蛋白質(zhì)工程與食品工業(yè)ppt課件

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第五章蛋白質(zhì)工程與食品工業(yè) 概述 蛋白質(zhì)是對(duì)生命至關(guān)重要的一類生物大分子 各種生命功能 生命現(xiàn)象 生命活動(dòng)都和蛋白質(zhì)有關(guān) 在生命有機(jī)體催化 運(yùn)動(dòng) 結(jié)構(gòu) 識(shí)別和調(diào)節(jié)等許多方面 起著關(guān)鍵的作用 主要內(nèi)容 第一節(jié)蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu) 主要內(nèi)容 一 蛋白質(zhì)的功能 1 蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的重要物質(zhì)之一蛋白質(zhì)是一類重要而復(fù)雜的生物大分子 它廣泛地存在于所有生物界的機(jī)體之中 具有許多重要的作用 構(gòu)成生物體新陳代謝的幾乎全部的化學(xué)反應(yīng)都是在活性蛋白質(zhì) 酶的催化下進(jìn)行的 高等動(dòng)物的免疫反應(yīng) 也主要是通過(guò)蛋白質(zhì)即抗原和抗體來(lái)完成的 運(yùn)動(dòng)時(shí)的肌肉收縮靠的是某些蛋白質(zhì)的相互作用來(lái)完成的 運(yùn)輸氧和二氧化碳的是血紅蛋白 具有代謝和調(diào)節(jié)功能的是多種蛋白質(zhì)激素 一 蛋白質(zhì)的功能 2 蛋白質(zhì)的應(yīng)用 蛋白質(zhì)是人類賴以維持生命的重要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源之一 人們需要從各種肉 蛋 奶 豆類等主要食品中獲得所需的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng) 用蛋白質(zhì)診斷和治療某些疾病 淀粉酶 脂肪酶 蛋白酶用于幫助消化 治療某些消化不良性疾病 胰島素用于治療嚴(yán)重的糖尿病 轉(zhuǎn)氨酶作為肝病變的指標(biāo)等 食品工業(yè)和輕工業(yè)中主要應(yīng)用蛋白質(zhì)或利用蛋白質(zhì)的性質(zhì)制造各種產(chǎn)品 例如 釀造業(yè)要用蛋白酶來(lái)增加醬油的鮮味等 用于人類衣著的羊毛 紡織品和皮革主要組成是蛋白質(zhì) 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位氨基酸的基本結(jié)構(gòu) 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 各種氨基酸之間通過(guò)肽鍵彼此按直線形頭尾相連 構(gòu)成不同長(zhǎng)短的肽鏈 肽鍵就是由氨基酸的 羧基與相鄰的氨基酸的 氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵 肽鍵的形成 肽鍵的形成 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 肽 氨基酸通過(guò)肽鍵連結(jié)起來(lái)的化合物二肽 兩個(gè)氨基酸形成的肽三肽 三個(gè)氨基酸形成的肽多肽 許多氨基酸形成的肽蛋白質(zhì) 大多為100個(gè)以上氨基酸組成的多肽 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 多肽鏈的折疊可分為四種不同層次的結(jié)構(gòu) 一級(jí)結(jié)構(gòu) 僅指肽鏈中的氨基酸線型排列順序 不考慮空間的排列 牛胰島素的氨基酸序列 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu) 主鏈原子的局部空間排列 不包括側(cè)鏈構(gòu)象和與其他鏈段的相互關(guān)系 如 螺旋 折疊等主鏈構(gòu)象單元就是二級(jí)結(jié)構(gòu) 主要形式 螺旋 折疊 轉(zhuǎn)角 無(wú)規(guī)卷曲等 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)角 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 三級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步盤曲或折疊形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu) 碳酸酐酶的多肽骨架示意圖 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 四級(jí)結(jié)構(gòu) 具有二條或二條以上獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的蛋白質(zhì) 其多肽鏈間通過(guò)次級(jí)鍵相互組合而形成的空間結(jié)構(gòu) 血紅蛋白的結(jié)構(gòu) 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 1 氫鍵 氫原子與負(fù)電性強(qiáng)的原子 如氧 氮等 間形成 對(duì)蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的維護(hù)很重要 2 靜電引力 正負(fù)帶電基團(tuán)之間的吸引力 對(duì)蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的穩(wěn)定貢獻(xiàn)不是很大 也稱為離子鍵或鹽鍵 3 范德華力 原子團(tuán)相互接近時(shí)誘導(dǎo)所致 它變化多樣 對(duì)維持蛋白質(zhì)活性中心的構(gòu)象影響很大 二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 4 疏水相互作用 是非極性基團(tuán)為了避開(kāi)水相而群集在一起的作用力 疏水作用是維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要因素 5 二硫鍵 作用很強(qiáng) 對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象起重要作用氫鍵 離子鍵 疏水作用和范德華力等次級(jí)鍵是非共價(jià)鍵肽鍵 二硫鍵 酯鍵等被稱之為共價(jià)鍵 第二節(jié)蛋白質(zhì)工程的誕生 蛋白質(zhì)工程的誕生 1983年 美國(guó)生物學(xué)家額爾默首先提出了 蛋白質(zhì)工程 的概念 蛋白質(zhì)工程的實(shí)踐依據(jù)DNA指導(dǎo)合成蛋白質(zhì) 