河南大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目申請書.doc

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河南大學 大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目 申 請 書 項目名稱： 促透膜納米混懸劑克服藥物外排的研究 項目負責人： 學 號： 所在學院： 年級專業(yè)： 填寫日期： 河南大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃工作領導組制 填寫說明 一、封面中的項目編號由學校統(tǒng)一編排填寫。 二、申請書中第2頁和第一至第五項的內(nèi)容，經(jīng)項目團隊人員共同討論并征得指導教師意見后，由項目負責人主持填寫。 三、“項目所屬學科”按教育部1998年頒布的“普通高等學校本科專業(yè)目錄”中的哲學、經(jīng)濟學、法學、教育學、文學、歷史學、理學、工學、農(nóng)學、醫(yī)學和管理學11個一級學科門類中的一種或多種(跨學科)；“學業(yè)能力與獲獎情況”指項目負責人已經(jīng)獲取的成果和獎勵，如正式發(fā)表的學術論文、創(chuàng)作、專利、參加完成的科研課題、被社會及生產(chǎn)實際采用的成果和校級以上的各種學業(yè)獎勵（挑戰(zhàn)杯、電子設計大賽等），均須提供復印件，隨申請書一并報送。 四、所填內(nèi)容要符合《河南大學大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目管理辦法》要求，實事求是、簡明清晰、具體可靠。對提供虛假材料或信息數(shù)據(jù)不實者，將取消申報資格，并承擔相應責任。 五、格式要求：封面使用小三號字體，表格中使用五號字體，所填寫的文字用宋體，數(shù)字及其他用Times New Roman，單倍行距。需簽字部分須由相關人員用黑色鋼筆或水筆簽名。A4紙雙面打印，左側裝訂。 六、項目申請書一式二份，報教務處一份、所在學院一份。 項目名稱 促透膜納米混懸劑克服藥物外排的研究 項目所屬 一級學科 申請經(jīng)費（元） 10,000 起止 時間 年 月至 年 月 項目負責人 基本情況 姓 名 性別 出生年月 政治面貌 聯(lián)系電話 E-mail 學 業(yè) 能 力 與 獲 獎 情 況 項目團隊 （ 含負責人） 姓 名 性別 學號 所在學院、專業(yè) 年級 項目分工 1 2 3 4 5 指導教 師 姓 名 性別 出生年月 學歷 職稱 所在單位 聯(lián)系電話 第一指導教師的業(yè)務特長與主要學術成果 一、主要研究內(nèi)容及研究價值、目前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、本項目的創(chuàng)新與特色 目前，經(jīng)高通量篩選獲得的藥物中約40％因水溶性問題而使用受限，常使?jié)撛诘闹匾幤凡荒苌鲜谢虺浞职l(fā)揮療效。據(jù)估計，全球每年約有650億美元的藥品因生物利用度差，造成患者花費大、療效小等問題。如BCS第2和4類藥物，無論是用于靜脈給藥，還是口服給藥，水溶性都是限制其使用的主要因素，如靜脈給藥必須使用水性介質(zhì)，而口服給藥要求藥物在胃腸道內(nèi)完全溶出。劑型的合理設計可以克服這一難題、確保靜脈給藥的可行性、提高口服生物利用度（吳鐳, et al, 2003）。因此，藥物新劑型的研究和制劑新技術的應用是其開發(fā)成功的關鍵。 