2019高考生物大二輪復(fù)習(xí) 專題十六 基因工程和細(xì)胞工程學(xué)案.doc

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專題十六　基因工程和細(xì)胞工程 考點(diǎn) 考情 1．基因工程的誕生(Ⅰ) 2．基因工程的原理及技術(shù)(含PCR)(Ⅱ) 3．基因工程的應(yīng)用(Ⅱ) 4．蛋白質(zhì)工程(Ⅰ) 5．植物的組織培養(yǎng)(Ⅱ) 6．動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)與體細(xì)胞克隆(Ⅰ) 7．細(xì)胞融合與單克隆抗體(Ⅱ) 1．近五年的全國(guó)卷高考試題中對(duì)于基因工程的考查頻度較高，側(cè)重考查操作工具的種類、功能以及操作基本程序的應(yīng)用等。動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)中的核移植技術(shù)及單克隆抗體的制備也有所考查。 2．題目常借助簡(jiǎn)潔的文字材料或模式圖等考查有關(guān)基因工程、動(dòng)物細(xì)胞工程的原理、技術(shù)手段等，尤為注重對(duì)教材中一些關(guān)鍵詞的填充及對(duì)結(jié)論性語(yǔ)句的準(zhǔn)確表述等。 3．備考時(shí)，應(yīng)從以下四個(gè)方面入手復(fù)習(xí)： (1)列表比較法掌握限制酶、DNA連接酶和運(yùn)載體的作用。 (2)實(shí)例分析法理解基因工程的原理和過(guò)程。 (3)列表比較法理解兩個(gè)不同，即植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的不同、植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的不同。 (4)圖解法分析并掌握單克隆抗體制備過(guò)程。 H　 (1)質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且具有自我復(fù)制能力的很小的環(huán)狀DNA分子。(√) (2)DNA分子經(jīng)限制酶切割后產(chǎn)生的DNA片段末端一定是黏性末端。() (3)基因表達(dá)載體組成除了目的基因外，還必須有啟動(dòng)子、終止子以及標(biāo)記基因等。(√) (4)啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位。(√) (5)基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)工程則可對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)。(√) (6)微型繁殖技術(shù)既能保持優(yōu)良品種的遺傳特性，還可以高效快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖。(√) (7)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中需用胃蛋白酶或膠原蛋白酶將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。() (8)原代培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳物質(zhì)沒(méi)有改變，而傳代培養(yǎng)的細(xì)胞有的已經(jīng)發(fā)生突變，獲得了不死性。(√) (9)動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的克隆動(dòng)物在遺傳性狀上與供核母體完全一致。() (10)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)和植物體細(xì)胞雜交技術(shù)類似，也可獲得雜種動(dòng)物。() 考向一　基因工程 Z　 1．(2018全國(guó)卷Ⅰ)回答下列問(wèn)題： (1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。該研究除證明了質(zhì)?？梢宰鳛檩d體外，還證明了__體外重組的質(zhì)?？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞；真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)__(答出兩點(diǎn)即可)。 (2)體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)Ca2＋參與的__轉(zhuǎn)化__方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與__外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)__組裝成完整噬菌體后，才能通過(guò)侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是__細(xì)菌__。 (3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)可能會(huì)被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用__蛋白酶缺陷型__的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過(guò)程中應(yīng)添加__蛋白酶__的抑制劑。 [解析]　(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌中，該過(guò)程利用的技術(shù)是基因工程。該研究除了證明質(zhì)?？勺鳛檩d體外，還證明了體外重組的質(zhì)?？梢赃M(jìn)入受體細(xì)胞，真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)等。 (2)重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞可采用Ca2＋參與的轉(zhuǎn)化方法；體外重組噬菌體要通過(guò)將體外重組的噬菌體DNA和外殼蛋白(或噬菌體蛋白)進(jìn)行組裝獲得；因?yàn)槭删w是專門寄生在細(xì)菌中的病毒，所以宿主細(xì)胞選用細(xì)菌。 (3)為防止蛋白質(zhì)被降解，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞；在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中，為防止目的蛋白質(zhì)被降解，需要添加蛋白酶的抑制劑。 2．(2017全國(guó)卷Ⅰ)真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒(méi)有，原核生物沒(méi)有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列的機(jī)制。已知在人體中基因A(有內(nèi)含子)可以表達(dá)出某種特定蛋白(簡(jiǎn)稱蛋白A)?；卮鹣铝袉?wèn)題： (1)某同學(xué)從人的基因組文庫(kù)中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到蛋白A，其原因是__基因A有內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，無(wú)法表達(dá)出蛋白A__。 (2)若用家蠶作為表達(dá)基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用__噬菌體__作為載體，其原因是__噬菌體的宿主是細(xì)菌，而不是家蠶__。 (3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體，因?yàn)榕c家蠶相比，大腸桿菌具有__繁殖快、容易培養(yǎng)__(答出兩點(diǎn)即可)等優(yōu)點(diǎn)。 (4)若要檢測(cè)基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測(cè)物質(zhì)是__蛋白A的抗體__(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。 (5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻(xiàn)，也可以說(shuō)是基因工程的先導(dǎo)，如果說(shuō)他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是__DNA可以從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體__。 [解析]　(1)人為真核生物，從人的基因組文庫(kù)中獲取的基因A含有內(nèi)含子，基因A轉(zhuǎn)錄出的產(chǎn)物中有與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列。大腸桿菌為原核生物，沒(méi)有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列的機(jī)制，因此以大腸桿菌作為受體細(xì)胞，不能切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列，無(wú)法表達(dá)出蛋白A。(2)噬菌體和動(dòng)物病毒均可作為基因工程的載體，但它們的宿主細(xì)胞不同。題中受體為家蠶，是一種昆蟲，因此，選擇昆蟲病毒作為載體，噬菌體的宿主是細(xì)菌，不適合作為該實(shí)驗(yàn)的載體。(3)大腸桿菌具有繁殖快、容易培養(yǎng)、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，因此，常作為基因工程的受體細(xì)胞。(4)常用抗原——抗體雜交的方法檢測(cè)目的基因是否表達(dá)，故能用于檢測(cè)蛋白A的物質(zhì)為蛋白A的抗體。(5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，S型菌的DNA轉(zhuǎn)移到了R型菌體內(nèi)，其對(duì)基因工程理論的建立提供的啟示是DNA可以從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。 3．(2017全國(guó)卷Ⅱ)幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過(guò)基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉?wèn)題： (1)在進(jìn)行基因工程操作時(shí)，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是__嫩葉組織細(xì)胞易破碎_(kāi)_。提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是__防止RNA降解__。 (2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是__在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則可以合成cDNA__。 (3)若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是__目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)；目的基因無(wú)表達(dá)所需啟動(dòng)子__(答出兩點(diǎn)即可)。 (4)當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時(shí)，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是__磷酸二酯鍵__。 (5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株(幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒(méi)有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是__目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常__。 [解析]　(1)在進(jìn)行基因工程操作時(shí)，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是相對(duì)于老葉而言嫩葉組織細(xì)胞更容易被破碎。提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA為材料獲得cDNA的原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)且目的基因無(wú)表達(dá)所需啟動(dòng)子。(4)DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。(5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株不具備所期望的性狀表現(xiàn)，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常。 4．(2017全國(guó)卷Ⅲ)編碼蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五個(gè)片段組成，編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成，如圖1所示。 回答下列問(wèn)題： (1)先要通過(guò)基因工程的方法獲得蛋白乙，若在啟動(dòng)子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，則所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后不能翻譯出蛋白乙，原因是__編碼乙的DNA序列起始端無(wú)ATG，轉(zhuǎn)錄出的mRNA無(wú)起始密碼子__。 (2)某同學(xué)在用PCR技術(shù)獲取DNA片段B或D的過(guò)程中，在PCR反應(yīng)體系中加入了DNA聚合酶、引物等，還加入了序列甲作為_(kāi)_模板__，加入了__dNTP__作為合成DNA的原料。 (3)現(xiàn)通過(guò)基因工程方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白，要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖的作用，某同學(xué)做了如下實(shí)驗(yàn)：將一定量的含T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液平均分成四組，其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一組作為對(duì)照，培養(yǎng)并定期檢測(cè)T淋巴細(xì)胞濃度，結(jié)果如圖2。 ①由圖2可知，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到a時(shí)，添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細(xì)胞濃度不再增加，此時(shí)若要使T淋巴細(xì)胞繼續(xù)增殖，可采用的方法是__進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)__。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度，CO2的作用是__維持培養(yǎng)液的pH__。 ②僅根據(jù)圖1、圖2可知，上述甲、乙、丙三種蛋白中，若缺少__C__(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所編碼的肽段，則會(huì)降低其刺激T淋巴細(xì)胞增殖的效果。 [解析]　(1)若在啟動(dòng)子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，則轉(zhuǎn)錄出的mRNA上缺少起始密碼子，故不能翻譯出蛋白乙。(2)使用PCR技術(shù)獲取DNA片段時(shí)，應(yīng)在PCR反應(yīng)體系中添加引物、耐高溫的DNA聚合酶、模板、dNTP作為原料。(3)T淋巴細(xì)胞濃度之所以不再增加，是因?yàn)榧?xì)胞間出現(xiàn)接觸抑制，因此若要使T淋巴細(xì)胞繼續(xù)增殖，需要對(duì)貼滿瓶壁的細(xì)胞使用胰蛋白酶處理，然后分瓶培養(yǎng)，即細(xì)胞傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度，以維持培養(yǎng)液的pH。據(jù)圖分析，蛋白丙與對(duì)照接近說(shuō)明B、D片段對(duì)于T淋巴細(xì)胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖都有較大影響，甲、乙兩種蛋白中共同的片段是C，所以缺少C片段會(huì)降低其刺激T淋巴細(xì)胞增殖的效果。 H　 1．理清基因工程3種操作工具的作用與特點(diǎn) 項(xiàng)目 限制酶 DNA連接酶 運(yùn)載體 作用 切割__目的基因和運(yùn)載體__ 拼接DNA片段，形成__重組DNA分子__ 攜帶目的基因進(jìn)入__受體細(xì)胞__ 作用部位 兩核苷酸的脫氧核糖與磷酸間形成的磷酸二酯鍵 作用特 點(diǎn)(條件) ①識(shí)別特定的核苷酸序列； ②在特定位點(diǎn)上切割DNA分子 ①　EcoliDNA　　連接酶只能連接黏性末端； ②__T4DNA__連接酶能連接黏性末端和平末端 ①能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并大量__復(fù)制__； ②有一個(gè)至多個(gè)__限制酶切割位點(diǎn)__； ③具有特殊的__標(biāo)記基因__ 2．