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1、鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗SalmonellaTyphimuriumSalmonellaTyphimurium/ /ReverseMutationAssayReverseMutationAssayi i范圍本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。2 2規(guī)范性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.471,Adopted:21,July1997)。3 3定義3.1回復突變(Reversemutation)細菌在化學致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。3
2、.2基因突變(Genemutation)在化學致突變物作用下細胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。3.3堿基置換突變(Basesubstitutionmutation)引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。堿基置換有轉換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。轉換是DNA鏈上的一個喀咤被另一喀咤所替代，或一個喋吟被另一喋吟所代替。顛換是DNA鏈上的一個喀咤被另一喋吟所替代，或一個喋吟被另一喀咤所代替。3.4移碼突變(Frameshiftmutation)引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。3.5鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗(Salmonellatyphimur
3、ium/reversemutationassay)利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學物質所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)-原養(yǎng)型(his+)回復突變的試驗方法。3.6S9經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和3-秦黃酮結合誘導的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。4 4原理鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復突變的細菌生長。 假如有致突變物存在， 則營養(yǎng)缺陷型的細菌回復突變成原養(yǎng)型， 因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回
4、復突變，故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的S9混合液。5 5儀器和設備培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80C)或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數(shù)器、低溫高速離心機，玻璃器皿等。6 6培養(yǎng)基和試劑10.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分：L-組氨酸(MW155)78mgD-生物素(MW244)122mg加蒸儲水至1000mL配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4c冰箱。1頂層瓊脂培養(yǎng)基成分：瓊脂粉1.2g氯化鈉1.0g加蒸儲水至20
5、0mL配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸0.5mmol/L生物素溶液20mL。1Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E成分：枸椽酸(C6H8。7-H2O)100g磷酸氫二鉀(K2HPO4)500g磷酸氫鏤鈉(NaNH4HPO4 4H2O)175g硫酸鎂(MgSO4 7H2O)10g加蒸儲水至1000mL配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸儲水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4c冰箱。120%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加蒸儲水至1000mL配制：加少量蒸儲水加溫溶
6、解葡萄糖，再加蒸儲水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4c冰箱。1底層瓊脂培養(yǎng)基成分：瓊脂粉7.5g蒸儲水480mLV-B培養(yǎng)基E10mL20%葡萄糖溶液10mL配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37c培養(yǎng)箱中24h,備用。1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基成分：牛肉膏2.5g胰月東5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.0g加蒸儲水至500mL配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4c冰箱。1鹽溶液(1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl
7、2)成分：氯化鉀(KCl)61.5g氯化鎂(MgCl26H2O)40.7g加蒸儲水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4c冰箱。10.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4-2H2O)2.965g磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O)29.015g加蒸儲水至500mL配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4c冰箱。1S9混合液成分每毫升S9混合液肝S9100l鹽溶液20川滅菌蒸儲水380l0.2mol/L磷酸鹽緩沖液500內輔酶II(NADP)4mol6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5Mmo
8、l配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實驗結束，剩余S9混合液應該丟棄。1菌株鑒定用和特殊用途試劑1.20組氨酸一生物素平板成分：瓊脂粉15g蒸儲水944mL(V-B)培養(yǎng)基E20mL20%葡萄糖20mL滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL)10mL滅菌0.5mmol/L生物素溶液6mL配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基和組氨酸溶液加進熱的瓊脂溶液中。待溶液稍為冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。1.20氨茉青霉素平板和氨茉青霉素/四環(huán)素
9、平板成分：瓊脂粉15g蒸儲水940mL(V-B)鹽溶液20mL20%葡萄糖20mL滅菌鹽酸組氨酸溶液(0.5g/100mL)10mL滅菌0.5mmol/L生物素溶液6mL氨茉青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中)3.15mL四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/LHCl中)0.25mL配制：瓊脂和水高壓滅菌20min,將無菌的葡萄糖、VB鹽溶液和組氨酸一生物素溶液加進熱的溶液中去，混勻。冷卻至大約50C,無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨茉青霉素溶液。應該在傾注瓊脂平板后幾天內，制備主平板。1.20營養(yǎng)瓊脂平板成份：瓊脂粉營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制：于0.103MPa下高壓滅菌30
10、min后傾注平板。7 7試驗菌株及其生物學特性鑒定試驗菌株采用TA97、TA98、TA100和TA102一組標準測試菌株。生物學特性鑒定新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標準,如表1所示。表1試驗菌株鑒定的判斷標準菌株組氨酸缺陷 脂多糖屏障缺損氨節(jié)青霉素抗性切除修復缺損四環(huán)素抗性自發(fā)回變菌落數(shù)*TA97+-90-180TA98+-30-50TA100TA102+-+100-200240-320+表小+表小+表小+表小+表小*在體外代謝活化條注需要組氨具有rfa突具有R因具有具有pAQ1件下自發(fā)酸變子uvrB突變質?；匕鋽?shù)略增組氨酸缺陷原理：組氨酸缺
