(yùn)動。在翻滾運(yùn)動，鞭毛順時針移動。這是崔泰源-P和FLIM的，一體的鞭毛相關(guān)蛋白之間的復(fù)合物的形成引起的。在平滑游泳，鞭毛逆時針移動。崔泰源未磷酸化，并因此，不能與鞭毛蛋白，導(dǎo)致在相反的方向旋轉(zhuǎn)的鞭毛。 平滑游泳是運(yùn)動，進(jìn)行細(xì)菌對引誘或遠(yuǎn)離劑。平滑游泳是控制趨化蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使一些示范。 圖1：大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)superfolder GFP（sfGFP）的擬南芥根的植物與細(xì)菌培養(yǎng)過

5、夜后利用共聚焦顯微鏡可以看到里面。根在PBS中洗滌，成像前，以避免“假陽性”的根的外側(cè)附著的細(xì)菌。根內(nèi)的細(xì)菌對于一個很酷的3D視頻，看看我們的結(jié)果頁。（數(shù)據(jù)和影像帝國IGEM 2011）。 （2）產(chǎn)品規(guī)格 1。應(yīng)積極邁向根的細(xì)菌。 為了做到這一點(diǎn)，需要的細(xì)菌是能夠感應(yīng)到一個共同的根滲出物。我們選擇了重新布線E. 大腸桿菌的趨化通路朝著L（ - ）的蘋果酸（也簡稱為蘋果酸），檸檬酸循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的化合物。它是由分泌的根在低濃度。 2。根吸收的細(xì)菌進(jìn)入。 吸收細(xì)菌進(jìn)入根，接著所分泌的天然化學(xué)物質(zhì)提出了一個新的平臺，為修改而基因改造植物基因組的植物。 3。在我們的機(jī)箱的外源基因的高效表達(dá)。

6、 由于我們是從土壤細(xì)菌的基因?qū)氲紼. 大腸桿菌我們必須考慮到影響密碼子偏性，可以發(fā)揮我們的結(jié)構(gòu)的表達(dá)。因此，我們必須確保我們的結(jié)構(gòu)并不受這種現(xiàn)象的表達(dá)。 （3）設(shè)計(jì) 目標(biāo)是確保制定的規(guī)格。 1。這種細(xì)菌應(yīng)該感覺到蘋果酸，積極邁向根。 雖然蘋果酸敏感的傳感器不自然地發(fā)生在E. 大腸桿菌，他們已經(jīng)確定了其他一些細(xì)菌的種類，包括土壤中的微生物銅綠假單胞菌 PA01株和惡臭假單胞菌 KT2440株。PA2652是一個敏感的蘋果酸的化學(xué)感受器中發(fā)現(xiàn)P. 銅綠微囊藻和MCP是一種受體，發(fā)現(xiàn)P. 惡臭響應(yīng)一些TCA循環(huán)的中間體，包括蘋果酸的[1] [2] 。銅綠假單胞菌和P.趨化的分子機(jī)制 惡臭

7、不同的大腸桿菌 大腸桿菌。然而，有高度的結(jié)構(gòu)相似性的蛋白質(zhì)，使在這些生物體的趨化性途徑之間。因此，這是合理的假設(shè)，PA2652或MCPS域的將互動與本地的趨化途徑E. 大腸桿菌，細(xì)菌將能夠執(zhí)行引入受體結(jié)合的趨化反應(yīng)后，蘋果酸鹽。 2。他們的底盤中的高效表達(dá)。 他們用他們的密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化PA2652結(jié)構(gòu)（BBa_K515102）表達(dá)的E. 大腸桿菌。 3。構(gòu)建體必須是如模塊化盡可能。 表達(dá)的蘋果酸的化學(xué)感受器的基因結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜。然而，他們是模塊化的。目前的結(jié)構(gòu)，表達(dá)組成型啟動子J23100受。這是的組成啟動的零件注冊表中最強(qiáng)的之一。我們選擇了這個，因?yàn)樗歉菀椎囊粋€結(jié)構(gòu)調(diào)整的表達(dá)，

8、而不是調(diào)整它的啟動子。要表達(dá)的遺傳結(jié)構(gòu)調(diào)整，我們已經(jīng)推出了15個基點(diǎn)絕緣體序列，可以方便的啟動子通過PCR使用的互換性和微調(diào)的表達(dá)水平。確保啟動子替換時不改變的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的TIR（翻譯起始速率）。PA2652和MCP翻譯起始率，分別為42010和44050。 4。根吸收的細(xì)菌進(jìn)入。 根系的吸收都E. 大腸桿菌和面包師的酵母釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中可以觀察到的模式生物擬南芥，并在番茄植株。這是一個自然發(fā)生的過程，（雖然它在土壤中，則仍有待觀察），我們并不需要把額外的基因，我們的設(shè)計(jì)吸收發(fā)生。 （4）模型 1）簡介 趨化性上升趨化因子（如在我們的

9、項(xiàng)目中的蘋果酸）的濃度梯度和遠(yuǎn)離的驅(qū)蟲劑是細(xì)菌的運(yùn)動（例如毒物）。E. 大腸桿菌是太小的，檢測到任何在其兩個端部之間的濃度梯度。這些細(xì)菌周圍的環(huán)境重新取樣，每隔3-4秒，無論是翻滾導(dǎo)致細(xì)胞或運(yùn)行。趨化因子短暫的“翻滾”（或偏見）的概率增加。這之后，由感官的適應(yīng)過程，返回到基線偏置，使細(xì)胞進(jìn)一步的濃度變化來檢測和響應(yīng)。在趨化因子濃度的變化在空間上均勻的環(huán)境中增加一小步的響應(yīng)時間從1秒到2-4秒。改變的飽和水平的趨化可以增加響應(yīng)時間到幾分鐘。 每一個化學(xué)感受器上的細(xì)菌周質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域通信的鞭毛馬達(dá)通過CHEA，崔泰源，和Chez蛋白的磷酸化繼電器順序。趨化通路建模的結(jié)果，將決定

10、的閾值用于細(xì)菌檢測的趨化因子的濃度和飽和細(xì)菌趨化檢測成為在哪一級，降低細(xì)菌的趨化反應(yīng)的效率。 2）模型的趨化途徑 2.1目的 使用MATLAB模型的趨化作用的途徑和8μM化學(xué)感受器，從而確定檢測閾值和飽和度水平的趨化因子的細(xì)菌。因?yàn)樗徽J(rèn)為應(yīng)放置在靠近最佳生長的種子（<0.25厘米[4] ）的生長素。因此，這是至關(guān)重要的，以確定是否我們的細(xì)菌能夠保持密切的種子。 2.2說明 圖1 [1] ：趨化的信令組件和途徑 E. 大腸桿菌。 E.在趨化途徑 圖1表明在大腸桿菌。化學(xué)感受器，形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物與謝和咀嚼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的信號控制鞭毛馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)方向[5] 。的信令組的貨幣是在磷酰（