掌握獲取目的基因的3種途徑 (1)直接分離：從自然界已有的物種中分離，如從__基因文庫(kù)__中獲取。 (2)人工合成目的基因(常用方法如下) ①化學(xué)合成法：已知核苷酸序列的較小基因，直接利用__DNA合成儀__用化學(xué)方法合成，不需要模板。 ②人工合成法：以__RNA__為模板，在__逆轉(zhuǎn)錄酶__的作用下人工合成。 (3)利用__PCR__技術(shù)擴(kuò)增。 3．牢記基因表達(dá)載體的構(gòu)建 (1)基因表達(dá)載體的組成：目的基因＋啟動(dòng)子＋終止子＋__標(biāo)記基因__＋復(fù)制原點(diǎn)。 (2)啟動(dòng)子和終止子：?jiǎn)?dòng)子是__RNA聚合酶__識(shí)別和結(jié)合的部位，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄；終止子是__終止轉(zhuǎn)錄__的位點(diǎn)。 (3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程 4．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 生物種類 植物細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞 微生物細(xì)胞 常用方法 __農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化__法、基因槍法、花粉管通道法等 __顯微注射__技術(shù) __感受態(tài)細(xì)胞__法(Ca2＋處理法) 受體細(xì)胞 體細(xì)胞 受精卵 原核細(xì)胞 5．理清目的基因的檢測(cè)與鑒定 (1)導(dǎo)入檢測(cè)：__DNA分子__雜交技術(shù)(使用DNA探針) (2)表達(dá)檢測(cè) (3)個(gè)體生物學(xué)水平鑒定：如對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行抗蟲或抗病等的接種實(shí)驗(yàn)。 T　 題型1　基因工程的操作工具和流程 1．(2016全國(guó)卷Ⅰ)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tett中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tett表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉?wèn)題： (1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有__能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因__(答出兩點(diǎn)即可)，而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子。 (2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是__二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)__；并且__含有質(zhì)粒載體__和__含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)__的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是__二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)__。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有__四環(huán)素__的固體培養(yǎng)基。 (3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為運(yùn)載體，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自于__受體細(xì)胞__。 [解析]　(1)作為運(yùn)載體的質(zhì)粒上應(yīng)有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，在細(xì)胞中能夠自我復(fù)制，并含有特殊的標(biāo)記基因。(2)未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌中均未導(dǎo)入質(zhì)粒載體，而質(zhì)粒上含有氨芐青霉素抗性基因，因此這樣的大腸桿菌在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，二者在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)，因此無(wú)法區(qū)分二者。由題圖可知，用BamHI切割質(zhì)粒后將四環(huán)素抗性基因破壞，因此可將經(jīng)氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選出的菌落置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上再次篩選，能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生存的是含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌，不能生存的是含有插入目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)噬菌體為病毒，經(jīng)改造后作為載體時(shí)，其DNA復(fù)制所需原料來(lái)自受體細(xì)胞。 2．