研究表明（Rabinow BE, et al, 2004），納米混懸劑(nanosuspensions)可以較好地解決難溶性藥物的水溶性問題。納米混懸劑是采用少量的表面活性劑或聚合物材料穩(wěn)定的“純”藥物粒子分散于液體中形成的一種亞微米膠體分散體系。無論是難溶于水的藥物還是既難溶于水又難溶于油的藥物，都可以制備得到相應的納米混懸劑。納米混懸劑具有以下優(yōu)點：①納米混懸劑具有降低靜注給藥體積和減少藥物的化學變化。如有文獻報道納米混懸劑可以增加奧美拉唑（Schwitzera JM, et al, 2004）、羥基喜樹堿（Pu X, et al, 2009）、槲皮素（Gao L, et al, 2011）和水飛薊素（趙曉宇, et al, 2009）的化學穩(wěn)定性。②生物利用度高。一方面，它可以通過降低粒徑、增加比表面積，從而增加藥物的溶出速率，進而提高藥物的生物利用度（Jinno J, et al, 2006）；另一方面，由于比表面積大，納米結晶對胃腸道生物膜有很強的粘附性（Mller RH, et al, 2002），不易被清除，從而延長藥物在胃腸道的吸收時間，增大藥物的生物利用度。③生物安全性好。其載藥量高，可以避免附加成分或減少載體材料的使用，從而能拚棄或降低附加成分引起的毒副作用，尤其適合高劑量、難溶性藥物的各種途徑給藥。④有一定的藥物控釋和靶向性。納米混懸劑粒徑較大時有一定的控釋作用，且通常能被動靶向到巨噬細胞系統(tǒng)，采用合適的修飾技術也可以實現(xiàn)主動靶向。 至今文獻報道中的藥物納米混懸劑有幾十種，其中包括一些中藥的難溶性成分，但是已批準上市的品種只有6個（1個注射劑，5個口服制劑），且沒有一個是以液體形式存在的。導致此種現(xiàn)象的因素有多方面，如制備工藝復雜、物理穩(wěn)定性差、有機溶劑殘留和傳統(tǒng)滅菌方法不適合等，其中物理穩(wěn)定性問題是納米混懸劑應用及產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。如申請人曾研究了羥基喜樹堿注射用納米混懸劑的穩(wěn)定性，在4℃下保存其粒徑僅能穩(wěn)定10天，即使冷凍干燥后也只能在4℃下放置6個月（Pu X, et al, 2009）；另外Nakarani等（Nakarani M, et al, 2010）制備的環(huán)孢素A納米混懸劑僅能穩(wěn)定3個月，而橙皮素納米混懸劑的原始粒徑只能維持30天（Mishra PR, et al, 2009）。因此，為了能夠制備出更加穩(wěn)定的納米混懸劑，開展納米混懸劑 物理穩(wěn)定性的基礎研究是極為必要的。 影響納米混懸劑穩(wěn)定性的影響因素有穩(wěn)定劑的穩(wěn)定作用、制備方法、藥物性質(zhì)等等，其中穩(wěn)定劑的穩(wěn)定作用是最重要的因素。目前已有的研究結果表明，穩(wěn)定劑對藥物分散體系的穩(wěn)定作用主要表現(xiàn)為以下3個方面：立體穩(wěn)定、靜電穩(wěn)定和靜電立體穩(wěn)定（Apte SP, et al, 2003），其中靜電立體穩(wěn)定對藥物分散體系的穩(wěn)定效果最好（Ain-Ai A, et al, 2003），這主要是因為靜電立體穩(wěn)定能同時提供立體位阻作用和靜電排斥作用，使粒子間有足夠大的排斥力，從而阻止粒子聚集。另外人們從各種納米粒的穩(wěn)定性實驗中發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律：無論是立體穩(wěn)定還是靜電穩(wěn)定，作為藥物分散體系穩(wěn)定劑都必須一方面與藥物微粒有足夠強的親和力，以便能牢固地吸附在微粒表面上，使微粒表面被完全覆蓋；另一方面要對相鄰的微粒有足夠大的排斥力。