飼草中主要農藥殘留及真菌毒素的測定　第2部分：飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測定　液相色譜-串聯質譜法

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ICS65.120 B 25 DB37 山東省地方標準 DB37/T XXXXX—XXXX 飼草中主要農藥殘留及真菌毒素的測定　第2部分：飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測定　液相色譜-串聯質譜法 Determination of main pesticide residues and mycotoxin in fodder grass—Part2：Determination of deoxynivalenol and zearalenone in fodder grassby high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry XXXX - XX - XX發(fā)布 XXXX - XX - XX實施 山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布 DB37/T XXXXX—XXXX 前言 DB37/T 《飼草中主要農藥殘留及真菌毒素的測定》分為三個部分： ——第1部分：飼草中10種殺蟲劑農藥殘留量的測定　氣相色譜-串聯質譜法； ——第2部分：飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測定　液相色譜-串聯質譜法； ——第3部分：飼草中伏馬毒素的測定方法　液相色譜-串聯質譜法。 本部分為DB37/T 的第2部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。 本部分由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。 本部分由山東省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。 本部分起草單位：山東省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所。 本部分主要起草人：鄧立剛、李霞、李增梅、王峰恩、官帥、陳璐、楊琳琳、李香。 5 飼草中主要農藥殘留及真菌毒素的測定　第2部分：飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測定　液相色譜-串聯質譜法 警示：整個分析操作過程應在指定區(qū)域內進行。該區(qū)域應避光(陽光)，具備相對獨立的操作臺和廢棄物存放裝置。在整個實驗過程中，操作者應按照接觸劇毒物的要求采取相應的保護措施。 1　 范圍 本標準規(guī)定了飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的液相色譜-串聯質譜測定方法。 本標準適用于飼草中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的測定。 本方法檢出限：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為10 μg/kg和玉米赤霉烯酮為5 μg/kg；定量限：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為25 μg/kg和玉米赤霉烯酮為10 μg/kg。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682　分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法 3　 原理 試樣經乙腈-甲酸水溶液提取，經QuEChERS萃取包凈化后，氮氣吹干，甲醇-水溶液復溶，液相色譜分離，串聯質譜檢測，內標法定量。 4　 試劑或材料 除非另有說明，僅使用分析純試劑，水符合GB/T 6682一級水的規(guī)定。 4.1　 甲醇：色譜純。 4.2　 甲酸：色譜純。 4.3　 乙腈：色譜純。 4.4　 提取液：準確量取乙腈（4.3）800 mL，加入甲酸（4.2）10 mL，用水定容至1 000 mL。 4.5　 甲醇溶液：量取甲醇（4.1）100 mL，加入水100 mL，混勻，備用。 4.6　 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，C15H20O6，CAS：51481 - 10 - 8）標準溶液：100 μg/mL。 4.7　 玉米赤霉烯酮（ZEN，C18H22O5，CAS：17924 - 92 - 408）標準溶液：100 μg/mL。 4.8　 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素內標（13C15-DON，13C15H20O6）溶液：25 μg/mL。 4.9　 混合標準中間液溶液：準確吸取1.0 mL脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液（4.6）和0.1 mL玉米赤霉烯酮標準溶液（4.7）于10 mL容量瓶中，用水定容，此時脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃度為10 μg/mL，玉米赤霉烯酮濃度為1 μg/mL，于-20 ℃冰箱保存。 4.10　 同位素內標溶液：準確吸取1.0 mL脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素標準溶液（4.8）于10 mL容量瓶中，用水定容，此時濃度為2.5 μg/mL，于-20 ℃冰箱保存。 