細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)

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1、附件9 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) Bacterial Reverse Mutati on Assay 1范圍 本規(guī)范確定了細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)的基本原則、要求和方 法。 本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。 2定義 2.1 回復(fù)突變 reverse mutation 細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型 (prototroph)。 2.2 基因突變 gene mutation 在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞 DNA中堿基對的排列順序發(fā)生 變化。 2.3 堿基置換突變 base substitution mutation 引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。 堿

2、基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。 轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌 呤被另一嘌呤所代替。 顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌 呤被另一嘧啶所代替 2.4 移碼突變 frameshift mutation 引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。 2.5 纟田菌回復(fù)突變試驗(yàn) bacterial reverse mutation assay 利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測定引起細(xì)菌 堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型 —原養(yǎng) 型回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。 2.6 S9 經(jīng)多

3、氯聯(lián)苯（PCB混合物）或苯巴比妥鈉和 爐萘黃酮結(jié)合誘 導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在 9000g下離心10min后的肝勻漿上清 液。 3原理 鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸， 故 在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上， 僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長； 大腸桿菌色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸， 故在缺乏色 氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長。 假如有致突 變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生 長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。 某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變， 故需加入 經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的 S9混合液。 4儀器和設(shè)備 培養(yǎng)

4、箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱 烤箱、低溫冰箱（—80 C ）或液氮生物容器、普通冰箱、天平 （精密度0.1g和O.OOOIg）、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器、 低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿、生物安全柜等。 5培養(yǎng)基和試劑 5.1 0.5mmol/L 組氨酸一0.5mmol/L 色氨酸一0.5mmol/L 生物 素溶液 成分: L-組氨酸（MW155 ） 78mg D-生物素（MW244 ） 122mg L-色氨酸（MW204 ） 102mg 加蒸餾水/去離子水至 1000mL 配制： 將上述成分加熱，以溶解生物素，然

5、后在 0.068MPa 下 高壓滅菌20min。貯于4 C冰箱。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則 不添加色氨酸。 5.2頂層瓊脂培養(yǎng)基 成分：瓊脂粉 1.2g 氯化鈉 1.0g 加蒸餾水/去離子水至 200mL 配制：上述成分混合后，于 0.103MPa下高壓滅菌30min。 實(shí)驗(yàn)時，加入 0.5mmol/L組氨酸一0.5mmol/L色氨酸一0.5mmol/L 生物素溶液20mL。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨 酸。 5.3 Vogel-Bonner（V-B）培養(yǎng)基 E 100g 成分： 枸櫞酸26出07出0） 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 500g 磷酸氫銨鈉（NaN

6、HqHPOq 4出0） I75g 硫酸鎂（MgSO4 7H2O） log 加蒸餾水/去離子水至 1000mL 配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩 緩倒入容量瓶中，加蒸餾水 /去離子水至1000mL。于0.103MPa 下高壓滅菌30min。儲于4C冰箱。 5.4 20%葡萄糖溶液 成分： 葡萄糖 200g 加蒸餾水/去離子水至 1000mL 配制：加少量蒸餾水/去離子水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水 / 去離子水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4C 冰箱。 5.5底層瓊脂培養(yǎng)基 成分： 瓊脂粉 7.5g 蒸餾水/去離子水

7、 480mL V-B培養(yǎng)基E 10mL 20%葡萄糖溶液 10mL 配制： 首先將前兩種成分于 0.103MPa下咼壓火菌 30min 后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿 25mL 制 備平板，冷凝固化后倒置于 37 C培養(yǎng)箱中24h,備用 5.6營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 成分： 牛肉膏 2.5g 胰胨 5.0g 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g 加蒸餾水/去離子水至 500mL 配制：將上述成分混合后，于 0.103MPa下高壓火菌 30min。儲于4C冰箱。 5.7 鹽溶液(1.65mol/L KCI+0.4m