此外，物質(zhì)分子之間的相親性通常遵循“相似相容原理”。因此，穩(wěn)定劑分子中必須具有與疏水性藥物微粒表面性質(zhì)相近的部分，以便能與藥物微粒表面產(chǎn)生較強的親和力。也就是說對于難溶性藥物來說，選擇帶有強疏水基團的穩(wěn)定劑能明顯提高納米混懸劑的制備成功率，但是不能保證長期穩(wěn)定性（Van Eerdenbrugh B, et al, 2009）。而為了使微粒之間產(chǎn)生足夠大的排斥力，對于立體穩(wěn)定劑分子來說，要求與溶劑有良好的親合性以便分子鏈充分伸展，形成厚的吸附層，保護微粒不聚集；對于靜電穩(wěn)定劑分子來說，要求必須帶有足夠量的電荷才能產(chǎn)生較強的靜電排斥力。另外，為了實現(xiàn)納米給藥系統(tǒng)中藥物的特異組織靶向性，靶向因子必須能穩(wěn)定而長期地結合在藥物納米粒的表面，以便最終實現(xiàn)定位導向作用，而這些目標的實現(xiàn)也要求納米給藥系統(tǒng)有一個穩(wěn)定而堅固的結構。 隨著分子生物學和生物藥劑學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)藥物的跨膜轉運雖然以自由擴散方式為主，但是載體蛋白轉運在藥物的體內(nèi)吸收、轉運、分布、排泄過程也起著重要作用，尤其是對抗腫瘤藥物的吸收與體內(nèi)組織分布影響重大，主要表現(xiàn)在限制抗腫瘤藥物的口服吸收和細胞外排。目前常用的逆轉轉運蛋白引起的抗腫瘤藥物口服吸收差和腫瘤細胞外排的策略有使用納米粒給藥系統(tǒng)、抑制細胞外排的藥物和高分子賦形劑等。近年來人們發(fā)現(xiàn)TPGS是一種應用前景非常好的生物材料，它具有良好的吸收促進作用和抗多藥耐藥作用，尤其是對ABC轉運蛋白有較強的、制作用。TPGS本身也是一種兩親性共聚物，還具有較強的乳化能力，因此將其作為納米混懸劑的輔助穩(wěn)定劑，將會起到錦上添花的作用。 因此，設計一種立體穩(wěn)定和靜電穩(wěn)定一體化的穩(wěn)定劑并應用于新型納米混懸劑的制備將是一項具有重要意義的工作 ，若能對這種新型納米混懸劑進行靶向性修飾，實現(xiàn)納米混懸劑的釋藥定向化，同時合并抑制轉運蛋白的外排作用，這將使納米混懸劑的研究事半功倍。到目前為止，國家自然科學基金委已資助的科研項目中，有關納米混懸劑的研究有2項，其中 關于穩(wěn)定性和抑制藥物外排的研究各1項。但尚未見到有關報道立體穩(wěn)定、靜電穩(wěn)定和靶向釋藥多功能一體化的穩(wěn)定劑的設計和合成的研究，更未見到將納米混懸劑的穩(wěn)定性、靶向性和抑制藥物外排進行協(xié)同研究的報道?？梢灶A見，如果能夠利用兩親性共聚物雙親性，設計一種靶向修飾的兩親性荷電共聚物，并用其結合抑制藥物外排技術制備納米混懸劑，協(xié)同研究納米混懸劑的穩(wěn)定機理、靶向作用和抑制藥物外排作用，將是此研究領域中的一個里程碑。 目前，人們對兩親性共聚物研究亦是方興未艾，而且兩親性共聚物的種類、結構也層出不窮。其中可生物降解的聚氨基酸化合物近年來一直是人們研究的熱點。它具有良好的生物相容性、對生物體無毒、無副作用，并可以通過體內(nèi)的水解或酶解反應最終降解為小分子的氨基酸，被人體吸收或排出體外等優(yōu)點（Rypacek F, et al, 1998）。因此，聚氨基酸化合物被廣泛的用于醫(yī)藥領域，如藥物緩控釋體系等方面。 在以前的報道中，均聚氨基酸一般作為疏水性鏈段和其他親水性聚合物鏈段一起構成雙親性的嵌段共聚物。人工合成的聚氨基酸的共聚物多是非嵌段的共聚物，嵌段共聚氨基酸的報道很少。