(2018河北省衡水中學(xué)一模)轉(zhuǎn)基因抗病香蕉的培育過(guò)程如圖1所示，圖2表示PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ四種限制酶的識(shí)別序列及酶切位點(diǎn)。請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題： (1)質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)是__DNA__。 (2)利用基因工程培育轉(zhuǎn)基因抗病香蕉的核心步驟是形成重組質(zhì)粒，即__基因表達(dá)載體的構(gòu)建__；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方式是__農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法__。 (3)將抗病基因從含抗病基因的DNA中切割下來(lái)，使用的限制酶是__PstⅠ和EcoRⅠ__，一個(gè)質(zhì)粒被限制酶PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ同時(shí)切割后得到的DNA片段和黏性末端分別為_(kāi)_3、3__個(gè)。單獨(dú)用ApaⅠ切割質(zhì)粒后的片段是__和__。 (4)轉(zhuǎn)基因抗病香蕉的培育發(fā)生了__基因重組__(變異類型)?？敲顾貢?huì)抑制香蕉愈傷組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，根據(jù)這一原理可利用含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選已導(dǎo)入重組質(zhì)粒的香蕉細(xì)胞。由此推斷，重組質(zhì)粒中應(yīng)含有__卡那霉素抗性__基因作為標(biāo)記基因。 [解析]　(1)質(zhì)粒是一種小型的環(huán)狀DNA分子。(2)基因工程的操作分四個(gè)步驟，其中構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體是核心步驟。圖中將B的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(3)從圖1中的目的基因的三種限制酶的切割位點(diǎn)可以看出，不能使用SmaⅠ，否則會(huì)破壞目的基因的結(jié)構(gòu)，只有利用另外兩種限制酶才能將目的基因切割下來(lái)。用三種限制酶切割環(huán)狀DNA，能得到3個(gè)DNA片段和3個(gè)黏性末端。根據(jù)圖2中的ApaⅠ識(shí)別的堿基序列及切割位點(diǎn)可知，該酶切割質(zhì)粒后得到的黏性末端是和。 (4)基因工程的原理是基因重組，利用含卡那霉素的培養(yǎng)基能篩選出抗卡那霉素的細(xì)胞，由此可以推斷重組質(zhì)粒中的標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因。 易錯(cuò)警示 有關(guān)基因工程概念及其工具的8個(gè)錯(cuò)混點(diǎn) (1)限制酶是一類酶，而不是一種酶。 (2)限制酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。 (3)在切割目的基因和運(yùn)載體時(shí)要求用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。 (4)將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來(lái)，需要切兩處，同時(shí)產(chǎn)生4個(gè)黏性末端。 (5)不同DNA分子用同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同，同一個(gè)DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便于進(jìn)行檢測(cè)。 (7)基因工程中的運(yùn)載體與細(xì)胞膜上物質(zhì)運(yùn)輸?shù)妮d體不同。基因工程中的運(yùn)載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。 (8)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。 題型2　基因工程在生產(chǎn)科技中的應(yīng)用 3．(2018河北衡水中學(xué)一模)科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗鹽基因，轉(zhuǎn)入煙草并培育成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草。下圖是轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過(guò)程，含目的基因的DNA和質(zhì)粒上的箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題。 (1)在該過(guò)程中，研究人員首先獲取了抗鹽基因(目的基因)，并采用__PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))__技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，該技術(shù)需要的條件是__引物__、酶、原料、模板，該技術(shù)必須用__耐高溫的DNA聚合或熱穩(wěn)定DNA聚合__酶；然后構(gòu)建基因表達(dá)載體，基因表達(dá)載體中除了具有目的基因、啟動(dòng)子和終止子之外，還需具有__標(biāo)記基因__。 (2)用圖中的質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ酶切割，原因是__SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因__。