4.11　 QuEChERS鹽包：4.0 g硫酸鎂，1.0 g氯化鈉，1.0 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物。 4.12　 微孔濾膜：有機相，0.22 μm。 5　 儀器設備 5.1　 液相色譜—三重四級桿質譜聯用儀：配電噴霧離子源（ESI源）。 5.2　 分析天平：感量0.01 g。 5.3　 離心機：轉速不低于8 000 r/min。 5.4　 氮吹儀，可控溫。 5.5　 粉碎機。 5.6　 渦旋混合器。 5.7　 恒溫振蕩器。 6　 試樣的制備 樣品粉碎后充分混勻，于–18 ℃下保存。 7　 測定步驟 7.1　 前處理 準確稱取平行試樣，干樣2 g或鮮樣5 g于50 mL離心管中，加入20 mL提取液（4.4），渦旋混勻后于恒溫振蕩器中振蕩30 min；加入QuEChERS鹽包（4.11），渦旋2 min，充分混勻，8 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液，加20 μL同位素內標溶液（4.10），置于40 ℃水浴中氮吹至近干；用甲醇溶液（4.5）復溶，定容至0.5 mL，旋渦振蕩1 min，過微孔濾膜（4.12），用于測定。 7.2　 測定 7.2.1　 液相色譜參考條件 液相色譜參考條件如下： a) 色譜柱：C18色譜柱，柱長100 mm，柱內徑2.1 mm，顆粒內徑1.7?μm，或性能相當者； b) 流動相：0.1 %甲酸溶液（流動相A），乙腈（流動相B）； c) 流速：0.3 mL/min； d) 進樣量：2.0 μL； e) 柱溫：40 ℃； f) 流動相及梯度洗脫條件見表1。 表1　 流動相梯度洗脫條件 時間 min 流動相A 流動相B 0 90 10 0.2 90 10 2.0 10 90 4.0 10 90 4.5 90 10 7.0 90 10 7.2.2　 質譜參考條件 質譜參考條件如下： a) 離子源：電噴霧離子源( ESI+）； b) 毛細管電壓：3.5 KV； c) 離子源溫度：120 ℃； d) 脫溶劑氣溫度：500 ℃； e) 掃描模式：正離子； f) 監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測（MRM），監(jiān)測條件見表2。 表2　 多反應監(jiān)測（MRM）條件 化合物 名稱 母離子 m/z 錐孔電壓 V 定量離子 m/z 碰撞能量 eV 定性離子m/z 碰撞能量 eV DON 297.1 30 249.1 10 203.1 16 ZEN 319.1 20 283.1 19 187.1 11 13C15-DON 312.0 30 263.0 16 — — 7.2.3　 標準曲線的繪制 準確吸取適量混合標準溶液和同位素內標溶液，用甲醇水溶液(4.5)配制成10?μg/L、20?μg/L、50?μg/L、100?μg/L、200?μg/L和500?μg/L混合標準溶液系列，其中同位素內標溶液濃度為100?μg/L，上機測定，繪制標準曲線。 7.3　 定性及定量 7.3.1　 定性測定 通過試樣色譜圖的特征離子與相應對照溶液各色譜峰的特征離子相對照定性。試樣與標準品保留時間的相對誤差不大于2.5 %；試樣特征離子的相對離子豐度與標準品特征離子的相對離子豐度一致，相對離子豐度偏差不超過表3的規(guī)定，則可判斷試樣中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮。 表3　 定性確證時相對離子豐度的最大允許誤差 相對離子豐度 ＞50 % ＞20 %～50 %（含） ＞10 %～20 %（含） ≤10 % 允許的相對偏差 20 25 30 50 7.3.2　 定量 外標法定量。 7.4　 試樣溶液的測定 將基質標準工作溶液和試樣溶液依次注入液相色譜—質譜聯用儀中，保留時間和定性離子定性，測定定量離子峰面積，待測樣液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的響應值應在儀器檢測的定量測定線性范圍之內，超過線性范圍時應根據測定濃度進行適當倍數稀釋后再進行分析。 7.5　 空白試驗 除不加試料外，按照7.1～7.4規(guī)定進行平行操作。 8　 分析結果的表述 試料中被測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮殘留量以質量分數ω計，單位以微克每千克（μg/kg）表示，按公式（1）計算： (1) 式中： ——試料中被測物殘留量，單位為微克每千克（μg/kg）； ——從基質混合標準曲線上得到的樣液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的質量濃度，單 位為微克每升（μg/L）； V1 ——樣品提取液體積，單位為毫升（mL）； V2 ——待濃縮的上清液體積，單位為毫升（mL）； V3 ——試樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）； m ——試料的質量，單位為克（g）。 計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，結果保留三位有效數字。 9　 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不大于這兩個測定值的算數平均值的15 %。 A A 附　錄　A （資料性附錄） 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其同位素內標和玉米赤霉烯酮特征離子質量色譜圖 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮特征離子質量色譜圖見圖1。 圖A.1　 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮液相色譜-串聯質譜多反應監(jiān)測色譜圖（標準溶液濃度為：20?μg/L） _________________________________