基因工程抗體的研究生物技術專業(yè)

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1、基因工程抗體的研究 摘要：免疫學自誕生以來便一直是生物科學界的研究熱點，其在醫(yī)學臨床等領域有著重要的應用，如免疫預防，免疫治療和免疫診斷等。免疫學的研究對人類社會的發(fā)展做出了重要的貢獻。近年來，隨著基因工程技術的發(fā)展，免疫學的研究也取得了新的突破，對基因工程抗體，基因工程疫苗，基因工程細胞治療等研究的深入，使免疫學研究進入了新的階段。抗體分子作為免疫學研究的核心之一，在基因工程等技術的改造下，產生了新的價值。通過基因工程等技術，對抗體分子進行改造，優(yōu)化了許多傳統(tǒng)抗體分子應用的弊端，提高了抗體分子應用的水平和效率，具有廣闊的發(fā)展前景。但有些新技術也存在問題，需要逐步完善優(yōu)化才可廣泛使用，本

2、文對基因工程技術在抗體分子研究領域的應用，存在的問題及發(fā)展前景等方面進行了綜述。 關鍵詞：基因工程抗體，免疫學，人源化技術，抗體藥物 Study On Genetically Engineered Antibody Abstract: Immunology has been a research hotspot in bioscience since its birth. It has an important application in the field of clinical medicine, such as immunoprophylaxis, immunothera

3、py and immunodiagnosis. Immunology research has made an important contribution to the development of human society. In recent years, with the development of genetic engineering technology, immunology research has also made new breakthroughs. With the in-depth study of genetic engineering antibody, g

4、enetic engineering vaccine, and genetic engineering cell therapy, immunology research has entered a new stage. As one of the core of immunology research, antibody molecules had new value under the transformation of gene engineering and other technologies. Through genetic engineering and other techno

5、logies, the antibody molecules were modified to optimize the disadvantages of many traditional antibody molecules, improve the level and efficiency of the application of antibody molecules, and have broad prospects for development. However, some new technologies also have some problems that need to

6、be gradually improved and optimized before they can be widely used. This article reviews the application of genetic engineering technology in the field of antibody molecule research, existing problems and development prospects. Keywords: Genetically engineered antibodies; Immunology; Humanized tech

7、nology; Antibody drugs  引言 抗體(antibody)是免疫系統(tǒng)中重要的免疫分子，可以識別并特異性結合抗原，具有中和毒素，阻止病原體入侵，激活補體系統(tǒng)產生膜攻擊復合體破壞靶細胞，調理吞噬細胞以及介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)等重要免疫功能。自1975年，Kohler等[1]建立了B淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體(Monoclonal antibody,McAb)技術，利用該技術可獲得大量特異性很高的抗體，使免疫學得到了很大的發(fā)展，該技術可廣泛用于疾病的診斷與治療等研究中。但是單克隆抗體本身的性質限制了它的臨床應用，如：由于人-人單克隆抗體雜交瘤技術

8、不成熟[2]，應用于臨床的鼠源性單克隆抗體對人具有抗原性，且會引起人抗鼠抗體反應(human anti-mouse antibody reaction;HAMA reaction)[3]，此外產生的單克隆抗體分子量過大，難以通過血腦屏障，胎盤等結構。隨著分子生物學的發(fā)展，基因工程技術取得重要突破，對免疫學的研究產生了重要的影響。80年代，科研人員通過DNA重組技術，對已有的單克隆抗體基因進行改造獲得了人源化程度高，分子量小且特異性高的抗體，使抗體技術更好的為人類服務?，F(xiàn)已通過基因工程技術構建出人源化抗體及全人抗體，使其抗原性顯著降低，更有利于臨床應用；在抗體類藥物的研究方面也取得了巨大的突破，

9、雙特異性抗體，融合蛋白等改造抗體，因具有較高特異性及較強的親和力而被廣泛研究及應用；此外，噬菌體展示技術及核糖體展示技術的開發(fā)并應用于蛋白質類藥物的篩選，抗體作用的研究，醫(yī)學診斷和治療等領域也顯示了良好的成效。 1 基因工程抗體 1.1 嵌合抗體(chimeric-antibody) 嵌合抗體的基因是由鼠源性抗體的V 區(qū)基因與人抗體的C 區(qū)基因拼接而成，將連接后的基因構建相應載體，轉染骨髓瘤細胞，獲得分泌人-鼠嵌合抗體的骨髓瘤細胞。該類抗體人源化程度達到70％，是通過基因工程技術最早制備成功的抗體。1984年，Morrison等[4-5]在前人研究的基礎上，創(chuàng)立了人-鼠嵌合抗體技術,