如近年來國內(nèi)外科學家所研究的聚氨基酸類兩親性嵌段共聚物（Poly(amino acid)s amphiphilic block copolymer，簡稱“PAA-ABC”）主要有（張國林, et al, 2006; Lee ES, et al, 2003; 王勇, et al, 2009; 王書峰, et al, 2006; Prompruk K, et al, 2005）：聚乙二醇-聚氨基酸類嵌段共聚物、聚谷氨酸-聚丙氨酸嵌段共聚物、聚谷氨酸-聚亮氨酸嵌段共聚物、聚天冬氨酸丙酯-聚天冬氨酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚天冬氨酸/苯丙氨酸嵌段共聚物等。如果將其作為納米混懸劑的穩(wěn)定劑，PAA-ABC的疏水段可以吸附于納米粒表面，或插入納米粒子中，而親水端圍繞在納米粒周圍伸展到水中，形成強親水性的外殼，將納米粒核即純藥物粒子包裹在中央形成核-殼結構（結構見圖1）。這種緊密而牢固的結構，為納米混懸劑的靶向性修飾提供了堅實的平臺，另外再聯(lián)合TPGS，使其結構更加牢固，而且能賦予納米混懸劑促吸收、抑制細胞外排的作用，使納米混懸劑的研究邁向多功能化領域。 迄今為止，F(xiàn)DA已經(jīng)批準了6個納米結晶產(chǎn)品上市，并且有多個品種處于臨床研究階段。但是由于穩(wěn)定性問題，很多藥物的納米混懸劑仍不能被開發(fā)上市。目前文獻中已報道的藥物納米混懸劑有四、五十種（Pu X, et al, 2009），其中只有少數(shù)穩(wěn)定性好，而大部分穩(wěn)定性較差。針對這種穩(wěn)定性的問題目前研究得還不夠深入，研究納米混懸劑的穩(wěn)定機制有助于深入、徹底地理解不同穩(wěn)定劑對不同藥物的穩(wěn)定機理。另外，申請人至今還未見到納米混懸劑靶向性修飾研究的報道，它的抑制細胞外排作用研究更是一片空白。 圖1 核-殼式納米混懸劑的結構 目前僅有三個課題組（Ain-Ai A, et al, 2008; Van Eerdenbrugh B, et al, 2009; Raghavan SL, et al, 2001）對納米混懸劑穩(wěn)定性與穩(wěn)定劑性質(zhì)和藥物性質(zhì)之間存在的潛在關系做出了推測，如闡述了立體穩(wěn)定、靜電穩(wěn)定的作用效力，穩(wěn)定劑與納米粒之間可能存在的作用力，以及穩(wěn)定劑的粘度、疏水性、藥物分子的疏水性等因素與穩(wěn)定性之間的定性關系，提出了納米混懸劑的穩(wěn)定規(guī)律。但是，該類研究沒有涉及到納米混懸劑的具體穩(wěn)定機制，也沒有深入探究穩(wěn)定劑和藥物的性質(zhì)與穩(wěn)定性之間的量化關系，更沒有充分考慮穩(wěn)定劑對藥物和溶劑的雙向親和性以及空間穩(wěn)定與靜電穩(wěn)定結合的牢固性對穩(wěn)定性的影響。因此，該類研究略顯膚淺、不夠全面。總之，納米混懸劑的穩(wěn)定機制研究是藥劑科學家們亟待開展的工作，而這一工作的順利進行將有利于促進納米混懸劑長遠發(fā)展和大力推廣。 結合申請人及課題組的研究基礎、工作條件和其他納米粒的相關報道（苗先烽, et al, 2008; Yukishige K, et al, 1995），本課題擬以PAA-ABC和納米混懸劑的穩(wěn)定性為研究對象，深入開展納米混懸劑的穩(wěn)定機制研究。即合理設計聚氨基酸類兩親性共聚物的化學組成和結構，從分子水平上調(diào)整兩親性共聚物的結構和性能。通過考察不同化學組成、結構的聚氨基酸類兩親性共聚物的疏水相親性，其疏水相親性與納米混懸劑的穩(wěn)定性的定性定量關系，溶液pH值影響納米粒的zeta電位、穩(wěn)定性的規(guī)律，揭示聚氨基酸類兩親性共聚物對納米粒的吸附及穩(wěn)定的作用機制，為深入研究納米混懸劑的穩(wěn)定機理邁出關鍵的一步。