DBS43 005-2013 水產(chǎn)品中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留量測(cè)定 高效液相色譜法.doc

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SN××/T ××××—×××× 湖南省衛(wèi)生廳 發(fā)布 2013-12-01實(shí)施 2013-10-01發(fā)布 水產(chǎn)品中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留量測(cè)定 高效液相色譜法 DBS 43/005—2013 湖南省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) I DBS 43/ 005—2013 前言 本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。 3 水產(chǎn)品中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留量測(cè)定 高效液相色譜法 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了新鮮及冷凍水產(chǎn)品中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留量的高效液相色譜測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于新鮮及冷凍水產(chǎn)品可食部分氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留量的測(cè)定。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 3　 方法提要 采用酸性水溶液提取試樣中待測(cè)物，經(jīng)固相萃取柱凈化，用帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。 4　 試劑和材料 除另有說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。 4.1　 乙腈:色譜純。 4.2　 甲醇:色譜純。 4.3　 磷酸：優(yōu)級(jí)純。 4.5 四丁基溴化銨。 4.6 7 mmol/L四丁基溴化銨（pH 3.0，pH 2.0，pH 1.0）：稱取2.26 g四丁基溴化銨，溶解于1 L水中。用適量磷酸調(diào)pH至所需的值。 4.7 5%甲醇水溶液：取5.0mL甲醇加水稀釋到100 mL。 4.8 流動(dòng)相：乙腈+四丁基溴化銨溶液（7 mmol/L, pH 3.0）= 6+94 (V+V)。 4.9 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星，純度均高于98.0%。 4.10 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取10.0mg（精確到0.01 mg）氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈溶解，定容至100 mL，配制成濃度為 100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。4℃冰箱中冷藏避光保存，保存期不超過(guò)3個(gè)月。 4.11 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋，配制成濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。4℃冰箱中冷藏避光保存，保存期不超過(guò)一周。 4.12 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用流動(dòng)相稀釋,配制成2 μg/L、5 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、500 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。臨用前配制。 4.13 微孔濾膜：0.22 μm，有機(jī)相型。 4.14 Oasis HLB小柱：60 mg/3 mL，或者性能相當(dāng)者。 注：Oasis HLB是由Waters公司提供的產(chǎn)品商品名。給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不涉及商業(yè)目的。鼓勵(lì)標(biāo)準(zhǔn)使用者嘗試不同廠家或型號(hào)的固相萃取小柱。 5　 儀器和設(shè)備 5.1　 高效液相色譜儀，帶熒光檢測(cè)器。 5.2　 分析天平：感量 0.01 mg和 0.01 g。 5.3　 旋渦混勻器。 5.4　 離心機(jī): 5 000 r/min。 5.6 水浴超聲器。 5.7 氮吹儀。 5.8 離心管：50 mL。 5.9 玻璃試管：5 mL。 5.10 pH計(jì)。 5.11 固相萃取裝置。 6　 分析測(cè)定 6.1 樣品制備 冷凍樣品在進(jìn)行制備前，需拿出在常溫下回溫散凍。然后按照以下處理方法進(jìn)行樣品制備。所有樣品只取可食部分。 魚：去鱗、去皮，沿脊背取肌肉；蝦、蟹類：去頭、去殼、去腸線，取肌肉部分。樣品切成不大于0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm的小塊后,置于研磨機(jī)中研磨均勻。在制樣的操作過(guò)程中，應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。制備好的樣品置于-18℃保存。 6.2 提取 準(zhǔn)確稱取樣品(5±0.05)g,置于50 mL離心管中, 加入8.0 mL四丁基溴化銨溶液(7 mmol/L, pH 2.0)，渦旋混合1 min后，超聲提取20 min，再以5 000 r/min離心10 min。收集全部上清液于另一只干凈的離心管中。將殘?jiān)貜?fù)上述步驟提取一次。合并上清液，用四丁基溴化銨溶液(7 mmol/L, pH 2.0)定容至20.0mL，以5 000 r/min離心10 min，上清液待用。 6.3 凈化 固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL四丁基溴化銨溶液（7 mmol/L, pH 1.0）活化后，準(zhǔn)確移取上述上清液2.0 mL上樣。再依次用3mL四丁基溴化銨溶液（7 mmol/L, pH 1.0）、2 mL5%甲醇水淋洗，抽干。最后用3mL甲醇洗脫，收集洗脫液于小玻璃試管中，45℃下氮?dú)獯蹈?。?.0 mL流動(dòng)相溶解殘留物，渦旋混勻后,經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜分析。 6.4 高效液相色譜測(cè)定 6.4.1 參考色譜條件 色譜柱：Atlantic T3柱 (150×4.6 mm，粒徑5μm)，或其它等效柱。 流動(dòng)相：乙腈+四丁基溴化銨溶液（7 mmol/L, pH 3.0）= 6+94（v+v）。 流速：1 mL/min。 進(jìn)樣量：20 μL。 柱溫：40℃。 檢測(cè)波長(zhǎng)：氧氟沙星λex=283 nm, λem= 490 nm, 其余：λex=280 nm, λem= 450 nm。 6.4.2 測(cè)定 取適量樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液或空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按6.4.1列出的條件進(jìn)行液相色譜分析測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液或空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作單點(diǎn)或者多點(diǎn)校準(zhǔn)，并用色譜圖峰面積積分值定量，外標(biāo)法測(cè)定。樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各化合物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各化合物的液相色譜圖參見附錄A中圖A.1標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖，空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)物的液相色譜圖參見附錄A中圖A.2樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)液相色譜圖。 6.4.3 空白試驗(yàn) 除不加樣品外，均按照測(cè)定步驟進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。 7 結(jié)果計(jì)算和表述 樣品中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星或恩諾沙星的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按下式計(jì)算獲得： X——樣品中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星或恩諾沙星的含量（μg/kg）； A——樣品中相應(yīng)藥物的峰面積； As——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中相應(yīng)藥物的峰面積； Cs——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中相應(yīng)藥物的濃度（ng/mL）； V1——提取樣品所用提取液的總體積（mL）； V2——固相萃取凈化上樣的體積（mL）； V3——過(guò)柱后定容所用流動(dòng)相體積（mL）； m——供試樣品的質(zhì)量（g）。 測(cè)定結(jié)果用兩次平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。 8 方法線性范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度 8.1 線性范圍 各化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的線性范圍為2 μg/L~500 μg/L。 8.2 靈敏度 本方法各化合物的定量下限均為4 μg/kg。 8.3 準(zhǔn)確度 本方法在4 μg/kg、10 μg/kg、100 μg/kg、1000 μg/kg四個(gè)添加濃度的回收率如下：氧氟沙星73.4%~106.6%；諾氟沙星71.6%~99.0%；環(huán)丙沙星68.5%~92.8%；恩諾沙星70.9%~97.3%。 8.4 重復(fù)性 本方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%。 附錄A (資料性附錄) 高效液相色譜圖 圖A.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖 圖A.2 空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)液相色譜圖 注: 以上圖譜中，OFL為氧氟沙星、NOR為諾氟沙星、CIP為環(huán)丙沙星、ENR為恩諾沙星。 ——————————————