10、通過該方式獲得的人-鼠嵌合抗體保留了原鼠單克隆抗體的高特異性和親和力，減少了鼠源成分，從而降低了鼠源性抗體引起的不良反應，且其人源Fc片段能有效介導ADCC等生物學效應，還具有操作相對方便，以及可根據不同需要選擇性變換多種亞型等優(yōu)點。目前，該類抗體已在抗腫瘤，治療類風濕性關節(jié)炎，以及器官移植的抗排斥治療中應用廣泛，其中由美國FDA批準的主要應用于治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、和類風濕性關節(jié)炎(RA)等疾病的Rituxan(rituximab)嵌合抗體比較典型，此外還有Erbitux(cetuximab),Simulect等嵌合抗體也較為常見[6-7]。但該類抗體鼠

11、源性仍然高達30％，仍會誘發(fā)HAMA反應，臨床應用與研究仍然受限。 1.2 改型抗體 改型抗體又叫CDR移植抗體(complementary determination region antibody), 是利用基因工程技術，將人抗體可變區(qū)（V）中互補性決定區(qū)（CDR）的氨基酸序列換成鼠源單抗CDR序列，該抗體的3個互補決定區(qū)(CDR)為鼠源性成分，而骨架區(qū)(FR)等為人源性成分，在嵌合抗體的基礎上進一步減少鼠源性成分，使該抗體的人源化程度達到90%以上，該類抗體被應用于癌癥等疾病的治療取得了較顯著的成效。我國食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)在2008年批準上市的由我國百泰生物藥業(yè)二次開發(fā)

12、的CDR移植抗體-泰欣生（尼妥珠單抗注射液），人源化程度達到95%，該類抗體聯(lián)合放療、化療等對治療神經膠質瘤，胰腺癌，食道癌，肝癌等實體瘤具有較高的臨床價值[8]。但由于該類抗體仍未完全解決鼠源性成分的抗原性問題，CDR移植常導致抗體分子親和力下降，且該操作不具有普遍性等缺點，限制了該類抗體的發(fā)展[9]。 1.3 小分子抗體 1.3.1 Fab及F(ab)’2 片段 Fab 片段( fragment with antigen binding，F(xiàn)ab) 由完整輕鏈和重鏈的VH 與CH1構成，其大小僅為完整抗體的1/3，通過基因工程技術將輕鏈和重鏈可變區(qū)分別與人抗體的κ 鏈和重鏈CH

13、1重組，獲得重組Fab,該類抗體分子量小、親和力高、抗原性低, 在生物治療領域可用于導向藥物顯影和靶向生物治療劑等。目前已有多個片段藥物獲得FDA批準上市。如作為冠狀動脈導管插術時預防心肌缺血的輔助用藥的阿昔單抗( abciximab，ReoPro)；治療黃斑變性的蘭尼單抗( lucentis)以及治療克羅恩病和風濕性關節(jié)炎的阿昔單抗（abciximab，ReoPro）等。F(ab)’2是由兩個Fab片段通過鉸鏈區(qū)相連形成的小分子抗體在臨床常用于放射免疫治療，Cheng等[10]利用基因工程技術,將抗腫瘤的糖蛋白F(ab)’2片段與放射性元素125I/131I連接構建了耦聯(lián)蛋白CC49,該抗體

14、具有較高親和力，具有較強的定位腫瘤的能力。 1.3.2 單鏈抗體 單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv），是利用基因工程技術，將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過15～20個氨基酸的短肽連接而成的抗體，是具有抗體活性的最小功能單位[11]。該類抗體的分子量僅為完整抗體的1/6，具有分子量小、穿透力強、抗原性弱等明顯優(yōu)勢，scFv能較好地保留其對抗原的親和活性，可分別在胞內，胞外表達也可以融合蛋白形式表達，且其在體內循環(huán)的半衰期短，易清除。單鏈抗體在生物醫(yī)學中較廣泛用于靶向治療，利用重組技術將單鏈抗體(scFv)與白細胞介素-2(IL-2),蓖麻毒素