11、對），它是由的崔泰源和CHEB的效應(yīng)蛋白可通過自身磷酸化CHEA [1]的形式。崔泰源p啟動鞭毛響應(yīng)通過與電機(jī)提升運(yùn)行 [1]的概率相互作用。海布p是一個感覺適應(yīng)電路的一部分，終止運(yùn)動反應(yīng)[1] 。因此，研究海布和崔泰源的甲基化和磷酸化水平的了解一個單細(xì)胞的趨化是很重要的。斯皮羅等人的模型的基礎(chǔ)上。（1997）[1]被用來研究的濃度是如何隨時間變化的趨化通路中的蛋白質(zhì)。 此外，鏈接崔泰源p濃度與運(yùn)動類型的（運(yùn)行與翻滾）的數(shù)量被稱為偏置。它被定義為上運(yùn)行花費(fèi)的時間相對于總的運(yùn)動時間的幾分之一。的相對濃度的崔泰源p的轉(zhuǎn)換成馬達(dá)偏置使用希爾函數(shù)（公式1）。 2.3結(jié)果與討論 基于斯皮羅模型

12、 ，甲基化水平崔泰源和CHEB的受體和磷酸化水平（圖2）進(jìn)行了研究。此外，我們研究的運(yùn)行/干衣決策，這是基于相對受體占用的依賴。這意味著，僅依賴于任何特定的化學(xué)感受器的概率被占用趨化外部concetration的，但不是總數(shù)量的化學(xué)感受器。即使不依賴閾值和飽和度水平的化學(xué)感受上的趨化因子的濃度（圖3） 。不同數(shù)量的受體肯定會允許進(jìn)行更加細(xì)致的適應(yīng)，因此選擇了最強(qiáng)的啟動子為最佳的靈敏度。 圖2（a）：崔泰源圖2的磷酸化水平，（二）：磷酸化的CHEB 圖2（c）：甲基化水平美洲蜚蠊下顎，圖2（d）：在不同的運(yùn)行狀態(tài)的概率中的細(xì)菌在崔泰源p圖2（a）（B）（C）的水平表示的閾值檢測的濃度是10 -

13、8 M，并且飽和濃度為10 -5 M。（建模的基礎(chǔ)上螺等人[1]，代碼進(jìn)行了修改，帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 圖3：與趨化因子濃度的化學(xué)感應(yīng)檢測閾值和飽和度水平。此圖清楚地表明，不依賴閾值和飽和度水平的化學(xué)感受上的趨化因子的濃度。 3）模擬的細(xì)菌人口的趨化 3.1目標(biāo) 趨化實(shí)驗(yàn)和自然條件下的細(xì)菌種群動態(tài)模擬。實(shí)驗(yàn)室條件下的模型將有助于的濕實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)在他們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。該模型的現(xiàn)實(shí)土壤條件會通知我們的項(xiàng)目如何以及在何處，我們可以把我們的細(xì)菌。 在實(shí)驗(yàn)條件下，趨化擴(kuò)散，不斷從源頭上。然而，在現(xiàn)實(shí)的土壤，根產(chǎn)生蘋果酸所有的時間。因此，我們假設(shè)，分布的趨化以外的種子是穩(wěn)定的

14、，與時間無關(guān)的。因此，細(xì)菌群體趨化建模將建成的趨化因子分布與不同的模式。 3.2說明 這部分的造型專注于創(chuàng)建一個模型的細(xì)菌人口趨化運(yùn)動。在趨化，化學(xué)感受器感受到的趨化因子的濃度增加，然后發(fā)送一個信號，即抑制翻滾。同時，變得越來越甲基受體。相反，在趨化因子的濃度減少翻滾頻率增加，并導(dǎo)致受體的去甲基化。翻滾頻率大約為1赫茲時，鞭毛運(yùn)動是公正的，并降低到幾乎為零的細(xì)菌向上移動的趨化梯度[5] 。為了準(zhǔn)確地建立模型，作如下假設(shè)的基礎(chǔ)上文獻(xiàn)： 1）定向運(yùn)動相位期間，平均血流速度在哪些E. 大腸桿菌移動為24.1微米/秒[7] 。鑒于在翻滾階段，是不顯著的速度慢，可以忽略不計(jì)。 2） E. 大

15、腸桿菌通常需要作為其基礎(chǔ)上決定是否集中度有所提高或過去的第二。因此，在我們的模型中的細(xì)菌將能夠比較濃度的趨化因子在t秒，在t-1秒。 3）在我們的模型中，我們忽略了，E. 大腸桿菌不行駛在一條直線上在運(yùn)行過程中，而是采取曲線路徑由于不平等的射擊鞭毛。 4）我們的模型沒有考慮細(xì)菌的生長，或由于法定人數(shù)感應(yīng)到一個小面積的細(xì)菌聚集的傾向。 在此模型中，細(xì)菌應(yīng)該是能夠比較在當(dāng)前時間點(diǎn)的過去的第二處的濃度的趨化因子的濃度。如果濃度的降低（即 T1 -C T2 ≤0），細(xì)菌就會跌倒的頻率為1 Hz。如果增加的濃度（C t1的 -C t2的 > 0），翻滾頻率減小，因此翻滾的概率減小。參考中的式（1

16、0）[6]，我們知道，當(dāng)C t1的 -C t2的 > 0，翻滾隨著chemostatic常數(shù)，細(xì)菌速度，濃度差之間相鄰的時間點(diǎn)和角度之間的指數(shù)函數(shù)的概率的兩個時間點(diǎn)。[8]因此，我們可以凝聚上面的描述，下面的語句： 3.3結(jié)果與討論 3.3.1 Baterial趨化實(shí)驗(yàn)室 在實(shí)驗(yàn)室條件下，趨化因子從源頭上不斷擴(kuò)散，因此，趨化因子隨時間變化的分布格局。的誤差函數(shù)（方程2）在這種情況下，被用來描述的非穩(wěn)定狀態(tài)下的趨化分布。 對于趨化的濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)，用戶界面設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法來驗(yàn)證其可行性。最初，一個實(shí)驗(yàn)的目的是作為放置一定數(shù)量的細(xì)菌的6厘米距離與不同濃度的趨化源。放置100個細(xì)菌

17、的趨化性的模擬的6厘米遠(yuǎn)離5 mM的蘋果酸源示出在下面的電影。而這MATLAB程序具有一個圖形用戶界面（GUI）（圖4），它可用于由濕實(shí)驗(yàn)室學(xué)生簡單的輸入?yún)?shù)和生成靜態(tài)的圖形或動畫。 圖4： MATLAB的圖形用戶界面，（帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 上面的視頻顯示，趨化需要14000秒擴(kuò)散到菌落。在這段時間內(nèi)的細(xì)菌會被復(fù)制到所有的板。因此，從建模，可以推斷，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能無法清楚地表明趨化性（看到的結(jié)果，在我們的濕實(shí)驗(yàn)室）。因此，設(shè)計(jì)了新的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，作為趨化因子被保持在毛細(xì)管和以及與細(xì)菌懸浮液放入;誘食擴(kuò)散入井設(shè)置濃度梯度。細(xì)菌游泳的濃度梯度，給定的時間后進(jìn)入毛細(xì)管，毛

