食品中玉米赤霉烯酮的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法（KJ201913）

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附件13 食品中玉米赤霉烯酮快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法 (KJ201913) 1. 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)膠體金免疫層析法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用玉米、小麥及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速篩選測(cè)定。 第一法 比色法 2. 原理 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測(cè)線（T線）上的抗原結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過(guò)檢測(cè)線（T線）與控制線（C線）顏色深淺的比較，對(duì)樣品中玉米赤霉烯酮進(jìn)行結(jié)果判定。 3. 試劑及材料 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 3.1. 試劑 3.1.1. 乙腈。 3.1.2. 甲醇+水（7+3，體積比）。 3.1.3. 稀釋緩沖液（膠體金免疫層析檢測(cè)試劑盒專用提取液或根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明書配置）。 3.2. 參考物質(zhì) 玉米赤霉烯酮的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見(jiàn)表1，純度≥95%。 表1 玉米赤霉烯酮參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號(hào) 分子式 相對(duì)分子量 玉米赤霉烯酮 Zearalenone 17924-92-4 C18H22O5 318.36 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 3.3.1. 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。﹣18 ℃避光保存，有效期6個(gè)月。 3.3.2. 標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）（3.3.1）100 μL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 μ稀/mL的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，2 ℃～8 ℃避光保存，有效期1個(gè)月。 3.4. 材料 玉米赤霉烯酮膠體金免疫層析試劑盒，適用基質(zhì)為玉米、小麥及其碾磨加工品。 4. 儀器和設(shè)備 4.1. 移液器：100 μL、200 μL、1 mL和5 mL。 4.2. 旋渦混合器。 4.3. 離心機(jī)。 4.4. 電子天平：感量為0.01 g。 5. 環(huán)境條件 環(huán)境溫度：20 ℃～30 ℃。 空氣相對(duì)濕度：最佳測(cè)定濕度45 %～65 %。若濕度低于45 %，相應(yīng)延長(zhǎng)待測(cè)液-試紙條反應(yīng)時(shí)間，以質(zhì)控實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)；若濕度為65 %～80 %，微孔與試紙條拆開(kāi)后立即使用，避免微孔與試紙條長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中受潮；避免在濕度80 %以上濕度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 6. 分析步驟 6.1. 試樣制備 按GB 5491扦取的樣品充分碾磨或粉碎混勻，過(guò)40目篩。 6.2. 提取 準(zhǔn)確稱取試樣5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL 甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3 min，離心分層或靜置分層，上清液備用。 準(zhǔn)確移取0.8 mL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5 mL離心管中，加入25 μL上清液，混勻，待檢。 6.3. 測(cè)定步驟 依檢驗(yàn)所需，取相應(yīng)數(shù)量的金標(biāo)微孔和試紙條，做好標(biāo)記。吸取待檢液200 μL于金標(biāo)微孔中，抽吸至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，孵育10 min。將試紙條插入金標(biāo)微孔中，反應(yīng)3 min～5 min。 從金標(biāo)微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，觀察顯色情況，進(jìn)行結(jié)果判定。（若試劑盒冷藏保存，使用前需恢復(fù)至實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度。） 7. 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn)，可根據(jù)檢測(cè)樣品量制定適宜頻次的質(zhì)控試驗(yàn)。 7.1. 空白試驗(yàn) 7.1.1. 試劑空白試驗(yàn)：除不稱取試樣外，均按6.2和6.3所述步驟操作。 7.1.2. 基質(zhì)空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取空白試樣，按6.2和6.3所述步驟操作。 7.2. 陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60 μg/kg的質(zhì)控樣，按6.2和6.3步驟操作。或準(zhǔn)確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60 μg/kg，按6.2和6.3步驟操作。 8. 結(jié)果判定 通過(guò)對(duì)比控制C線和檢測(cè)T線的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。 8.1. 無(wú)效結(jié)果 無(wú)論樣品中有無(wú)玉米赤霉烯酮存在，控制C線均會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。