15、，腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素(IFN)等毒性蛋白或細胞因子融合,形成免疫毒素等特異性殺傷靶細胞。此外，該類抗體在生物檢測、診斷方面也具有顯著優(yōu)勢，它具有分子量小，穿透力強，在組織中分布指數(shù)高的特點，且其攜帶的放射性核素在體內排出快，常用于腫瘤的顯像定位診斷[12]。 1.3.3 納米抗體和分子識別單位 1.3.3.1 納米抗體 納米抗體又稱為單域抗體（VHH），由一個重鏈可變區(qū)組成,其抗原結合區(qū)為與鉸鏈區(qū)相連的Fc區(qū)單結構域,其分子量約為完整抗體的1/10。VHH具有良好的親和力，且具有高度水溶性和穩(wěn)定性，使其在胃液和內臟等器官中仍保持抗原結合活性，通過基因工程技術，對人源抗體V

16、H結構域FR2中的一些氨基酸進行VHH特征性改造,可得到單域VH抗體。VHH抗體可結合一些常規(guī)抗體無法結合的抗原表位。并可進入酶的活性部位及細菌或病毒表面受體裂縫中，可以利用該特點設計酶的抑制劑、受體的激動劑或拮抗劑等，由于該類抗體分子量很小可穿過血腦屏障等結構，在治療神經性疾病和腦腫瘤等疾病方面具有廣闊發(fā)展前景。納米抗體也可制成抗體芯片用于臨床疾病標志物的檢驗[13]。 1.3.3.2 分子識別單位 分子識別單位( molecularrecognition unit，MRU)是由單個互補決定區(qū)組成的小分子抗體片段，分子量約為完整抗體的1/80-1/70，可結合抗原，且具有分子量小、穿透

17、力強、半衰期短、顯像時本底低等優(yōu)點，在臨床診斷中具有潛在的應用前景。可通過基因工程手段獲得。 1.4 全人抗體 分子生物學的發(fā)展是全人抗體的獲得成為可能。目前，轉人抗體基因小鼠和噬菌體展示技術為獲得該類抗體的方式。近年來，基因編輯等技術取得了重大突破，轉基因動物方面的研究也逐漸深入，通過轉基因動物獲得全人抗體有幾種不同的方式。其中一種方式是，將已產生免疫反應的供體患者的淋巴細胞，導入嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，使其作為人的免疫系統(tǒng)，暫時發(fā)揮功能[14]。此后，通過雜交瘤技術獲得產人抗體的細胞。但此方法存在無法選擇具有針對性的抗原，以及該系統(tǒng)作用必須依賴已產生免疫效應的供體細胞等自身缺陷，而使

18、其應用及發(fā)展受限。另一種較為常見的獲得全人抗體的方式為利用基因編輯技術，將小鼠的抗體基因敲除，并轉入人的抗體基因片段，從而創(chuàng)造出具有人抗體基因簇而自身抗體基因失活的轉基因小鼠。該類小鼠被稱為（Human antibody mouse,HuMab）,該類抗體特異性高，親和力好，且可有效進行同種型轉換，使抗體免疫治療的安全性得到很大的提高廣泛用于癌癥及一些慢性病的治療[15]。在此基礎上，又發(fā)展出了轉人染色體小鼠[16]，這種小鼠基因組攜帶了從人染色體上分離的含有全部人抗體重鏈和輕鏈胚系基因簇的染色體片段，這種抗體在更加與人體內基因環(huán)境相近的條件下產生，更加有應用價值和安全性。 1.5 其他抗

19、體 在小分子抗體的基礎上進一步對其進行改造和修飾，改善其親和力、免疫原性及效應。構建更高級更復雜的抗體分子，使抗體具有更高的利用價值。上文中在有些抗體的應用方面已提到以下某些抗體類型。 1.5.1 雙特異性抗體 雙特異性抗體抗體（bispecific antibody,BSAB）為具有兩個特異性抗原結合位點的人工抗體，通常一個與靶細胞抗原表位結合，另一個與免疫細胞（如淋巴細胞，中性粒細胞，單核巨噬細胞等）結合，產生導向性的效應功能?？赏ㄟ^化學交聯(lián)，細胞工程，基因工程等方式獲得[17]。該類抗體靶向性好，主要用于腫瘤的免疫治療。Michaelson 等[18]將抗LTβR 的ScFv