18、細(xì)管被除去，并在毛細(xì)管中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。表明在圖5示出在整個實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。這種新的模式整合，完善我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這進(jìn)一步細(xì)化又是通知的設(shè)計(jì)，我們的分析，這將導(dǎo)致更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，從而創(chuàng)造出精致的植物檢疫路由模塊之間的循環(huán)的建模和濕實(shí)驗(yàn)室。 圖5：演示實(shí)驗(yàn)裝置的毛細(xì)管分析。（圖由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)。） 毛細(xì)管和趨化因子的分布狀況是不同的。因此，兩種趨化因子分布狀況進(jìn)行了推導(dǎo)，推導(dǎo)的詳細(xì)信息，請?jiān)谶@里下載。示出的單核細(xì)胞趨化在阱的分布，在毛細(xì)管內(nèi)的分布方程中所示的等式3和等式4。 同樣地，一個用戶接口的設(shè)計(jì)，使?jié)駥?shí)驗(yàn)室學(xué)生不同的輸入?yún)?shù)（圖6）。以下的視頻顯示

19、的模擬與1000個細(xì)菌，用直徑為1mm的填充用1mM的趨化chemotaxing朝向毛細(xì)管。圖。圖7示出了在每個時間點(diǎn)在毛細(xì)管中的細(xì)菌數(shù)量。該模型表明，在毛細(xì)管中積累的細(xì)菌，是在3600秒的最大數(shù)目。因此，我們的模型表明，的濕實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生應(yīng)執(zhí)行本實(shí)驗(yàn)為60分鐘，然后收集數(shù)據(jù)。 圖6： Matlab的圖形用戶界面，為我們的趨化毛細(xì)管分析。（帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 圖7：細(xì)菌的數(shù)量在毛細(xì)管與時間（帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 3.3.2在土壤中的細(xì)菌趨 在現(xiàn)實(shí)的土壤，蘋果酸鹽用作趨化。馬拉特是不斷從根尖分泌3 mM的[9]的濃度。在這種情況下，蘋果酸源

20、總是補(bǔ)充由于持續(xù)分泌從根和分配方式可以被認(rèn)為是穩(wěn)定的（即與時間無關(guān)）。的穩(wěn)定狀態(tài)Keler的謝格爾模型是用來證明這個分布（公式5）。 真正的蘋果酸在土壤中的分布顯示在圖5。細(xì)菌趨藥性的路徑，當(dāng)將細(xì)菌在穩(wěn)態(tài)蘋果酸分布在不同的位置上時，表明在圖5。 圖8（a）：的蘋果酸鹽的距離（1D），圖8（b）：蘋果酸鹽用半徑（2D）中的分布的分布，圖8（b）示出的位置的閾值檢測的濃度（1e的-8 M的半徑= 0.028 m）和飽和濃度（是1e-5 M的半徑= 0.012）。 圖9：與細(xì)菌的趨化性放置在不同的起始位置。 藍(lán)：210 5秒趨化開始于半徑= 0.015米（之間0.012 m和0.028

21、米的），綠色：210 5秒趨化開始于半徑=0.008米，這是小于0.012。這表明的細(xì)菌的趨化反應(yīng)是低效的，當(dāng)它們被放置在從根尖端0.0028米0.0012米。綠線表示，這種細(xì)菌可保持接近的種子，當(dāng)它被放置在遠(yuǎn)離根尖的距離小于0.012米。因此，該模型表明，這種細(xì)菌被放置在一個距離小于0.012米，在我們的項(xiàng)目實(shí)施。 最后，用于細(xì)菌檢測的閾值的趨化因子的濃度是110 -8 M和細(xì)菌趨化檢測變得飽和水平是110 -5 M。我們還表明，檢測閾值和飽和度水平是趨化因子受體的數(shù)量無關(guān)，然而，為了使最大靈敏度，最強(qiáng)的啟動子應(yīng)該選擇植物路由模塊。此外，與蘋果酸濃度等于3 mM的，閾值檢測的濃度是在從根0

22、.028米的距離，和飽和濃度達(dá)到0.012米（1.2厘米）遠(yuǎn)離根。從建模的細(xì)菌種群的趨化性，我們觀察到根的趨化性是緩慢的，如果該細(xì)菌最初放置在兩者之間0.012 m和0.028米的，同時，放置從根0.012米內(nèi)細(xì)菌時，細(xì)菌很可能穩(wěn)定和保持密切的根。穩(wěn)定的細(xì)菌本地化，（1.2厘米）的距離是大于0.25厘米（營養(yǎng)物質(zhì)可以有效地根的距離），因此，建議的細(xì)菌，我們的種皮的實(shí)施，應(yīng)放置在或接近0.25厘米遠(yuǎn)離根。 二：生長素 （1） 概觀 生長素，或吲哚-3 -乙酸（IAA），是一種植物生長的激素，它是通過幾個土壤細(xì)菌。我們已經(jīng)采取的基因編碼，從假單胞菌savastanoi IAA生產(chǎn)的途徑，并表

23、示他們在大腸埃希氏菌。植物路由模塊對根和吸收趨化之后，IAA表達(dá)，目的是提高土壤的穩(wěn)定性，促進(jìn)根系生長其也被稱為是一個充分研究的負(fù)責(zé)響應(yīng)于生物和非生物脅迫的用于植物生長的植物激素。通常，類似的α-萘乙酸（αNAA）和2,4 - 二氯苯氧乙酸（2,4-D）的合成生長素作為除草劑的使用。在過去的50年來，由于他們的高效率和廉價的成本，他們已經(jīng)在作為除草劑的用途。 雖然生長素是一種促生長的激素，它可以在高濃度下對植物的代謝負(fù)擔(dān)，因此，毒性。合成生長素是非常穩(wěn)定，在土壤中能堅(jiān)持幾個星期，這就是為什么他們是非常有效的除草劑。IAA，在另一方面，是化學(xué)不穩(wěn)定的，并可以很容易地由植物代謝。因此，如果我們在