8、ol/L MgCI 2) 成分：氯化鉀(KCl) 61.5g 氯化鎂(MgCl 2 6H2O) 40.7g 加蒸餾水/去離子水至 500mL 配制：在水中溶解上述成分后，于 0.103MPa下咼壓火菌 30min。儲于4C冰箱。 5.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4) 成分： 磷酸二氫鈉(NaH2PO4 2H2O) 2.965g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4 12H2O) 29.015g 加蒸餾水/去離子水至 500mL 配制：溶解上述成分后，于 0.103MPa 下 F咼壓火菌30min。 儲于4C冰箱。 5.9 S9混合液

9、 成分： 每毫升S9混合液 肝S9 鹽溶液 100 pl 20 pl 滅菌蒸餾水/去離子水 380 pl 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500 p 輔酶 ll(NADP) 4 pmol 6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5 pmol 配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重， 然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝 S9加到已有緩沖液 的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配， 并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié) 束，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。 5.10菌株鑒定用和特殊用途試劑 5.10.1組氨酸-色氨酸-生物素平板 成分：瓊脂粉 15g 蒸餾水/去離子水 934m

10、L (V-B)培養(yǎng)基 E 20mL 20%葡萄糖 20mL 滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL 滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) lOmL 滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL 配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌 20%葡萄糖，V-B培養(yǎng) 基、組氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中(若試驗(yàn)中不使用大腸 桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水 /去離子水改為 944mL )。 待溶液稍微冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。 5.10.2氨芐青霉素平板和氨芐青霉素 /四環(huán)素平板 成分：瓊脂粉 15g 蒸餾水/去離子水 930mL (V-B)鹽溶液 2

11、0mL 20%葡萄糖 20mL 滅菌鹽酸組氨酸溶液(0.5g/100mL ) lOmL 滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) i0mL 滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL 氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/L 3.15mL NaOH 中) 四環(huán)素溶液(8mg/mL 于 0.02mol/L HCl 0.25mL 中) 配制：瓊脂和水高壓滅菌 20min，將無菌的葡萄糖、VB鹽 溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中， 混勻 (若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水 /去 離子水改為加 940mL )。冷卻至大約50 C,無菌條

12、件下加入四 環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。 應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。 5.10.3營養(yǎng)瓊脂平板 成分：瓊脂粉 7.5g 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 500mL 配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。 6試驗(yàn)菌株及其生物學(xué)特性鑒定 6.1試驗(yàn)菌株 采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合： 鼠傷寒沙門氏菌TA1535; 鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537 ; 鼠傷寒沙門氏菌TA98 ; 鼠傷寒沙門氏菌TA100 ; 鼠傷寒沙門氏菌 TA102或大腸桿菌 WP2 uvrA或大腸桿菌 WP2uvrA（ pKM101）; 6.2生物學(xué)特性鑒定 新獲得

13、的或長期保存的菌種，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生 物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表 1所示 表1試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn) 組氨 酸缺 陷 色氨 酸缺 陷 脂多 氨芐 自發(fā)回變菌落參考數(shù) 菌株 糖屏 障缺 損 青霉 素抗 性 切除修復(fù) 缺損 四環(huán)素 抗性 Ames實(shí)驗(yàn)室 Zeiger實(shí)驗(yàn)室 TA97 + / + + + - 90?180* 75?200* TA97a + / + + + - 90?180* 75?200* TA98 + / + + + - 30~50 20~50 TA100 + /

14、 + + + - 100~200 75~200 TA102 + / + + - + 240?320* 100~400* TA1535 + / + - + - 10~35 5~20 TA1537 + / + - + - 3~15 5~20 WP2 uvrA / + / - + - / 5~20 WP2 uvrA （pKM101） / + / + + - / 100~200 注 “ +表 示需要 組氨酸 “ +表 示需要 色氨酸 “ +表 示具有 ■fa突變 “ +表 示具

