儀器分析：第20章 高效液相色譜法

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1、第第2020章章 高效液相色譜法高效液相色譜法 概述概述 高效液相色譜法：高效液相色譜法：以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，在氣以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，在氣相色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法相色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法一、一、HPLC與經(jīng)典與經(jīng)典LC區(qū)別區(qū)別主要區(qū)別：固定相，輸液設(shè)備和檢測手段主要區(qū)別：固定相，輸液設(shè)備和檢測手段1經(jīng)典經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑，固定相粒徑100m 且不均勻且不均勻 常壓輸送流動相常壓輸送流動相 柱效低（柱效低（H，n） 分析周期長分析周期長 無法在線檢測無法在線檢測2HPLC：分離和分析：分離和分

2、析 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑，固定相粒徑 流動相極性流動相極性 極性小的組分先出柱，適于分離極性組分極性小的組分先出柱，適于分離極性組分反相色譜反相色譜(reversed phase，RLLC)： 固定液極性固定液極性 固定相極性固定相極性 底劑底劑 + 有機調(diào)節(jié)劑（極性）有機調(diào)節(jié)劑（極性） 例：水例：水 + + 甲醇，乙腈甲醇，乙腈續(xù)前 反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜4k的影響因素：的影響因素： 溶質(zhì)的極性越弱，疏水性越強，溶質(zhì)的極性越弱，疏水性越強，k越大；越大； 流動相的含水量越高，洗脫能力減小，流動相的含水量越高，洗脫能力減小，k越大越大 鍵合相的烷基鏈長增長，鍵合相的烷基鏈長增

3、長，k增大增大5出柱順序：出柱順序： 極性大的組分先出柱極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱極性小的組分后出柱6適用：適用： 非極性非極性中等極性組分（中等極性組分（HPLC80%問題）問題）正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜1分離機制：分離機制： 溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導力、或氫鍵作用力誘導力、或氫鍵作用力2固定相：固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相極性大的氰基或氨基鍵合相3流動相：流動相：極性小極性小 底劑（烷烴）底劑（烷烴） + 有機極性調(diào)節(jié)劑有機極性調(diào)節(jié)劑 例：正己烷例：正己烷 + + 氯仿氯仿- -甲醇，氯仿甲醇，氯仿- -乙醇乙醇續(xù)前 正相鍵合

4、相色譜正相鍵合相色譜4流動相極性與流動相極性與k的關(guān)系：的關(guān)系： 流動相極性流動相極性，洗脫能力，洗脫能力， 組分組分tR，k5出柱順序：出柱順序： 極性大的組分極性大的組分(分配系數(shù)大）后出柱分配系數(shù)大）后出柱6適用：適用： 氰基鍵合相氰基鍵合相：雙鍵異構(gòu)體或雙鍵數(shù)不同：雙鍵異構(gòu)體或雙鍵數(shù)不同 的環(huán)狀化合物的環(huán)狀化合物 氨基鍵合相氨基鍵合相： 分析極性大物質(zhì)、糖類等分析極性大物質(zhì)、糖類等離子對色譜和離子抑制色譜離子對色譜和離子抑制色譜1反相離子對色譜法反相離子對色譜法 2反相離子抑制色譜反相離子抑制色譜 用于有機酸、堿用于有機酸、堿反相離子對色譜法（反相離子對色譜法（RPIC） （ reve

5、rsed phase paired ion chromatography ） 在極性流動相中加入離子對試劑，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性使被測組分與其中的反離子形成中性離子對，增加離子對，增加k和和tR，以改善分離，以改善分離 例：分析堿性物例：分析堿性物 流動相流動相 固定相固定相 B+H+=BH+ +RSO3Na=RSO3-+Na+ BH+RSO3-m BH+RSO3-S 固定相：十八烷基硅烷固定相：十八烷基硅烷流動相：甲醇（乙腈）流動相：甲醇（乙腈）水（加水（加0.0030.01 mol/L PIC試劑，調(diào)至一定試劑，調(diào)至一定pH值）值）1）離子對試劑：