24、我們的底盤生產(chǎn)IAA，它應(yīng)該促進(jìn)而不是阻礙植物根系的生長。仍然是一種風(fēng)險(xiǎn)，即IAA可以仿照在硅片告知生長素隨心模塊的設(shè)計(jì)，其合成前在高濃度，因此，基因表達(dá)水平的植物是有毒的。我們的目標(biāo)是產(chǎn)生IAA E. 大腸桿菌中以受控的方式，以便它永遠(yuǎn)不會到達(dá)的毒性閾值。在整個項(xiàng)目，該模塊將負(fù)責(zé)影響根系生長，形成復(fù)雜的根網(wǎng)絡(luò)，可以有效地保持土壤，防止其侵蝕的目的。 圖1。的化學(xué)結(jié)構(gòu)，合成的和天然的生長素。（圖片由先正達(dá)提供）。 （2）產(chǎn)品規(guī)格 1。一個簡單的的IAA生產(chǎn)的途徑，可以表現(xiàn)在我們的底盤。 IAA是一種植物激素，促進(jìn)植物生長的細(xì)菌快遞（PGP） IAA的植物對營養(yǎng)物質(zhì)的交換。有幾種不同

25、的途徑可以制作IAA（圖1）。我們決定使用的IAM的途徑，因?yàn)樗驯蛔C明在E.工作 大腸桿菌，并且由的只有兩種酶。 2。片段序列設(shè)計(jì)適合聚合酶延伸組件的方法，以最低的成本。 我們決定用聚合酶延伸，而不是標(biāo)準(zhǔn)限制連接的組件的裝配，因?yàn)樗鼘⑹刮覀兡軌蛴嗁彾鄠€片段的序列。這將保持低于1000 bp的訂單，也降低了生產(chǎn)時間。此外，像吉布森和CPEC的方法，使我們能夠建立包含多個組件的結(jié)構(gòu)，在一個反應(yīng)??，而不是不必結(jié)扎每個BioBrick順序的。 3。實(shí)現(xiàn)足夠的IAA的表達(dá)水平在我們的底盤，在我們的工廠模式，以提高根系的生長。 IAA在我們的底盤表達(dá)的目的是提高植物根系的生長，并最終提高土壤的

26、穩(wěn)定性。因此，我們需要的IAA濃度的影響根系生長模擬和測試，以確定最佳的濃度不引起毒性。 4。調(diào)整的IAA生產(chǎn)水平啟動子不影響RBS強(qiáng)度的情況下切換。 要促進(jìn)未來調(diào)整的表達(dá)，我們在設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)時，蘇格蘭皇家銀行是不會受到影響的發(fā)起人。為了做到這一點(diǎn)，我們增加了15個基點(diǎn)絕緣體它們之間的序列。 5。建立一個結(jié)構(gòu)，密碼子優(yōu)化為E. 大腸桿菌和B?？莶菅挎邨U菌。 我們使用的是E. 大腸桿菌作為我們的機(jī)箱，因?yàn)槿祟悓?shí)踐問題，周圍環(huán)境中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的蔓延。此外，它已被證明，大腸桿菌 大腸桿菌是采取了積極的擬南芥 [2] 。然而，在未來，我們希望有可能建立相同的

27、構(gòu)造B. 枯草芽孢桿菌，一個突出的土壤中的孢子形成的細(xì)菌。 圖1。有幾種不同的IAA的生產(chǎn)途徑。該IAM通路是一個兩步驟的途徑，從前驅(qū)體色氨酸生成吲哚-3 -乙酸（IAA）。IAA色氨酸單加氧酶（IAAM），催化氧化羧化的L-色氨酸為吲哚-3 -乙酰胺水解為吲哚-3 -乙酸和氨的吲哚乙酰胺水解酶（IAAH）[1] 。 （3）設(shè)計(jì) 他們心中的規(guī)格，我們通過文獻(xiàn)搜索和咨詢專家告知我們的IAA表達(dá)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)。 1。該IAM通路是一個簡單的IAA的制造途徑與只有一個中間。 他們選擇，使用IAM（吲哚乙酰胺）的途徑，來源于假單胞菌savastanoi。此途徑只涉及兩種酶產(chǎn)生IAA（iaaM和戰(zhàn)

28、勝饑餓國際聯(lián)盟），因此最大限度地減少碎片的數(shù)量，我們需要在我們的結(jié)構(gòu)組裝。 2。設(shè)計(jì)適合于基于聚合酶延伸組裝的基因序列。 由于他們有兩個比較大的酶（約61 kDa和47 kDa的），他們決定每一個分裂成兩個片段，以加快其合成。他們設(shè)計(jì)了50 bp的重疊區(qū)域的端部的每一個的四個片段，以便能夠快速基于聚合酶延伸的組裝成標(biāo)準(zhǔn)pSB1C3矢量。 3。實(shí)現(xiàn)足夠的IAA的表達(dá)水平在我們的底盤，以提高我們的模式植物的根系生長。 我們將iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟基因的控制下的Pveg2啟動。我們選擇該啟動子，因?yàn)樗枪δ蹺. 大腸桿菌和B?？莶菅挎邨U菌。 4。是絕緣體序列設(shè)計(jì)，使啟動開關(guān)。 為了使

29、調(diào)整的IAA生產(chǎn)，使用不同強(qiáng)度的推動者，我們正在設(shè)計(jì)一個絕緣體序列前面iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟，不影響RBS實(shí)力的情況下啟動開關(guān)，以方便使用PCR的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。 5。聯(lián)合密碼子優(yōu)化E. 大腸桿菌和B?？莶菅挎邨U菌 他們做了一個密碼子優(yōu)化軟件，優(yōu)化兩款機(jī)箱都提供靈活性，在未來的iaaM和戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟序列，盡管我們目前使用的E. 大腸桿菌作為我們的底盤。 （4）模型 1）簡介 足夠的生產(chǎn)能有效地促進(jìn)植物根系生長的植物激素或轉(zhuǎn)基因（GM）大腸埃希氏菌吲哚-3 -乙酸（IAA） 。但是，IAA是對植物有毒的，如果它的濃度過高。因此，重要的是IAA表達(dá)水平能夠預(yù)測一個給定的子，然后調(diào)

30、整子強(qiáng)度，以保證我們的大腸桿菌最佳的IAA 增加根系生長。 IAA增加根系生長，根長和分支數(shù)量方面。為了研究不同濃度的IAA影響根系的生長模式，建模工具，用濕實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，結(jié)合預(yù)測和可視化擬南芥根系生長。 2）IAA合成模擬 2.1目的 一個單一的E.確定IAA表達(dá)水平 大腸桿菌細(xì)胞與IAA啟動子強(qiáng)度4.536 RNA /分鐘/μg的底物DNA，然后預(yù)測要放置在種子涂層，誘導(dǎo)最佳的根生長的細(xì)菌數(shù)量。 2.2說明 遺傳工程的IAA途徑涉及兩個基因，iaaM和IAAH，這兩者都是組成型表達(dá)。IAAM基因編碼色氨酸2 -單加氧酶（T-2-monase），色氨酸（Trp）的吲哚-3