圖中①②過(guò)程為防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，應(yīng)選用__BamHⅠ和HindⅢ__酶對(duì)外源DNA、質(zhì)粒進(jìn)行切割。 (3)為確定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的__抗鹽基因(或目的基因)__作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要在個(gè)體水平上鑒定，后者具體過(guò)程是__將培育的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中，觀察該煙草植株的生長(zhǎng)狀態(tài)__。 4．(2018東北三省三校高考生物一模)馬鈴薯是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在基因育種方面取得豐碩成果。 (1)馬鈴薯是雙子葉植物，常用__農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化__方法將目的基因?qū)腭R鈴薯體細(xì)胞中。構(gòu)建好的基因表達(dá)載體基本結(jié)構(gòu)有：目的基因、__啟動(dòng)子__、__終止子__、__標(biāo)記基因__、復(fù)制原點(diǎn)五部分。 (2)馬鈴薯易患多種疾病，導(dǎo)致產(chǎn)量下降?；蚬こ讨谐Ｓ玫目共』?yàn)開(kāi)_病毒外殼蛋白基因、病毒復(fù)制酶基因、抗毒素合成基因、幾丁質(zhì)酶基因__(寫一種即可)。 (3)科學(xué)家還培育出抗除草劑的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，主要從兩個(gè)方面進(jìn)行設(shè)計(jì)： ①修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對(duì)除草劑__不敏感(抵抗)__，或使靶蛋白過(guò)量表達(dá)，植物吸收除草劑后仍能正常代謝。 ②引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前__被降解(分解)不敏感(抵抗)__。 (4)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，還需對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行__檢測(cè)和鑒定__。 [解析]　(1)馬鈴薯是雙子葉植物，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)腚p子葉植物體細(xì)胞中。構(gòu)建好的基因表達(dá)載體基本結(jié)構(gòu)有目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)五部分。(2)基因工程中常用的抗病基因?yàn)椴《就鈿さ鞍谆?、病毒?fù)制酶基因、抗毒素合成基因、幾丁質(zhì)酶基因。(3)①除草劑只能作用于雜草，不能作用于馬鈴薯，因此需要修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對(duì)除草劑不敏感(抵抗)，或使靶蛋白過(guò)量表達(dá)，植物吸收除草劑后仍能正常代謝。②也可以引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前被降解(分解)。(4)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，還需對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。 易錯(cuò)警示 有關(guān)基因工程操作過(guò)程的4個(gè)錯(cuò)混點(diǎn) (1)基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間的部位。 (2)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。 (3)標(biāo)記基因的作用——篩選、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，常見(jiàn)的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。 (4)受體細(xì)胞常用植物受精卵或體細(xì)胞(經(jīng)組織培養(yǎng)培養(yǎng)成新個(gè)體)、動(dòng)物受精卵(一般不用體細(xì)胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌)；一般不用支原體，原因是它營(yíng)寄生生活；一定不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，原因是它無(wú)細(xì)胞核，不能合成蛋白質(zhì)。 考向二　細(xì)胞工程 Z　 1．(2018全國(guó)卷Ⅲ)2018年《細(xì)胞》期刊報(bào)道，中國(guó)科學(xué)家率先成功地應(yīng)用體細(xì)胞對(duì)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)行克隆，獲得兩只克隆猴——“中中”和“華華”。回答下列問(wèn)題： (1)“中中”和“華華”的獲得涉及核移植過(guò)程，核移植是指__將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中__。通過(guò)核移植方法獲得的克隆猴，與核供體相比，克隆猴體細(xì)胞的染色體數(shù)目__不變__(填“減半”“加倍”或“不變”)。 (2)哺乳動(dòng)物的核移植可以分為胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植，胚胎細(xì)胞核移植獲得克隆動(dòng)物的難度__小于__(填“大于”或“小于”)體細(xì)胞核移植，其原因是__胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性相對(duì)容易__。 (3)在哺乳動(dòng)物核移植的過(guò)程中，若分別以雌性個(gè)體和雄性個(gè)體的體細(xì)胞作為核供體，通常，所得到的兩個(gè)克隆動(dòng)物體細(xì)胞的常染色體數(shù)目__相同__(填“相同”或“不同”)，性染色體組合__不同__(填“相同”或“不同”)。 [解析]　(1)核移植是指將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，形成重組細(xì)胞。重組細(xì)胞形成的早期胚胎可移植到受體子宮內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育，最終分娩得到克隆動(dòng)物。因?yàn)槿旧w在細(xì)胞核中，所以克隆動(dòng)物體細(xì)胞的染色體數(shù)目與提供細(xì)胞核的個(gè)體的體細(xì)胞相同。 (2)由于動(dòng)物的胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性相對(duì)容易，而動(dòng)物的體細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性十分困難，因此，動(dòng)物體細(xì)胞核移植的難度明顯高于胚胎細(xì)胞核移植。 (3)哺乳動(dòng)物雌雄個(gè)體的體細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)常染色體的數(shù)目是相同的，性染色體組合是不同的。若分別以雌性個(gè)體和雄性個(gè)體的體細(xì)胞作為核供體，則得到的克隆動(dòng)物的體細(xì)胞中常染色體的數(shù)目相同，性染色體組合不同。 2．(2014全國(guó)卷Ⅰ)某研究者用抗原(A)分別免疫3只同種小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后測(cè)定各小鼠血清抗體的效價(jià)(能檢測(cè)出抗原抗體反應(yīng)的血清最大稀釋倍數(shù))，結(jié)果如下圖所示。 若要制備雜交瘤細(xì)胞，需取免疫后小鼠的B淋巴細(xì)胞(染色體數(shù)目40條)，并將該細(xì)胞與體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(染色體數(shù)目60條)按一定比例加入試管中，再加入聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合，經(jīng)篩選培養(yǎng)及抗體檢測(cè)，得到不斷分泌抗A抗體的雜交瘤細(xì)胞。 回答下列問(wèn)題： (1)制備融合所需的B淋巴細(xì)胞時(shí)，所用免疫小鼠的血清抗體效價(jià)需達(dá)到16000以上，則小鼠最少需要經(jīng)過(guò)__4__次免疫后才能有符合要求的。達(dá)到要求后的X、Y、Z這3只免疫小鼠中，最適合用于制備B淋巴細(xì)胞的是__Y__小鼠，理由是__Y小鼠的血清抗體效價(jià)最高_(dá)_。 (2)細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)完成后，融合體系中除含有未融合的細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞外，可能還有__B淋巴細(xì)胞相互融合形成的細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞相互融合形成的細(xì)胞__，體系中出現(xiàn)多種類型細(xì)胞的原因是__細(xì)胞融合是隨機(jī)的，且融合率達(dá)不到100%__。 (3)雜交瘤細(xì)胞中有__1__個(gè)細(xì)胞核，染色體數(shù)目最多是__100__條。 (4)未融合的B淋巴細(xì)胞經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后都不能存活，原因是__不能無(wú)限增殖__。 [解析]　本題考查雜交瘤細(xì)胞的制備過(guò)程和特性。(1)據(jù)圖分析，第四次注射后X、Y、Z小鼠的血清抗體效價(jià)均達(dá)到16000以上，小鼠Y的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體效價(jià)最高，最適用于制備單克隆抗體。(2)融合體系中除了未融合的細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞之外，還有骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的自身融合產(chǎn)物；由于細(xì)胞融合具有隨機(jī)性，故體系中會(huì)出現(xiàn)多種類型的細(xì)胞。(3)雜交瘤細(xì)胞形成后，由于核膜具有流動(dòng)性，小鼠的免疫B淋巴細(xì)胞核與其骨髓瘤細(xì)胞核會(huì)融合形成一個(gè)雜交的細(xì)胞核，正常情況下融合后的細(xì)胞核中的染色體數(shù)目為100條。(4)未融合的B淋巴細(xì)胞在不發(fā)生突變的情況下經(jīng)過(guò)多次分裂后會(huì)衰老死亡，不能無(wú)限增殖。 H　 1．理清3種細(xì)胞的區(qū)別 (1)雜種細(xì)胞：植物體細(xì)胞雜交過(guò)程中，兩種細(xì)胞去掉細(xì)胞壁之后形成的__原生質(zhì)體__融合，融合的原生質(zhì)體出現(xiàn)細(xì)胞壁之后形成的細(xì)胞叫雜種細(xì)胞。 (2)重組細(xì)胞：__體__細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞之后形成的細(xì)胞叫重組細(xì)胞。 (3)雜交細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞融合形成的細(xì)胞常稱為雜交細(xì)胞。 2．