20、片段融合于抗TRAIL-R2 單抗的重鏈端，設計了同時以TNF家族膜受體TRAIL-R2 和LTβR 為靶點的IgG 樣BsAb。此類抗體半衰期長，體外實驗證明，該雙特異性抗體兩端均具有抗腫瘤細胞的能力，且有較強的的藥效，可顯著地縮小腫瘤體積。Rossi等[19]構建了基因工程人源化6 價抗CD20 /22 的BsAb—20-22和22-20。它們無需第二抗體交聯(lián)即可誘導腫瘤細胞凋亡和抑制其增殖，它們具有更強的殺傷淋巴瘤細胞的功效，且對同體正常B細胞的作用較弱。 1.5.2 抗體融合物 抗體融合物是利用基因工程技術將小分子抗體與生物活性蛋白，如：毒素，細胞因子，酶類，放射性標記抗體片段甚

21、至化療藥物以及核酸（反義寡核苷酸，小RNA）等融合或耦聯(lián)，而形成的抗體融合物，提高靶向治療的效果。其中，將抗體片段與細菌或植物毒素連接,可使其具有特異性的識別腫瘤細胞的功能, 并利用毒素來殺傷腫瘤細胞；Di Paolo等[20]，將人源化的抗Ep-CAM的單鏈抗體4D5MOCB與綠膿假單胞外毒素A融合,形成Ep-CAM特異性重組免疫毒素，其可定位在Ep-CAM陽性的腫瘤細胞, 并能抑制腫瘤細胞在裸鼠體內的生長,具有良好的應用前景?？蓪⒖贵w片段與白細胞介素（IL-2,IL-12）或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等細胞因子結合形成成融合蛋白,細胞因子可激活某些免疫細胞，從而增強免疫效

22、應，靶向殺傷腫瘤細胞，DeBruyn等構建了兩種融合蛋白 anti-CD3：trai和 K12：TRAIL，它們均可提高T細胞抗腫瘤活性，并延長移植瘤小鼠的壽命。此外“生物導彈”治療將抗體 片段與“彈頭”藥物（放射免疫耦聯(lián)物，化學免疫耦聯(lián)物，免疫毒素等）相連接，具有特異性高、性質均一等特點，可特異性殺傷腫瘤細胞，對正常組織損傷小，且作用持久。CA125耦聯(lián)放射性核素，在治療卵巢癌研究以及臨床方面已取得較大進展[21]。許多抗體耦聯(lián)藥物也在廣泛被開發(fā)，有些已進入臨床III期試驗階段，具有廣闊的發(fā)展前景[22]。 1.6 抗體庫 1.6.1 噬菌體抗體庫技術 抗體庫技術是基于分子生物學

23、方法建立的，噬菌體抗體庫技術和核糖體展示技術是抗體庫篩選技術的主要手段。20世紀80年代Smith[23]，發(fā)現(xiàn)了可以體外表達并顯示目的基因的噬菌體展示技術。噬菌體抗體庫（phage antibody library）是由B淋巴細胞全套抗體可變區(qū)基因克隆并組裝成的噬菌體群體[24]。該技術依賴于PCR技術，DNA重組技術，及噬菌體表面呈現(xiàn)技術的發(fā)展。該技術的基本原理為通過PCR等技術克隆全套抗體可變區(qū)基因，利用基因工程等技術將克隆的基因片段插入到噬菌體編碼衣殼蛋白的基因中，抗體Fab片段或單鏈抗體等可以與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白，從而在噬菌體表面展示，建立噬菌體抗體文庫。通過該技術可獲得大量

24、人源化抗體，且該技術具有操作簡單，周期短等優(yōu)點，廣泛用于藥物篩選[25]，以及抗體，酶類，激素等蛋白的制備，并且通過該技術可獲得普通方法無法獲得的抗體，在動物疾病的預防，診斷，治療等領域具較大發(fā)展空間[26-27]。但該技術也具有庫容不足，蛋白質無法正確修飾等缺點。 1.6.2 核糖體展示技術 核糖體展示技術[28-29]（ribosome display,RD）是一種完全在體外合成蛋白質分子，并進行選擇與進化的技術。其主要原理為利用PCR技術擴增目的基因，在該過程同時引入啟動子，核糖體結合位點，莖環(huán)等結構，隨后轉入耦聯(lián)轉錄/翻譯的無細胞翻譯系統(tǒng)中進行孵育，形成“mRNA-蛋白質-核糖體