31、 -乙酰胺的催化轉(zhuǎn)換（IAM），然后將其水解以釋放吲哚-3 -乙酸（IAA）由水解酶IAAH [3] 。在同一時間，合成的IAM和IAA將競爭性地抑制色氨酸2 -單加氧酶的酶活性，從 ??而誘導(dǎo)的IAA的表達(dá)上的負(fù)反饋環(huán)路。圖1中示出在該途徑所涉及的酶促反應(yīng)。 圖1：IAA合成途徑。（圖由倫敦帝國學(xué)院的iGEM比賽的隊(duì)）。 此外，從美國科羅拉多大學(xué)的研究進(jìn)行了數(shù)學(xué)生物學(xué)研究組的基礎(chǔ)上[4] ，色氨酸也是負(fù)面的控制內(nèi)的細(xì)菌。因此，色氨酸合成途徑應(yīng)納入上述模型。此外，為了減少的數(shù)目的參數(shù)，如在圖1中的參數(shù)大多數(shù)是不提供給我們，在IAA通路然后分為兩個米氏米氏方程，與色氨酸的途徑和組成型

32、基因表達(dá)的T相結(jié)合的簡化-2-monase和IAAH。整個色氨酸IAA通路模型[5]中描述的公式1 ，和參數(shù)定義在下面的參數(shù)部分。 在這個模型中，我們提出以下假設(shè)： （1）他們忽視了很短的時間延遲，由于TRP-T-2-monase（底物酶（ES）復(fù)雜的），IAM-戰(zhàn)勝饑餓國際聯(lián)盟（ES的復(fù)雜），IAM-T-2-monase（抑制酶的合成（ EI）配合物）和IAA-T-2-monase（抑制劑的酶（EI）絡(luò)合物），并假定這些物種幾乎在瞬間達(dá)到其平衡。 （2）IAA的降解率在黑暗中細(xì)菌的生長速度相比是非常低的。因此，我們使用了細(xì)菌的生長速率，在這個模型中的IAA降解率。 在建模的IAA通路

33、（3），我們發(fā)現(xiàn)，IAA合成的速率確定的物種是（I??AM），而不是酶IAAH，因?yàn)樯a(chǎn)的IAM被抑制本身和IAA。 2.3結(jié)果與討論 1。每個蛋白物種的濃度是如何隨時間變化。 2。各物種的酶促反應(yīng)，與O F = 1.5410 -4 μM，M F = 3.7810 -4 μM，E = 0.378μM，色氨酸= 4.1μM和所有其他= 0的初始濃度的模擬[4]。 此外，圖2示出，IAA的表達(dá)水平為72.35μM，這意味著每個細(xì)菌生產(chǎn)的7.2410 -14微摩爾每細(xì)菌在穩(wěn)定狀態(tài)下與細(xì)菌的體積等于10 -15分米3。從潮濕的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中，我們知道，IAA以促進(jìn)根系生長的最佳濃度為0.1 nm

34、，和擬南芥種子的體積約等于3.610 -9米3 [7] 。因此，需要存在于種皮，以最大限度地提高根根系生長的細(xì)菌數(shù)為4.9710 6。 詳細(xì)的計(jì)算中列出如下： 1。一個單一的細(xì)菌所產(chǎn)生的摩爾數(shù)是72.35微米* 10 -18米3（7.235 * 10 -17微摩爾）。 2。的IAA的摩爾數(shù)，需要在一個種皮是3.6 * 10 -9米3 * 0.1 nmol。 3。細(xì)菌的數(shù)量需要是發(fā)生在一個種皮（3.6 * 10 -10微摩爾）/（7.23510 -17）= 4.9710 6。 圖2（a）：（的IAM）隨時間的演變。圖2（b）：的IAA對時間的演變。 總之，我們獲得的IAA濃度的，I

35、AA DNA結(jié)構(gòu)（72.25μM）產(chǎn)生的。從這個值，我們計(jì)算出的細(xì)菌數(shù)量，將需要輸入理想的生長條件，而忽略死亡和分裂的細(xì)菌，這被認(rèn)為是4.97x10 6 細(xì)菌擬南芥的根目錄下。此值由于在不同的植物種子大小的變化而變化。由于細(xì)菌細(xì)胞可從該植物中丟失，不是所有的細(xì)菌從種皮進(jìn)入工廠，在種皮所需的細(xì)菌的數(shù)目將是高于此。此外，在接下來的部分根系生長模型幫助我們想象的根系生長。 3）IAA的吸收和根系的生長 3.1目標(biāo) 1創(chuàng)建一個圖形程序來演示的擬南芥根系的生長過程，Lindenmayer系統(tǒng)和植物生理學(xué)的原則的基礎(chǔ)上。 2使用Matlab數(shù)據(jù)擬合工具來開發(fā)IAA濃度和增長速度的分行數(shù)目之間的關(guān)系

36、。 3.2說明 我們使用計(jì)算的工具，visulise根系生長的現(xiàn)象，（主要根長，分枝，根系密度等）在不同的enviromental條件下，特別是根序和根長。根為了描述一個根系統(tǒng)的分支“代”，被定義為一個零階根的根不分枝。根系生長取決于環(huán)境因素的影響，比如引力和土壤的非均質(zhì)性。 3.2.1向性 一個根系統(tǒng)啟動的零階根單根的尖端。然后根遠(yuǎn)離植物的莖生長在一個錐形的方式[10] 。 根系生長取決于環(huán)境因素的影響，比如引力和土壤的非均質(zhì)性。因此，兩個更多的變量被定義為描述植物適應(yīng) - 多么強(qiáng)大的根每平方厘米的增長方向的變化 - 一個更大的值表示更偏轉(zhuǎn)的根和更扭曲的根系統(tǒng) - 試驗(yàn)的次數(shù)

37、，其根部，以找到最佳的角度α和β的旋轉(zhuǎn) 的向下運(yùn)動 - N可以是任意實(shí)數(shù)。如果N = 1.5，如果，N可以是1或2的裝置。 圖3：不同的N值和σ的根系統(tǒng)之間的差異。（建模根據(jù)丹尼爾萊特納等人BOKU和代碼的修改，由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 3.2.2 Lindenmayer系統(tǒng)和根系的生長模型 L-系統(tǒng)是一個平行的重寫系統(tǒng)，即一個正式的語法的一個變體，最有名的用于模擬植物發(fā)育過程中的生長，但也能夠模擬各種生物體的形態(tài)，由于兩個主要性能：遞歸和自相似性[11] 。植物模型和自然的有機(jī)形態(tài)很容易定義，如通過增加遞歸級別的形式慢慢“長大”，并變得更加復(fù)雜。 使