6、）離子對試劑：烷基磺酸鈉烷基磺酸鈉分析堿分析堿 四丁基季胺鹽四丁基季胺鹽分析酸分析酸2）影響）影響k的因素的因素 aPIC試劑種類和濃度試劑種類和濃度 PIC試劑碳鏈增長，極性小，試劑碳鏈增長，極性小，tR，k b. 流動相的流動相的pH 有利于組分離解而形成離子對有利于組分離解而形成離子對3）適用：）適用： 較強的有機酸、堿較強的有機酸、堿反相離子抑制色譜（反相離子抑制色譜（ISC）（ reversed phase ion supretion chromatography） 通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制值，抑制組分解離，增加其組分解離，增加其k和和tR，以

7、達到改善分離目，以達到改善分離目的的抑制劑：抑制劑： 弱酸（常用弱酸（常用HAc）流動相中加入少量流動相中加入少量 弱堿（常用弱堿（常用NH3） 緩沖鹽（常用磷酸鹽或緩沖鹽（常用磷酸鹽或 乙酸鹽）乙酸鹽）2）k的影響因素：與流動相極性有關(guān)，還與的影響因素：與流動相極性有關(guān)，還與pH值值有關(guān)有關(guān) 酸性物質(zhì)酸性物質(zhì)加入酸加入酸HAc tR，k 堿性物質(zhì)堿性物質(zhì)加入堿加入堿NH3H2O tR，k 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH范圍：范圍：3.08.0 pH8.0 pH8.0 破壞鍵合相與載體的結(jié)合破壞鍵合相與載體的結(jié)合 pH3.0 pH甲醇的極性甲醇的極性 在反相鍵合相色譜（固定相為在反相鍵合相色譜（固定相為C18）

8、中，）中，甲醇洗脫能力比水強甲醇洗脫能力比水強常用溶劑的極性順序：常用溶劑的極性順序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六環(huán)二氧六環(huán) 四氫四氫呋喃呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙乙醚醚 異丙醚異丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳環(huán)己烷環(huán)己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)溶劑選擇性溶劑選擇性 P531 以溶劑和溶質(zhì)間的作用力作依據(jù)以溶劑和溶質(zhì)間的作用力作依據(jù) 選擇性參數(shù)選擇性參數(shù)Xe.Xd.Xn分別反映溶劑的質(zhì)子接分別反映溶劑的質(zhì)子接受能力、質(zhì)子給予能力和偶極作用力受能力、質(zhì)子給

9、予能力和偶極作用力 將溶劑分為將溶劑分為8組，并得溶劑選擇性分類三角形組，并得溶劑選擇性分類三角形 選擇不同組別的溶劑選擇不同組別的溶劑,分子間作用力不分子間作用力不同同,容易造成組分間分配系數(shù)容易造成組分間分配系數(shù)K的差異的差異,利利于分離。于分離。反相色譜溶劑選擇一般原則反相色譜溶劑選擇一般原則 首選純?nèi)軇杭状迹ㄊ走x純?nèi)軇杭状迹ńM）、組）、 乙腈（乙腈（組）、組）、 四氫呋喃（四氫呋喃（組）組） 底劑：水底劑：水對流動相的要求：對流動相的要求：P5311）與固定液不反應(yīng)）與固定液不反應(yīng)2）對樣品有良好溶解度）對樣品有良好溶解度 k=110 （可用）（可用） k=25 （最佳）（最佳）3

10、）與檢測器匹配：）與檢測器匹配： UV（測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長）（測定波長應(yīng)大于溶劑的截止波長） 熒光，電化學，蒸發(fā)光散射熒光，電化學，蒸發(fā)光散射4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈），使用前過濾、脫氣乙腈），使用前過濾、脫氣洗脫方式洗脫方式 1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫） 以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分 類似類似GC的等溫度洗脫的等溫度洗脫2）梯度洗脫：）梯度洗脫： 在一分析周期內(nèi)，按一定的程序，改變多元流動相的在一分析周期內(nèi)，按一定的程序，改變多元流動相的濃度配比濃度配比(使其組成、極性、使