同時，利用這種新型納米混懸劑具有的穩(wěn)定性良好的核殼結構，并結合TPGS的乳化作用、促吸收作用和抗多藥耐藥作用，制備出一種多功能的促透膜納米晶給藥體系，也為納米混懸劑的基礎研究和開發(fā)應用提供可靠的理論依據(jù)和新思路。 二、已具備的條件（含已具備的知識、技能、特長、實驗條件、研究基礎等） 我校是河南省重點建設高校，2008年跨入省部共建高校行列，擁有棉花生物學國家重點實驗室、特殊功能材料教育部重點實驗室、植物逆境生物學教育部重點實驗室和河南省納米材料工程技術中心等多個國家級或省級重點科研機構。河南大學藥學院具有河南省重點學科——藥劑學、河南省醫(yī)學重點學科——藥效學以及河南省重點實驗室——天然藥物化學和遺傳工程實驗室，是河南大學重點建設學院?？蒲袃x器方面，藥學院擁有多種先進儀器，如粒度測定儀、Zeta電位測定儀、熒光光度計、高速分散勻質(zhì)機、高壓勻質(zhì)機和低溫超高速離心機等現(xiàn)代化測試儀器。此外還有旋轉蒸發(fā)儀、凍干機、真空干燥機等常用設備。 申請人將以河南大學藥學院和特種功能材料教育部重點實驗室為工作平臺開展本項目的研究工作。這個平臺擁有多種先進的現(xiàn)代高分子材料分析設備，如接觸角測定儀、SEM、DSC、TEM、熒光顯微鏡、XPS及AFM等。河南大學校內(nèi)還擁有NMR，紅外光譜，質(zhì)譜儀，凝膠滲透色譜等化合物表征儀器。以上實驗條件將為本項目研究工作的順利完成提供便利和保障。 總之，我們已具備進行本項研究的各項實驗條件。 三、項目實施方案及進度安排（按月份列出） （1） PAA-ABC的結構設計和制備： 以L-苯丙氨酸、L-精氨酸為單體，采用原子轉移自由基聚合法，選擇適當?shù)囊l(fā)劑引發(fā)苯丙氨酸-亞酰胺（Phe-NCA）、二硝基苯基精氨酸-NCA（DNP-Arg-NCA）自聚，再經(jīng)催化氫化法脫二硝基苯基而成聚苯丙氨酸-聚精氨酸兩親性嵌段共聚物（PPhe-PArg）。在室溫下，用三光氣法分別制備Phe-NCA、DNP-Arg-NCA，選擇引發(fā)劑bipyNi(COD)引發(fā)原子轉移自由基聚合Phe-NCA形成PPhe-Ni，再由PPhe-Ni引發(fā)DNP-Arg-NCA聚合成PPhe-P(DNP-Arg)，再脫二硝基苯基而成PPhe-PArg。通過控制反應的時間來控制聚合物的分子量分布；通過控制反應體系中引發(fā)劑與單體的比例來調(diào)整生成聚合物ML/MH。 （2） 采用紅外光譜、NMR、凝膠滲透色譜測定共聚物的化學組成、結構與分子量（或ML/MH）；液體表面張力計、熒光探針法、接觸角測定儀和油水分配系數(shù)法表征共聚物的CMC及其疏水段的疏水性；zeta電位測定儀測定不同pH值溶液中共聚物的荷電量。 （3） 以伊曲康唑和紫杉醇等不同性質(zhì)的難溶性藥為模型藥物，采用微沉淀-自組裝法制備以不同穩(wěn)定劑穩(wěn)定的納米混懸劑。通過TEM、SEM表征納米混懸劑的粒徑、結構特征，用粒度測定儀、zeta電位測定儀等手段表征納米混懸劑的粒徑、荷電量，原子力顯微鏡（AFM）、差示掃描量熱-失重分析（DSC-TG）、X-射線光電子能譜（XPS）等手段表征穩(wěn)定劑對納米粒的吸附力與吸附狀態(tài)。以羥基喜樹堿納米混懸劑為研究對象，考察不同化學組成和結構的共聚物及溶液pH值對納米混懸劑物理穩(wěn)定性的影響；同時以與納米藥物具有強相互作用的共聚物為穩(wěn)定劑，考察藥物性質(zhì)對納米混懸劑物理穩(wěn)定性的影響。其中物理穩(wěn)定性的評價可以通過加速試驗和長期試驗，研究納米混懸劑的物理穩(wěn)定性。