38、用L-系統(tǒng)，用于產(chǎn)生圖形圖像的要求，在模型中的符號是指在計(jì)算機(jī)屏幕上的圖的元素。解釋每不變的L-系統(tǒng)模型的龜命令。 3.2.3根系生長; 造型的IAA攝取的預(yù)測答案的問題，如： “什么是初生根的生長率是多少？” “什么是根系統(tǒng)一段時間后的樣子嗎？” “如何擬南芥不同IAA濃度？“ 我們修改一個MATLAB程序開發(fā)丹尼爾萊特納的研究小組[6]展示的3D根系統(tǒng)的基礎(chǔ)上的原則林登梅耶系統(tǒng)（龜?shù)拿睿?，并在根增長模型工具箱由丹尼爾萊特納等人從BOKU（Universitt獻(xiàn)給Bodenkultur維也納開發(fā)維也納的自然資源和生命科學(xué)大學(xué)）[12] 。 3.2.4數(shù)據(jù)擬合 我們采取

39、了從文獻(xiàn)的增長速度參數(shù)，我們的濕實(shí)驗(yàn)室的原始數(shù)據(jù)，為我們的項(xiàng)目提供更準(zhǔn)確，更合適的參數(shù)進(jìn)行了分析。擬南芥植物種植和根的長度和數(shù)量的分支記錄每兩天從第0天到第9天。根長，每天根系生長速率和分支數(shù)量繪制了時間和IAA濃度。 3.3結(jié)果與討論 3.3.1根系統(tǒng)的可視化 從文獻(xiàn)中的值給外部IAA濃度之間的關(guān)系，和根的伸長為510 -5 mol / L的→200μm的伸長率在30分鐘內(nèi)。因此，生長速度的建模參數(shù)是9.6 * 10 -3 m /天。 我們觀察到真正的根的生長模式和修改我們的模擬，以提供更可靠，更準(zhǔn)確的預(yù)測根的生長。擬南芥中有一個主根與零階和它厚比分行。擬南芥一般長到20-30厘米

40、的深度內(nèi)的土壤和分支只有一次。如下所示的3D畫面預(yù)測的根的生長具有不同伸長率（與IAA = 0.96厘米/天;未經(jīng)IAA = 0.46厘米/天[10] ）。它們可與一個真正的根系統(tǒng)的照片。 圖4：擬南芥根系統(tǒng)的3D visalisation。的曲線圖圖4（a）（b）表示不同IAA濃度作為我們的模擬結(jié)果中的生長時間為20天的條件下與的擬南芥根系統(tǒng)中示范。圖4（c）（d）是真正的擬南芥植物的文獻(xiàn)和我們的濕實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際照片。（建模根據(jù)丹尼爾萊特納等人BOKU和代碼的修改，由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 （4）裝配 圖。1：大會戰(zhàn)略為我們的生長素隨心結(jié)構(gòu)。（圖由倫敦帝國

41、學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 我們下令iaaM和IAAH作為兩個片段的編碼序列，以減少成本和時間（片段1，2，3和4）。我們不希望使用PCR擴(kuò)增的片段，以避免引入到我們的最終構(gòu)建的突變，因此我們將我們的MlyI限制性內(nèi)切酶的合成序列兩側(cè)的鈍的一端切點(diǎn)。說穿了，Mly1（II型限制性內(nèi)切酶）削減5個堿基的識別位點(diǎn)距離。此屬性允許我們只切出各片段的編碼序列。每一個消化的片段，然后凝膠提取準(zhǔn)備組裝。 pSB1C3載體的骨架載體的同時反PCRd放大所需的重疊。 我們計(jì)劃相結(jié)合的四個片段到pSB1C3載體由吉布森裝配，不幸的是，我們的嘗試都失敗了，我們推測，這是由于骨架載體上的同源性，

42、使其重新退火。 我們恢復(fù)到CPEC組裝結(jié)構(gòu)，一種方法，需要更廣泛地使用PCR比吉布森。這就是說，通過引入MlyI的酶切位點(diǎn)，我們的人數(shù)減少一半所需要的PCR步驟，從而減少了潛在的突變率。 循環(huán)聚合酶延伸克?。–PEC）是一個獨(dú)立的引物PCR裝配技術(shù)，它依賴于各部分之間的重疊序列進(jìn)行組裝。有了一個變性步驟中，雙鏈DNA的熔融，允許兼容的單鏈的兩端各部分加入。出于這個原因，它是必不可少的，該部件被設(shè)計(jì)為同源的端部（被設(shè)計(jì)我們所使用的片段用50 bp的重疊）。退火后的重疊端，然后作為引物，聚合酶延伸的部分加入到一個無縫的構(gòu)造。 CPEC的第一次嘗試是成功的。DNA由E. 大腸桿菌 DH5α中菌

43、落的組裝構(gòu)造轉(zhuǎn)化miniprepped并發(fā)送到歐陸用于測序。序列進(jìn)行了驗(yàn)證，所以我們進(jìn)行特征IAA生產(chǎn)建設(shè)。 圖。2：組裝結(jié)構(gòu)限制切割骨干前綴和后綴分別用EcoRI和PstI消化，使我們能夠確定如果插入是正確的大小。1巷包含1 KB +梯作為參考。泳道2，泳道3 PstI和第4泳道都用EcoRI消化。將得到的帶的大小是約4 kb的與組裝的四個片段的大小。（數(shù)據(jù)由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 圖。3：甲最終生長素隨心構(gòu)造示意圖。點(diǎn)擊每個部分被定向到零件注冊表的相關(guān)頁面。（圖由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 三：基因衛(wèi)士 遏制是一個嚴(yán)重的問題，關(guān)于釋放

44、到環(huán)境中的轉(zhuǎn)基因生物（轉(zhuǎn)基因生物）。為了防止基因水平轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)我們的底盤，我們已經(jīng)開發(fā)出一種系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，編碼holin，反holin和溶素的基因。我們是工程的抗holin到我們的底盤，在那里它的作用作為抗毒素，和holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的質(zhì)粒DNA上的基因組中。在與土壤細(xì)菌的水平基因轉(zhuǎn)移事件，holin和細(xì)胞內(nèi)溶素將不含抗holin轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞非可行的和有效含有生長素Xpress和植物路線基因在我們的機(jī)箱的。 （1）概觀 對于人類實(shí)踐告訴我們項(xiàng)目的設(shè)計(jì)，我們決定拿出新的解決方案，以轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境釋放的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。我們試圖想超越遏制“殺死開關(guān)”機(jī)制，并提出了這樣的問題：“什么最壞

45、的情況下，如果我們要釋放我們到野外的轉(zhuǎn)基因？“ 和“如何避免這些問題呢？”。 轉(zhuǎn)基因生物釋放的最棘手的后果之一是水平基因轉(zhuǎn)移的非天然質(zhì)粒DNA，以現(xiàn)有的土壤細(xì)菌，經(jīng)常發(fā)生的過程。 基因Guard是一種新的機(jī)制，以防止轉(zhuǎn)基因生物的遺傳物質(zhì)的交流，以防止自然發(fā)生的微生物基因的水平轉(zhuǎn)移，因此一個可行的解決方案。它將使用一個毒素/抗毒素系統(tǒng)，其中反holin被整合到基因組中，我們的機(jī)箱中，將防止holin上的質(zhì)粒編碼的內(nèi)溶素，以裂解細(xì)胞。然而，如果該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到任何其他細(xì)菌的物種，是不是我們改造細(xì)菌，它會引起細(xì)胞裂解，從而防止包含在我們的GMO的遺傳信息的傳播。 該模塊的組裝和測試的同時，我們嘗