若C線未顯色，表明操作不正確或試紙條已失效，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效（見(jiàn)圖1）。 無(wú)效 圖1 試紙條目視判定圖 8.2. 陽(yáng)性結(jié)果 控制C線顯色，檢測(cè)T線顯色比C線淺或者沒(méi)有顏色，判定為陽(yáng)性（見(jiàn)圖2）。 8.3. 陰性結(jié)果 控制C線顯色，檢測(cè)T線顯色比C線深或者一致，判定為陰性（見(jiàn)圖2）。 比色法 圖2 試紙條目視判定圖 8.4. 質(zhì)控試驗(yàn)要求 空白試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性，陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。  第二法 消線法 9. 原理 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測(cè)線（T線）上的抗原結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過(guò)T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。 10. 試劑及材料 同3。 11. 儀器和設(shè)備 同4。 12. 環(huán)境條件 環(huán)境溫度：10 ℃～40 ℃。 空氣相對(duì)濕度：同5。 13. 分析步驟 13.1. 試樣制備 同6.1。 13.2. 提取 準(zhǔn)確稱取試樣5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入12.5 mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3 min，離心分層或靜置分層，上清液備用。 準(zhǔn)確移取400 μL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5 mL離心管中，加入上清液(小麥50 μL，玉米80 μL），混勻，待測(cè)。 13.3. 測(cè)定步驟 同6.3。 14. 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn)，可根據(jù)檢測(cè)樣品量制定適宜頻次的質(zhì)控試驗(yàn)。 14.1. 空白試驗(yàn) 14.1.1. 試劑空白試驗(yàn)：除不稱取試樣外，均按13.2和13.3所述步驟操作。 14.1.2. 基質(zhì)空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取空白試樣，按13.2和13.3所述步驟操作。 14.2. 陽(yáng)性質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60 μg/kg的質(zhì)控樣，按13.2和13.3步驟操作。或準(zhǔn)確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60 μg/kg，按13.2和13.3步驟操作。 15. 結(jié)果判定 通過(guò)觀察檢測(cè)T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。 15.1. 無(wú)效 同8.1 15.2. 陽(yáng)性結(jié)果 控制C線顯色，檢測(cè)T線不顯色，判定為陽(yáng)性（見(jiàn)圖3）。 15.3. 陰性結(jié)果 控制C線顯色，檢測(cè)T線顯色，判定為陰性（見(jiàn)圖3）。 消線法 圖3 試紙條目視判定圖 16. 質(zhì)控試驗(yàn)要求 同8.4 第三法 讀數(shù)儀法 17. 具體檢測(cè)步驟及結(jié)果判定可參考相應(yīng)的說(shuō)明書操作，質(zhì)控試驗(yàn)參照第一法與第二法。 18. 結(jié)論 本方法篩查出的陽(yáng)性樣品進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，應(yīng)按GB 2761指定方法標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)并判定。 19. 性能指標(biāo) 19.1. 檢出限 60 μg/kg。 19.2. 靈敏度 靈敏度≥95%。 19.3. 特異性 特異性≥90%。 19.4. 假陰性 假陰性≤5%。 19.5. 假陽(yáng)性 假陽(yáng)性≤10%。 注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄A。 20. 其他 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為了方便方法使用者，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)時(shí)方可使用。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB 5009.209-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定。 附錄A 快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表 樣品情況a 檢測(cè)結(jié)果b 總數(shù) 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N21 N.2=N12+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異（c2） c2=（N12-N21-1）2/（N12+N21）， 自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽(yáng)性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對(duì)準(zhǔn)確度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果； b由玉米赤霉烯酮膠體金試紙條檢驗(yàn)方法得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。 本方法起草單位：成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院。 本方法參與單位：江南大學(xué)、國(guó)家糧食局科學(xué)研究院、廣東省食品檢驗(yàn)所、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院。 本方法主要起草人：肖全偉、姚蕾珺、王昕、張敏、胥傳來(lái)、田洪蕓、沈泓、周露 — END —