15、有 R因子 +表示對于 鼠傷寒沙門 氏菌具有 △uvr B 突 變，對于大 腸桿菌，具 +表示 具有 pAQ1 質(zhì) 粒 *在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌 落數(shù)略增。 對于各菌的自發(fā)回變范圍，各個實(shí) 驗(yàn)至在參考其他頭驗(yàn)至數(shù)據(jù)的基礎(chǔ) 上應(yīng)建立自己的歷史對照數(shù)據(jù)庫， 形成適合本實(shí)驗(yàn)室條件的適用范 有Z\uvrA突 變 圍。同時，實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與 文獻(xiàn)報道相符。 6.2.1組氨酸缺陷/色氨酸缺陷 原理：組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成組氨酸，只能 在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上， 則不能生長。 色氨酸缺陷試驗(yàn)菌株本身不能合成

16、色氨酸，只能在補(bǔ)充色 氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生 長。 鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸或者色氨酸 培養(yǎng)基平板和無組氨酸或者色氨酸平板上劃線，于 37 C下培養(yǎng) 24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長， 而在 無組氨酸平板上則不能生長；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平 板上生長，而在無色氨酸平板上則不能生長。 6.2.2脂多糖屏障缺損 原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障 缺損，因此一些大分子物質(zhì) ，如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從 而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。 鑒定方法：吸取待測菌株增菌液

17、0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上 劃線，然后將浸濕的 0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放 置。37 C下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌 帶，說明該待測菌株具有rfa突變。 623氨芐青霉素抗性 原理：含 R因子的試驗(yàn)菌株對氨芐青霉素有抗性。因?yàn)?R 因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與 否。 鑒定方法：吸取待測菌株增菌液 0.1mL，在氨芐青霉素平 板上劃線，37C下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長， 說明該測 試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含 R因子，否則，表示測試 菌不含R

18、因子或R因子丟失。 6.2.4紫外線敏感性 原理：具有△uvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，當(dāng)受到紫 外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則 能照常生長。 鑒定方法：吸取待測菌株增菌液 0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上 劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（ 15W，距離 33cm） 8秒鐘。置37C下孵育24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：具有 AuvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻 射后細(xì)菌不生長，而具有完整地切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常 生長。 6.2.5四環(huán)素抗性 原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。 鑒定方法：吸取待測菌株增菌液 O.ImL于氨芐青霉

19、素/四環(huán) 素平板上劃線，置 37C下孵育24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素 /四環(huán)素平板上生 長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有 pAQI質(zhì)粒，否則，說明測試菌株不含 pAQI質(zhì)粒。 626自發(fā)回變 原理：每種試驗(yàn)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱 為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗(yàn)菌株的一項(xiàng)特性。 鑒定方法：將待測菌株增菌液 O.ImL加到2mL含組氨酸-色 氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)（若試驗(yàn)中不使用大腸 桿菌，則不添加色氨酸），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待 瓊脂固化后，置 37C培養(yǎng)箱中孵育48— 72h后記數(shù)每皿回變菌

20、 落數(shù)。 結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表 1 要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下 的略高。 6.2.7回變特性-診斷性試驗(yàn) 原理：每種試驗(yàn)菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及 S9混合液的效應(yīng)不一。 鑒定方法：按照平板摻入試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。將受試物 換成診斷性誘變劑。 結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對某些診斷性誘變劑特有的回變結(jié)果 參見表2 表2測試菌株的回變性 誘變劑 劑量 （回皿） S9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 TA153 7 WP2vrA WP2uvrA (pKM101 ) 柔毛霉

21、素 6.0 - 124 3123 47 592 / / / / 疊氮化鈉 1.5 - 76 3 3000 188 320(0.5 g) i / / / CR-191 1.0 - 1640 63 185 0 / / / / 鏈霉黑素 以工7^八、、■習(xí)、 0.25 - inh inh inh 2230 / / / / 絲裂霉素C 0.5 - inh inh inh 2772 / / / / 2,4,7-三硝 基-9-芴酮 0.20 - 8377 8244 400 16