穩(wěn)定性研究過程中，肉眼觀察納米混懸劑的外觀變化；借助光學顯微鏡觀察納米混懸劑內(nèi)部個別微米級粒子的結晶尺度及形態(tài)變化；應用粒度測定儀定量研究納米混懸劑的粒度分布變化，如不同溫度、濕度及pH環(huán)境貯存時粒度分布變化；并采用小杯法研究放置時間、溫度、濕度及pH環(huán)境對藥物釋放速度的影響，高效液相色譜法研究在不同條件下藥物的化學穩(wěn)定性。 （4） 選擇共聚物的ML/MH、疏水段的疏水性、CMC及zeta電位等參數(shù)作為評價穩(wěn)定劑性質(zhì)的標準；同時查詢或測定藥物的氫鍵供體、氫鍵受體、熔點和油水分配系數(shù)等分子性質(zhì)參數(shù)；以粒徑變化規(guī)律、藥物釋放速率變化趨勢和藥物化學穩(wěn)定性為橋梁，通過SPSS軟件建立穩(wěn)定劑性能參數(shù)、藥物性質(zhì)參數(shù)與納米粒穩(wěn)定性之間的定性關系，同時以納 米粒和穩(wěn)定劑的吸附力為紐帶，由SPSS軟件確定穩(wěn)定劑性能參數(shù)、藥物性質(zhì)及zeta電位與納米混懸劑的粒度分布變化率和藥物釋放速率之間的定量關系。 （5） 以羥基喜樹堿為模型藥物，優(yōu)選一種理想的共聚物，通過葉酸活性酯與共聚物中聚精氨酸段上的呱基反應，將葉酸與共聚物偶聯(lián)，獲得靶向修飾的共聚物材料。采用微沉淀-自組裝技術制備納米混懸劑，并采用TEM、SEM、粒度測定儀、zeta電位測定儀、AFM、DSC、XPS等技術進行制劑學和穩(wěn)定作用力表征。運用敏感腫瘤細胞珠（如MCF-7）和多藥耐藥細胞株（如MCF-7/Adr）進行體外細胞攝取和抗腫瘤活性實驗，研究其藥物外排抑制作用。最后采用裸鼠在體腫瘤組織分布實驗和熒光示蹤技術研究其靶向性。 本項目分三年完成，具體的年度研究計劃及預測進展如下： （1） 2013年1月－2013年12月：進行文獻調(diào)研，原材料準備。開展PAA-ABC的制備、表征，優(yōu)化制備條件，調(diào)控PAA-ABC的化學組成和結構。 （2） 2014年1月－2014年12月：開始納米混懸劑的制備及制劑學性質(zhì)的評價?？偨Y前期成果，分析聚合物化學組成和結構、藥物性質(zhì)－納米粒穩(wěn)定性的定性定量關系。期間擬參加國際或國內(nèi)學術會議一次，并邀請國內(nèi)同行專家進行學術交流一次。 （3） 2015年1月－2015年12月：制備促透性靶向納米晶給藥體系，評價其制劑學性質(zhì)、抑制藥物外排作用和特定組織靶向性。 四、項目經(jīng)費預算及用途 序號 經(jīng)費科目 經(jīng)費預算（元） 預算依據(jù) 1 2 3 4 5 6 7 8 合 計（元） 五、預期成果（包括成果形式、數(shù)量、水平及效益） (1) 預期該項目完成后，制備出3-4種結構新穎、生物相容性好和穩(wěn)定作用強的PAA-ABC，掌握PAA-ABC的制備、結構調(diào)控方法，理清PAA-ABC的化學組成、結構與其疏水親和力之間的關系。 (2) 建立PAA-ABC的化學組成、結構與納米混懸劑穩(wěn)定性之間的關系，制備出促透性靶向納米晶給藥體系，實現(xiàn)納米混懸劑的多功能化； (3) 可在國內(nèi)、外有影響的雜志上發(fā)表學術論文5~7篇，其中SCI至少3-5篇；申報國家發(fā)明專利1-2項；培養(yǎng)3-5名碩士研究生。 六、指導教師意見 指導簽字： 年 月 日 七、學院意見 學院主管領導簽字： 年 月 日 學院蓋章： 八、學校評審專家組意見 組長簽字： 年 月 日 九、學校創(chuàng)新性實驗計劃領導組意見 領導簽字： 年 月 日 蓋章：