因此 人們可以根據(jù)需要對(duì)負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行重新設(shè)計(jì) 使合成出來(lái)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得符合人們的要求 蛋白質(zhì)工程的誕生 蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ) 利用基因工程的手段 按照人類自身的需要 定向地改造天然的蛋白質(zhì) 甚至創(chuàng)造新的 自然界本不存在的 具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)分子 蛋白質(zhì)工程是指通過(guò)生物技術(shù)手段對(duì)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或者對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造 以便獲的更適合人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的技術(shù) 蛋白質(zhì)工程的誕生 蛋白質(zhì)工程是指通過(guò)蛋白質(zhì)化學(xué) 蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動(dòng)力學(xué)的研究 獲取有關(guān)蛋白質(zhì)物理和化學(xué)等各方面的信息 在此基礎(chǔ)上利用生物技術(shù)手段對(duì)蛋白質(zhì)的DNA編碼序列進(jìn)行有目的的改造并分離 純化蛋白質(zhì) 從而獲取自然界沒(méi)有的 具有優(yōu)良性質(zhì)或適用于工業(yè)生產(chǎn)條件的全新蛋白質(zhì)的過(guò)程 蛋白質(zhì)工程的誕生 蛋白質(zhì)工程主要包括4大類研究 第一利用已知的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的信息開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究 第二定量確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系 這是目前蛋白質(zhì)工程研究的主體 它包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的建立 酶催化的性質(zhì) 蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究等 第三 從混雜變異體庫(kù)中篩選具有特定結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系的蛋白質(zhì) 第四 根據(jù)已知結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系的蛋白質(zhì) 用人工方法合成它及其變異體 第三節(jié)蛋白質(zhì)工程的基本步驟和保護(hù)方法 主要內(nèi)容 蛋白質(zhì)工程研究的主要步驟 分離純化目的蛋白 使之結(jié)晶并作X晶體衍射分析 結(jié)合核磁共振等其他方法的分析結(jié)果 得到其空間結(jié)構(gòu)的盡可能多的信息 對(duì)目的蛋白的功能作詳盡的研究 確定它的功能域 通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 空間結(jié)構(gòu)和功能之間的相互關(guān)系的分析 找出關(guān)鍵的基團(tuán)和結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)工程研究的主要步驟 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)上 借助于計(jì)算機(jī)圖像顯示和分子輔助設(shè)計(jì) 提出對(duì)目的蛋白分子的改建或構(gòu)建方案 并用基因工程的方法去實(shí)施 對(duì)經(jīng)過(guò)改造的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性測(cè)定 看看改造的效果如何 蛋白質(zhì)工程的改造方法 在基因水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造 按改造的規(guī)模和程度可以分為 初級(jí)改造 個(gè)別氨基酸的改變和一整段氨基酸序列的刪除 置換或插入高級(jí)改造 蛋白質(zhì)分子的剪裁 如結(jié)構(gòu)域的拼接從頭設(shè)計(jì)合成新型蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)工程的改造方法 初級(jí)改造 通過(guò)基因突變方法 以達(dá)到改變氨基酸進(jìn)而改造蛋白質(zhì)的目的 目前 主要采用的基因突變方法 基因定位突變盒式突變 蛋白質(zhì)工程的改造方法 初級(jí)改造 基因定位突變的基本過(guò)程 首先使目的基因由環(huán)狀載體折成單鏈 再對(duì)指定的位點(diǎn)用寡聚核苷酸誘導(dǎo)或置入合成的寡聚核苷酸產(chǎn)生定位突變基因 最后將突變基因?qū)脒m宜的表達(dá)系統(tǒng) 如大腸桿菌等 即可產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì) 這是目前定向改造蛋白質(zhì)的基本手段 蛋白質(zhì)工程的改造方法 初級(jí)改造 M13 DNA寡聚核苷酸介導(dǎo)誘變技術(shù) 將要改造的蛋白質(zhì)的目的基因插入到M13單鏈DNA中 將雜合DNA雙鏈再轉(zhuǎn)入大腸桿菌中 將含突變目的基因的M13噬菌體篩選出來(lái) 提取它們的DNA 用限制性內(nèi)切酶把突變目的基因切下 并重組到表達(dá)質(zhì)粒中 作為模板 以含有要改變的堿基的一段寡聚核苷酸作為引物 在體外用DNA聚合酶進(jìn)行雙鏈DNA的合成 用DNA連接酶連接成環(huán)狀 蛋白質(zhì)工程的改造方法 初級(jí)改造 M13 DNA寡聚核苷酸介導(dǎo)誘變技術(shù) 蛋白質(zhì)工程的改造方法 初級(jí)改造 盒式突變的基本過(guò)程 蛋白質(zhì)工程的改造方法 初級(jí)改造 盒式突變 蛋白質(zhì)工程的改造方法 高級(jí)改造 高級(jí)改造 蛋白質(zhì)分子的剪裁 如結(jié)構(gòu)域的拼接結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的一個(gè)層次 在較大的蛋白質(zhì)分子中 