22、/ / / / 4-硝基-O- 次苯二胺 20 - 2160 1599 798 0 / / / / 4-硝基喹啉 -N-氧化物 0.5 - 528 292 4220 287 / / 610 / 甲基磺酸甲 酯 1.0(卩)1 - 174 23 2730 6586 / / / / 敵克松 50.0 - 2688 1198 183 895 / / / / 9-氨基吖啶 50 - / / / / / 337 / / 2-氨基芴 10 + 1742 6194 3026

23、 261 / / / / 苯并（a） 茁 1.0 + 337 143 937 255 / 110(5 g) / / 2-氨基恩 20 + / / / / 380(5 g) / 300 / 注：inh表示抑菌。 7大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和 S9的制備 7.1誘導(dǎo) 選擇健康雄性成年大鼠，體重 200g左右。將多氯聯(lián)苯 （PCB混合物）溶于玉米油中，濃度為200mg/mL，按 500mg/kg體重一次腹腔注射， 5d后處死動物，處死前禁食 12h。 也可采用苯巴比妥鈉和 伕萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制 備。經(jīng)口或腹腔注射給予 8

24、0mg/kg苯巴比妥鈉和 80mg/kg爐萘 黃酮，連續(xù)3天，處死前禁食16h。 7.2 S9制備 首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件 下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的 0.15mol/L氯化 鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有 0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按 每克肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液3mL。用電動勻漿器制成肝 勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在 4 C條件下，以 9000g離心 10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝 2mL — 3mL。儲存于液氮生物容器中或— 80C冰箱中備用。 上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進(jìn)

25、行。制備肝 S9 所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。 S9制備后，其活 力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。 8溶劑的選擇 如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水 /去離子水作為溶 劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對試驗(yàn)菌株毒性低且無致突變性的有 機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（ DMSO ）、丙酮、95%乙醇。一 般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用 同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為 100 pl。 9劑量的設(shè)計(jì) 決定受試物最咼劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對細(xì)菌的毒性及其溶解度。 自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存 活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。 對原料而言，一般最高

26、劑量組可為 5mg/皿或5 M皿。對產(chǎn) 品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無 殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個 劑量組。每個劑量均做三個平行平板。 10試驗(yàn)操作步驟 10.1增菌培養(yǎng) 取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 5mL ,加入無菌試管中，將主平板或冷 凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)， 37 C振蕩（100 次/min ）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于 1-2 109活菌 數(shù)。 10.2平板摻入法 實(shí)驗(yàn)時，將含0.5mmol/L 組氨酸一0.5mmol/L 色氨酸- 0.5mmol/L生物素溶液（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添

27、加色 氨酸）的頂層瓊脂培養(yǎng)基 2.0mL分裝于試管中，45C水浴中保 溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液 0.1mL,受試物溶液 0.1mL和磷酸鹽緩沖液 0.5mL或者S9混合液0.5mL （需代謝活 化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動平板，使之 分布均勻。水平放置待冷凝固化后， 倒置于37 C培養(yǎng)箱里孵育 48— 72h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。 實(shí)驗(yàn)中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時設(shè)空白對照、溶 劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。 11數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷 記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變） 、溶劑對照以 及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差

28、。 如果受試物 TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是 溶劑對照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上，受試物TA97、 TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（ pKM101 ）的回變 菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上，并出現(xiàn)以下 情形之一，則該受試物判定為致突變陽性， （1） 呈劑量-反應(yīng)關(guān)系 （2） 任何一個劑量條件下，出現(xiàn)陽性反應(yīng)并有可重復(fù)性 受試物經(jīng)上述五個試驗(yàn)菌株測定后，只要有一個試驗(yàn)菌 株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物細(xì) 菌回復(fù)突變試驗(yàn)為致突變陽性。如果受試物經(jīng)五個試驗(yàn)菌株檢 測后，無論加 S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突 變陰性。