46、試與土壤中的細(xì)菌，看到多久，他們保留了GFP表達(dá)E.獲得的熒光 通過水平基因轉(zhuǎn)移的大腸桿菌。 對于我們?nèi)祟悓?shí)踐的方法對轉(zhuǎn)基因釋放的更多信息 （2）產(chǎn)品規(guī)格 1。防止任何其他細(xì)胞，是不是我們自己的GMO非可行的水平基因轉(zhuǎn)移 水平基因轉(zhuǎn)移（圖1）是主要的問題，我們能想到的，當(dāng)它來釋放轉(zhuǎn)基因生物在現(xiàn)場測試，后來在項(xiàng)目的實(shí)施階段。這是一個共同的問題，即使在轉(zhuǎn)基因作物，轉(zhuǎn)基因生物和自然生物之間的異花授粉是恒定的憂慮。在細(xì)菌中，基因通常轉(zhuǎn)移到其他物種通過共軛或通過從溶解的轉(zhuǎn)基因生物的遺傳物質(zhì)的攝取。由于遺傳物質(zhì)仍然可以采取其他物種的裂解后我們的轉(zhuǎn)基因生物，其中一個使用一個輸入誘導(dǎo)裂解是一個傳統(tǒng)的殺

47、開關(guān)不是一個可行的和安全的選項(xiàng)。因此，我們認(rèn)為，設(shè)備必須是內(nèi)的遺傳物質(zhì)本身，而不是自然產(chǎn)生的細(xì)菌引起的反應(yīng)。 展望殺死在過去已經(jīng)使用的開關(guān)，我們發(fā)現(xiàn)的T4 holin-溶素系統(tǒng)。如果我們要添加這些基因的質(zhì)粒，我們可能引起的任何有機(jī)體，我們已經(jīng)采取了質(zhì)粒的直接裂解。 圖1。水平基因轉(zhuǎn)移（格雷斯金，2006年[1] ） 2。該模塊必須不受到傷害的我們自己的轉(zhuǎn)基因 T4噬菌體必須能夠延緩其主機(jī)之前，它是可以復(fù)制和裝配的許多副本本身的裂解。為了做到這一點(diǎn)也有T4噬菌體的蛋白質(zhì)稱為抗holin結(jié)合從而防止細(xì)胞裂解的holin。本質(zhì)上，該系統(tǒng)的工作原理作為定時器給噬菌體足夠的時間來復(fù)制。

48、 通過使用反holin的從這個系統(tǒng)中，我們可以防止我們自己的細(xì)胞裂解。然而，我們不能有它的質(zhì)粒否則仍可能有兩個質(zhì)粒的有機(jī)體的可能性。因此，我們必須錨定的基因組內(nèi)。為了做到這一點(diǎn)，我們需要用CRIM質(zhì)粒。CRIM（復(fù)制的條件，整合和模塊化）質(zhì)?？梢约稍趩我坏母北镜交蚪M的E. 大腸桿菌。 3。表達(dá)的設(shè)備不會有太大的代謝負(fù)擔(dān) 由于我們的最終系統(tǒng)將使用植物路線和生長素隨心模塊的，我們必須考慮，修改后的細(xì)菌就已經(jīng)是下一個巨大的代謝負(fù)擔(dān)。因此，使用必要的最低限度的資源基因警衛(wèi)促進(jìn)趨化對蘋果酸和IAA生產(chǎn)由我們的系統(tǒng)將是有益的。 4。必須能夠來測試系統(tǒng)是否 要做到這一點(diǎn)，我們必須使用報(bào)告基因。

49、最常見的報(bào)告基因的熒光蛋白RFP和GFP等。由于質(zhì)粒CRIM，已經(jīng)有sfGFP，我們將使用，測試表達(dá)反holin。為了測試是否該質(zhì)粒是功能，我們將結(jié)合RFP到質(zhì)粒。我們希望能夠看到一個天然的細(xì)菌質(zhì)粒熒光紅色寬視場顯微鏡前裂解。 （3）設(shè)計(jì) 目標(biāo)是確保制定的規(guī)格，被認(rèn)為是基因衛(wèi)隊(duì)的設(shè)計(jì)。 1。防止任何其他細(xì)胞，是不是我們自己的GMO非可行的水平基因轉(zhuǎn)移 T4細(xì)胞內(nèi)溶素和T4 holin的是反PCRd從BBa_K112808。然而，我們必須確保接收這些基因的細(xì)胞裂解。為了確定所使用的啟動，我們模擬整個系統(tǒng)。既然有這么多的holin和溶素（高拷貝質(zhì)粒）等少數(shù)幾個副本的holin基因（基因組）

50、的副本，我們決定J23103子相對于J23100子，我們可以選擇正確的強(qiáng)度。但是，我們也有這個弱的啟動子型號是否有足夠的接收質(zhì)粒的細(xì)胞裂解。根據(jù)我們的模型，任何接收我們的holin的和溶素基因的細(xì)胞裂解。 2。該模塊必須不受到傷害的我們自己的轉(zhuǎn)基因 此模塊主要依賴于模型在設(shè)計(jì)過程中。我們必須考慮到一個事實(shí)，即質(zhì)粒的拷貝數(shù)和基因組中的拷貝數(shù)是可變的設(shè)計(jì)時，毒素和抗毒素成分。我們發(fā)現(xiàn)，該啟動子的holin-細(xì)胞內(nèi)溶素的質(zhì)粒具有弱于的holin構(gòu)建體中的基因組是有效的是40-400倍。該比率應(yīng)采取考慮到的基因的拷貝數(shù)之間的可變性，并確保不存在的至少一個為每一個反holin分子產(chǎn)生holin分子。

51、 可以肯定的是，我們修改后的細(xì)菌會存活holin的和溶素的生產(chǎn)，我們選擇了J23103的啟動子具有一定的實(shí)力在低端的啟動子強(qiáng)度范圍。這提供了以下兩種結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)： 3。表達(dá)的設(shè)備不會有太大的代謝負(fù)擔(dān) 雖然這個規(guī)范是非常重要的，它沒有在這個版本的模塊的設(shè)計(jì)中發(fā)揮了巨大的作用。這是因?yàn)?，就目前而言，生長素是一種概念證明系統(tǒng)。一旦它已經(jīng)表明，基因Guard是一個可行的遏制方法，我們將修改的構(gòu)造，以實(shí)現(xiàn)具有抗holin滅活holin，而不是對細(xì)胞是一個很大的負(fù)擔(dān)之間的理想平衡。 4。能夠測試系統(tǒng)的工作原理 為了做到這一點(diǎn)，我們決定附加RFP作為holin根據(jù)相同的啟動子和細(xì)胞內(nèi)溶素的基因的編碼