11、其組成、極性、pH值按一定程序變化值按一定程序變化) 適于分析極性差別較大（適于分析極性差別較大（k變化范圍寬）的變化范圍寬）的復(fù)雜組分復(fù)雜組分 類似類似GC的程序升溫的程序升溫圖示 高效液相色譜儀高效液相色譜儀(1) 高壓輸液泵高壓輸液泵u壓力：壓力：150350105 Pa。u為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時），液體的流動相高速通過時 ，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是 高效液相色譜的特點之一。高效液相色譜的特點之一。u應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小（雙泵串聯(lián)補應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖?。p

12、泵串聯(lián)補償）、流量償）、流量 穩(wěn)定可調(diào)、穩(wěn)定可調(diào)、 耐腐蝕耐腐蝕 等特性。等特性。(2)梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置 高壓梯度高壓梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。 低壓梯度低壓梯度: 一臺高壓泵一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。(3) 進樣裝置進樣裝置 流路中為高壓力工作狀態(tài)流路中為高壓力工作狀態(tài) 使用耐高壓的六通閥進樣裝置使用耐高

13、壓的六通閥進樣裝置(4) 高效分離柱高效分離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。小填料粒度和柱徑以提高柱效。 柱再生：維護、保養(yǎng)、柱子的沖洗柱再生：維護、保養(yǎng)、柱子的沖洗(5) 液相色譜檢測器液相色譜檢測器紫外檢測器紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對共軛結(jié)構(gòu)的有機化合物有響應(yīng)。應(yīng)用最廣，對共軛結(jié)構(gòu)的有機化合物有響應(yīng)。 特點：特點： 靈敏度高；靈敏度高； 線形范圍高；線形范圍高； 流通池可做的很?。魍ǔ乜勺龅暮苄。?mm10mm ，容積，容積8L） 對流動相的流速和對流動相的流速和 溫度變化不敏感；

14、溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作；波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。可用于梯度洗脫。 光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 紫外檢測器的重要進展；紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：1024個二極個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖。理，三維立體譜圖。光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 熒光檢測器熒光檢測器（fluorescence detector） 高靈敏度、高選擇性； 對多環(huán)芳烴，維生素B 、黃曲霉素、卟啉類 化合物、農(nóng)藥、藥物、 氨基酸、甾類化合物 等有響應(yīng)；l示差折光檢測器：示

15、差折光檢測器：利用折光率的差別利用折光率的差別 （通用型儀器）（通用型儀器） 靈敏度低，溫度要求嚴格靈敏度低，溫度要求嚴格l電化學檢測器電化學檢測器l化學發(fā)光檢測器化學發(fā)光檢測器l質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器 5）蒸發(fā)光散射檢測器（）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）通用型）通用型原理：原理：柱流出液引入霧化器與通入柱流出液引入霧化器與通入N2氣混合成液氣混合成液滴，經(jīng)加熱漂移管蒸發(fā)除去流動相，組分形成的滴，經(jīng)加熱漂移管蒸發(fā)除去流動相，組分形成的氣溶膠進入檢測室，用強光照射產(chǎn)生光散射，用氣溶膠進入檢測室，用強光照射產(chǎn)生光散射，用光電二極管檢測。光電二極管檢測。 lgI=blgm+lgK 檢測揮發(fā)性低于流動相檢測揮發(fā)性低于流動相的組分，例糖類、高級脂肪的組分，例糖類、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三脂及甾體。、甘油三脂及甾體。定性和定量定性和定量 外標工作曲線法外標工作曲線法六通閥定量進樣，檢驗線性范圍六通閥定量進樣，檢驗線性范圍 內(nèi)標法內(nèi)標法 可抵消儀器不穩(wěn)定、進樣量不準可抵消儀器不穩(wěn)定、進樣量不準確引入的誤差確引入的誤差