25、”三元復合體，從而目的基因的翻譯產物展示在核糖體標面[30]。該系統(tǒng)庫容大，可以更容易的篩選到目標分子，且具有表達分子范圍廣泛，及效率高，周期短等優(yōu)點。此后又發(fā)展出了mRNA展示技術（mRNA display），也稱RNA多肽融合技術或體外病毒技術，該系統(tǒng)將mRNA分子與其所編碼的多肽利用嘌呤霉素分子聯(lián)結，形成mRNA-DNA-嘌呤霉素分子文庫，類似于核糖體展示技術，可在體外翻譯。 2 基因工程抗體的應用 基因工程抗體是在單克隆抗體基礎上逐漸發(fā)展而來的，其在生物，醫(yī)學等領域的基礎研究及臨床應用更為廣泛更具針對性，在疾病的檢測，預防以及治療等方面已取得顯著成效，其中抗體類藥物開發(fā)的研究

26、較為廣泛，包括治療癌癥，自身免疫病，神經性疾病，感染性疾病，以及抗移植排斥及抗凝血等，其中部分藥物已批準使用，部分藥物已進入臨床試驗階段。 2.1 抗腫瘤 基因工程抗體類藥物廣泛用于癌癥治療。因其具有特異性，靶向性，較長的半衰期及獨特的生物學效應等優(yōu)點，使其治療腫瘤具有顯著效果。如雙特異性抗體，融合蛋白等基因工程抗體分子廣泛用于淋巴瘤，肝癌，卵巢癌，及消化道癌的治療。 2.2 抗自身免疫病 在深入了解各種免疫反應的基礎上，設計針對引起自身免疫病的免疫反應的基因工程抗體，如構建針對炎性因子，細胞因子等的釋放及降解的抗體分子，抑制過度免疫應答，從而緩解自身免疫病,已應用于類風濕性關

27、節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑藍瘡等疾病的治療[31]。此外具抗凝血及抗移植后免疫排斥的抗體也在研究發(fā)展中。 2.3 抗病毒感染 抗體分子經基因工程改造后具有特異性強，親和力高，分子片段小通透性強，且半衰期長等特點，耦聯(lián)毒素，酶類等蛋白的基因工程抗體，在病毒性疾病如呼吸系統(tǒng)病毒感染，肝炎，艾滋病，狂犬病等疾病的預防和治療中顯示了極大優(yōu)勢[32]。 3 基因工程抗體存在的問題 3.1 抗體的免疫原性 隨著基因工程技術的發(fā)展從嵌合抗體，改型抗體到小分子抗體等，改造的抗體分子人源化程度不斷提高。但因其產生在老鼠等異種生物體內，產生的抗體分子仍會引起不同程度的人抗鼠抗體反應(human anti-mo

28、use antibody reaction，HAMA）及抗體嵌合反應（Human anti-chimeric antibody,HACA）等，仍會有免疫原性，從而導致安全問題，限制了臨床應用。 3.2 抗體的親和力 基因工程抗體分子的親和力僅為原鼠源抗體的33%-50%。這很大程度的限制了它們的應用及實用效率。需進一步研究其結構及表面修飾等因素，使該問題得到優(yōu)化， 3.3 抗體的結構及修飾 由于抗體分子為四條鏈（兩條重鏈，兩條輕鏈）組成的三維立體結構，其空間結構復雜，且分子修飾繁瑣，在異種生物體內，表達由于環(huán)境不同于人體內環(huán)境，會造成在肽鏈一級結構的基礎上盤曲，折疊，組裝的方式

29、有所改變，以及蛋白質糖基化等修飾有所不同，導致抗體分子活性受影響。 3.4 抗體的穿透性 抗體分子的分子量，是決定其能否通過血管壁，組織屏障等結構的重要因素，治療性基因工程抗體分子，需在保持自身完整性并攜帶藥物蛋白的基礎上，可通過各結構到達作用位點，所以兼顧兩方面因素的技術手段，需進一步研究發(fā)展。 4 結語 近年來基因工程技術迅速發(fā)展，利用該技術改造的抗體也被廣泛研究，許多基因工程抗體已進入大規(guī)模生產階段，在免疫預防，免疫治療等領域取得了顯著成效，推動著生物醫(yī)學的進步。但改造的抗體分子存在免疫原性，以及親和力，特異性差等問題，此類問題也是未來基因工程抗體研究的發(fā)展優(yōu)化方向。本文綜

30、述了近年來基因工程抗體的研究進展，各類抗體的特點及應用領域，以及存在待改善的問題等，并強調了其在生物醫(yī)學領域的重要作用及發(fā)展趨勢。相信不久的將來，基因工程抗體將得到進一步的發(fā)展，在其質量，效率等方面都有顯著的改善，從而更加廣泛地應用于各領域，更好地為人類服務。 [參考文獻] [1] Kohler G．Mi istein C．Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity [J]．Nature，1975，2

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