52、序列。這將使我們能夠輕松，直觀的測試細(xì)胞是否包含我們的質(zhì)粒。至于holin構(gòu)建體，CRIM質(zhì)粒已經(jīng)包含一個sfGFP的序列。 將能夠區(qū)分我們完成的構(gòu)建從每一個其他的細(xì)胞，由于其卡那霉素和氨芐青霉素抗性，以及其生產(chǎn)的RFP和sfGFP。因此，我們將能夠看到我們的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到一個單元格不發(fā)出綠色熒光，應(yīng)該是能夠跟蹤是否溶解或下寬視場顯微鏡。 （4）模型 1）簡介 基因防護(hù)裝置包括三種蛋白質(zhì)： 1。 Holin是一種蛋白質(zhì)，形成孔隙的配合物在細(xì)菌內(nèi)膜和這些孔允許細(xì)胞內(nèi)溶素進(jìn)入的周質(zhì)空間。 2 溶素是一種酶，能分解細(xì)胞壁和誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。 3。 反holin結(jié)合holin并阻止它的形成毛孔。

53、 我們的系統(tǒng)將holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的基因一起的草本-路由和生長素隨心基因的質(zhì)粒上，和反holin基因的強(qiáng)啟動子的控制下的基因組上。該生產(chǎn)的抗holin的會阻止細(xì)胞裂解的轉(zhuǎn)基因（GM）細(xì)菌通過停用holin。如果該質(zhì)粒不含抗holin它的基因組（例如任何野生型土壤細(xì)菌）轉(zhuǎn)移到一個不同的細(xì)菌，holin和細(xì)胞內(nèi)溶素的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。這將防止擴(kuò)散的生長素載體，含有植物的路線和生長素隨心基因，自然產(chǎn)生的土壤細(xì)菌。 2）目標(biāo) 此設(shè)備的成功的關(guān)鍵是正確的比例，這樣的反holin的，可以關(guān)閉所有holin，我們修改后的細(xì)菌中產(chǎn)生的，并holin的表達(dá)水平野生型細(xì)菌的holin和反holin的生產(chǎn)是

54、高到足以誘導(dǎo)細(xì)胞溶解?？刂苹虮磉_(dá)的啟動子強(qiáng)度和核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的實(shí)力，造型的基因警衛(wèi)，重要的是要幫助我們選擇適當(dāng)強(qiáng)度的一個子和蘇格蘭皇家銀行的。 3）說明 基因衛(wèi)兵的建模由兩部分組成，一個是在野生型細(xì)菌的holin生產(chǎn)和其他抗holin holin的失活在我們的改性的細(xì)菌。因?yàn)樵谖覀兊南到y(tǒng)中的所有的基因組成型表達(dá)，我們只考慮穩(wěn)定狀態(tài)。 在野生型土壤細(xì)菌的Holin生產(chǎn) 導(dǎo)出一個單一的質(zhì)粒的啟動子強(qiáng)度之間的關(guān)系，和RBS強(qiáng)度holin集中在這部分的造型。為了模擬這種情況，作如下假設(shè)： 1）基因衛(wèi)隊(duì)包含在一個pSB1C3質(zhì)粒含有pUC19中衍生的促進(jìn)pMB1復(fù)制起點(diǎn)（100-3

55、00分子每單元）[5] 。在細(xì)菌中的質(zhì)粒的數(shù)量范圍從100到300每個細(xì)胞。為了確保子和蘇格蘭皇家銀行是足夠強(qiáng)大的的holin /溶素是有效的，我們低估了質(zhì)粒的土壤細(xì)菌為50，盡管他們總是至少有100。因此，我們的系統(tǒng)時，應(yīng)該工作的質(zhì)粒在土壤細(xì)菌的數(shù)目是大于50。 2）該文獻(xiàn)表明，發(fā)生細(xì)胞溶解在holin等于1000個分子/細(xì)胞的濃度[1]，[5]，[6] ，因此，我們用這樣的細(xì)胞裂解在我們的系統(tǒng)中的閾值濃度。 3）由于所使用的結(jié)構(gòu)表征Pveg子去年包含一個突變中，我們假設(shè)， 我們用于抗holin的啟動，Pveg2具有相同的強(qiáng)度，Pveg。 基于這些假設(shè)，野生型細(xì)菌細(xì)胞裂解的動力學(xué)模型，

56、用普通的微分方程（ODEs）的holin表達(dá)和holin的蛋白質(zhì)（公式1）。在穩(wěn)定狀態(tài)（即 [表達(dá)holin ] / DT = 0和d [holin] / DT = 0），重新整理式（1）[holin] = 1000，我們獲得了表達(dá)在所示為P holin K表holin的公式2。 Holin抑制基因細(xì)菌 在我們的細(xì)菌的基因組上的強(qiáng)度的啟動子和RBS控制表達(dá)的反holin應(yīng)該高于與holin一個單一的質(zhì)粒，例如，300的質(zhì)粒的拷貝（最大拷貝數(shù)在一個單一的細(xì)菌所產(chǎn)生的所有的holin ）可以被抑制。在我們的系統(tǒng)中，抗-holin到holin結(jié)合形成二聚體，它被定義為失活的holin。由式（

57、3）的機(jī)制，我們修改后的細(xì)菌。我們定義的啟動子和RBS強(qiáng)度的比率分別為抗-holin和holin為“m”，如公式4中看到。 4）結(jié)果與討論 通過改變比m的公式4中，我們發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因細(xì)菌holin濃度下降至零比米≥300（參見圖1）。然后，我們測試了米= 400與反holin啟動子（J23100），我們有與強(qiáng)度13.1皮克核糖核酸/分鐘/μg的底物DNA，其結(jié)果是顯 ??示在圖2中。 圖1：在轉(zhuǎn)基因細(xì)菌holin濃度與比m（米=（P 的抗holin ? 抗holin）/（P holin ? holin））。本圖顯示了細(xì)胞內(nèi)的濃度holin保持在零，如果m> 300。（模型由英國倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)）。 圖2：在m = 400的不同蛋白物種隨時間的演變。所有的holin蛋白在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的抑制的holin濃度保持在所有的時間，而holin野生型細(xì)菌的濃度達(dá)到1000每單元后5000秒的模型由倫敦帝國學(xué)院2011年iGEM比賽的球隊(duì)。 總之，基因后衛(wèi)的造型告訴他們，啟動子的強(qiáng)度和RBS holin和反holin的強(qiáng)度可任意選擇，只要他們的比率（即 P的反holin K表抗holin）/（holin K表holin的） > 300），以使其一定，的比例值400被選擇為我們的項(xiàng)目。