由于多肽鏈上相鄰的超二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系 形成二個(gè)或多個(gè)在空間上可以明顯區(qū)別它與蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)的區(qū)別 結(jié)構(gòu)域拼接是通過(guò)基因操作把位于兩種不同蛋白質(zhì)上的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起 形成融合蛋白 它兼有原來(lái)兩種蛋白的性質(zhì) 蛋白質(zhì)工程的改造方法 高級(jí)改造 用計(jì)算機(jī)分子模型軟件對(duì)金屬硫蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明 天然金屬硫蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間具有較大的獨(dú)立性 是可以拆分和構(gòu)建的 因而構(gòu)建 結(jié)構(gòu)域的 二倍體 的設(shè)想是可行的 用化學(xué)合成的方法分別合成結(jié)構(gòu)域和連接肽段的基因 并設(shè)法將它們拼接起來(lái) 再插入載體并轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中 使金屬硫蛋白的 結(jié)構(gòu)域多倍體基因在植物中表達(dá) 蛋白質(zhì)工程的改造方法 高級(jí)改造 蛋白質(zhì)工程的改造方法 合成新型蛋白質(zhì) 基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改造的蛋白質(zhì)工程可以優(yōu)化蛋白質(zhì)的活性 而全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是合成具有新奇的結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)工程的改造方法 合成新型蛋白質(zhì) 從頭設(shè)計(jì)一個(gè)蛋白質(zhì)的基本步驟 1 從已知三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選出一個(gè)合適的片段 進(jìn)行修改和組合 2 構(gòu)建一個(gè)多肽鏈骨架模型 3 依據(jù)氨基酸殘基的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)和排列的優(yōu)先順序 確定每個(gè)殘基位置上的氨基酸 4 優(yōu)化目標(biāo)蛋白的三維模型 5 檢驗(yàn)和考核所給定的目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否合理 對(duì)所設(shè)計(jì)的模型做進(jìn)一步修正 6 幾輪的設(shè)計(jì) 檢驗(yàn)和再設(shè)計(jì) 獲得一個(gè)正確折疊和帶有人們預(yù)期功能的目標(biāo)蛋白質(zhì) 第四節(jié)蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 在實(shí)際生產(chǎn)中 可以應(yīng)用蛋白質(zhì)工程對(duì)一些生產(chǎn)中重要酶或蛋白質(zhì)性質(zhì)加以改造 提高現(xiàn)有酶或蛋白質(zhì)的工業(yè)實(shí)用性 如提高酶的熱穩(wěn)定性 改變酶的最適pH值條件 提高酶的催化活性等 例如 通過(guò)引入二硫鍵 改善酶的熱穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)工程自問(wèn)世以來(lái) 短短十幾年的時(shí)間 已取得了引人矚目的進(jìn)展 在醫(yī)學(xué)和工業(yè)用酶方面也獲得了良好的應(yīng)用前景 提高蛋白的穩(wěn)定性包括以下幾個(gè)方面 延長(zhǎng)酶的半衰期 提高酶的熱穩(wěn)定性 延長(zhǎng)藥用蛋白的保存期 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失 蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 引入二硫鍵 改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性溶菌酶分子 由一條肽鏈構(gòu)成 并在空間上折疊形成二個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域 酶活性中心位于二個(gè)結(jié)構(gòu)域之間 該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個(gè)未形成二硫鍵的半胱氨酸由于二硫鍵是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的重要共價(jià)化學(xué)鍵 有如建筑所用的鋼筋一樣 因而能將分子中的不同部位牢固地聯(lián)結(jié)在一起 因此 提高酶熱穩(wěn)定性最常用的辦法是在分子中增加一對(duì)或數(shù)對(duì)二硫鍵 蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 轉(zhuǎn)化氨基酸殘基 改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性在高溫下Asn和Gln容易脫氨形成Asp和Glu 而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變 使蛋白質(zhì)失去活性 對(duì)釀酒酵母的磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造 這種酶有兩個(gè)相同的亞基 每個(gè)亞基含有2個(gè)Asn 由于它們都位于亞基之間的界面上 可能對(duì)酶的熱穩(wěn)定性起決定性作用 蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 通過(guò)寡核苷酸介導(dǎo)的定向誘變技術(shù) 將第14位和第78位上的2個(gè)Asn分別轉(zhuǎn)變成Thr 蘇氨酸 和Ile 異亮氨酸 殘基 大幅度提高突變酶的熱穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)工程在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用 牛胰島素的合成 我國(guó)人工合成的牛胰島素結(jié)晶 我國(guó)人工合成的牛胰島素結(jié)晶 Thankyou