11、陷型試驗菌株本身不能合成組氨酸，只能在補充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸平板上劃線，于37C下培養(yǎng)24h后觀察結果。結果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長。脂多糖屏障缺損原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質如結晶紫能穿透菌膜進入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37c下培養(yǎng)24h后觀察結果。結果判斷：
12、假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。氨茉青霉素抗性原理：含R因子的試驗菌株對氨芳青霉素有抗性。因為R因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨茉青霉素確定該質粒存在與否。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL,在氨茉青霉素平板上劃線，37c下培養(yǎng)24h后觀察結果。結果判斷；假若測試菌在氨茉青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨茉青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。7.5g500mL紫外線敏感性原理：具有uvrB突變的菌株對紫外線敏感，當受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復酶的菌株，則能照常生長。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0
13、.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W,距離33cm）8秒鐘。置37c下孵育24h后觀察結果。結果判斷：具有uvrB突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細菌不生長，而具有完整的切除修復系統(tǒng)的菌株，則照常生長。四環(huán)素抗性原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨茉青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37c下孵育24h后觀察結果。結果判斷：假若測試菌口常在氨茉青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明該測試菌株對氨茉青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質粒。自發(fā)回變原理：每種試驗菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回
14、變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗菌株的一項特性。鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸一生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內，混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37c培養(yǎng)箱中孵育48h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。結果判斷：每種標準測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。回變特性一診斷性試驗原理：每種試驗菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質以及S9混合液的效應不一。鑒定方法：按照平板摻入試驗的操作步驟進行。將受試物換成診斷性誘變劑。結果判斷：標準菌株對某些診斷性誘變劑特有的回變結果參見表2。表2測試菌株的回變性劑量（口g）
15、S9TA97TA98TA100TA102柔毛霉素6.0-124312347592疊氮化鈉1.5-7633000188ICR1911.0-1640631850鏈霉黑素0.25-inhinhinh2230絲裂霉素C0.5-inhinhinh27722,4,7-二硝基-9-方酮0.20-83778244400164-硝基-O-次苯一胺20-2160159979804-硝基唾咻-N-氧化物0.5-5282924220287甲基磺酸甲酯1.0-17423273065862-氨基笏10+174261943026261苯并（a）花1.0+337143937255注：inh 表示抑菌。表中數(shù)值均已扣除溶劑對照
16、回變菌落數(shù)8 8大鼠肝微粒體酶的誘導和S S9 9的制備誘導最廣泛應用的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導劑，劑量為500mg/kg體重。誘導劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。苯巴比妥鈉和3-奈黃酮結合也可做為誘導劑。S9制備動物誘導后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液3mL。用電動勻漿器
17、制成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在4c條件下，以9000g離心10min,取其上清液（S。分裝于塑料管中。每管裝2mL-3mL。儲存于液氮生物容器中或-80C冰箱中備用。上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝S9所用一切手術器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進行鑒定。9溶劑的選擇如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸儲水作為溶劑；如為脂溶性，應選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機溶劑，常用的有二甲基亞碉（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100目。1010劑量的設計決定受試
18、物最高劑量的標準是對細菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細菌存活數(shù)減少，都是毒性的標志。對原料而言，一般最高劑量組可為5mg/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應設四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。1111試驗操作步驟增菌培養(yǎng)取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL,加入無菌試管中， 將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內，37c振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應每毫升不少于12X109活菌數(shù)。平板摻入法實驗時，將含0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液
19、的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45c水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1mL,受試物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37c培養(yǎng)箱里孵育48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。實驗中，除設受試物各劑量組外，還應同時設空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。1212數(shù)據(jù)處理和結果判斷記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標準差。如果受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的兩倍或兩倍以上，并呈劑量-反應關系者，則該受試
20、物判定為致突變陽性。受試物經(jīng)上述四個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陽性。如果受試物經(jīng)四個試驗菌株檢測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。1313試驗報告試驗報告應包括以下內容：(1)受試物名稱、理化性狀、配制方法、使用溶劑；(2)試驗菌株：所用試驗菌株；(3)代謝活化系統(tǒng)：所用誘導劑；(4)試驗方法：簡述操作步驟，除受試物劑量分組外，還應說明空白對照、溶劑對照和陽性對照，陽性結果判定標準；(5)結果：以列表方式報告受試物的Ames實驗結果(表1);(6)結論。表1Ames試驗菌株的回變結果(平均值土標準差)MSTA97TA98-TA100-TA102-組另I(mg/-(S9)+(S9)-(S9)+(S9)-(S9)+(S9)-(S9)+(S9)皿)受試物自發(fā)回變溶劑對照陽性物對照
回復突變試驗