關(guān)注植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的4個(gè)易錯(cuò)點(diǎn) (1)植物體細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合中酶的作用對(duì)象不同，__纖維素酶__和果膠酶作用于細(xì)胞壁，而__胰蛋白酶__等作用于細(xì)胞間的蛋白質(zhì)。 (2)滅活的病毒保持了其抗原性，但毒性消失。 (3)植物雜交細(xì)胞在激素誘導(dǎo)下能表達(dá)出全能性，但動(dòng)物雜交細(xì)胞的全能性不能表達(dá)。 (4)克隆動(dòng)物的起點(diǎn)是經(jīng)過(guò)核__移植__后形成的__重組__細(xì)胞，其遺傳物質(zhì)主要來(lái)自供體，因此形成的個(gè)體性狀主要同供體，但也有部分性狀同受體。 3．規(guī)避克隆動(dòng)物與試管動(dòng)物的3個(gè)誤區(qū) (1)誤區(qū)一：試管動(dòng)物與克隆動(dòng)物的產(chǎn)生都是無(wú)性生殖。糾正：試管動(dòng)物的產(chǎn)生是__有性__生殖，克隆動(dòng)物的產(chǎn)生是__無(wú)性__生殖。 (2)誤區(qū)二：試管動(dòng)物(哺乳類)的產(chǎn)生是在__體外__進(jìn)行的，克隆動(dòng)物(哺乳類)的產(chǎn)生是在__體內(nèi)__進(jìn)行的。糾正：試管動(dòng)物(哺乳類)和克隆動(dòng)物(哺乳類)早期胚胎之前都是在體外進(jìn)行的，早期胚胎經(jīng)過(guò)__胚胎移植__之后是在體內(nèi)進(jìn)行的。 (3)誤區(qū)三：胚胎移植的優(yōu)勢(shì)是充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個(gè)體的繁殖潛力，因此胚胎移植的胚胎只能來(lái)自體內(nèi)受精的胚胎。糾正：胚胎移植的胚胎有三個(gè)來(lái)源：體內(nèi)正常__受精__產(chǎn)生的胚胎、核移植產(chǎn)生的重組細(xì)胞培養(yǎng)而來(lái)的胚胎、體外受精產(chǎn)生的早期胚胎。 4．易錯(cuò)警示 (1)制備人工種子需要植物組織培養(yǎng)到叢芽或胚狀體階段。 (2)正確認(rèn)識(shí)3類細(xì)胞的來(lái)源： ①雜種細(xì)胞：植物體細(xì)胞雜交。 ②重組細(xì)胞：核移植。 ③雜交細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞融合。 (3)原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的區(qū)別：是否進(jìn)行了分瓶培養(yǎng)。 (4)核移植技術(shù)獲得的動(dòng)物與供核動(dòng)物的性狀并不完全相同。 (5)動(dòng)植物的體細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)都需要在無(wú)菌條件下進(jìn)行。 (6)植物組織培養(yǎng)中添加蔗糖的目的是提供營(yíng)養(yǎng)和調(diào)節(jié)滲透壓。 T　 題型1　植物細(xì)胞工程 1．(2018陜西省西安市高考生物一模)白菜、甘藍(lán)均為二倍體，體細(xì)胞染色體數(shù)目分別為20、18?！鞍撞恕仕{(lán)”是用細(xì)胞工程的方法培育出來(lái)的蔬菜新品種，它具有生長(zhǎng)期短、耐熱性強(qiáng)和易于儲(chǔ)藏等優(yōu)點(diǎn)。如圖是“白菜—甘藍(lán)”的雜交過(guò)程示意圖，回答以下問(wèn)題： (1)為了得到原生質(zhì)體需先用__纖維素酶__和__果膠酶__來(lái)處理白菜細(xì)胞和甘藍(lán)細(xì)胞。 (2)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法有多種，常用的物理方法是__離心、振動(dòng)、電激__，融合完成的標(biāo)志是__再生出新的細(xì)胞壁__。由雜種細(xì)胞得到白菜—甘藍(lán)還需要經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，其中需要避光培養(yǎng)的步驟是__脫分化__。 (3)如圖通過(guò)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得的“白菜—甘藍(lán)”體細(xì)胞染色體數(shù)為_(kāi)_38__；通常情況下，白菜和甘藍(lán)有性雜交是不能成功的，原因是__存在生殖隔離__，若對(duì)白菜和甘藍(lán)采用雜交育種方法能成功的話，得到的后代應(yīng)含__19__條染色體。 (4)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)和傳統(tǒng)雜交技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)是__克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育作物新品種__。 [解析]　(1)植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素和果膠，根據(jù)酶的專一性原理，可采用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁。(2)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法包括：物理方法(離心、振動(dòng)、電激)和化學(xué)方法(聚乙二醇)；融合完成的標(biāo)志是再生出新的細(xì)胞壁；將雜種細(xì)胞培育成雜種植株還需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，包括脫分化和再分化兩個(gè)階段，其中脫分化過(guò)程要避光，再分化過(guò)程需光。(3)如圖通過(guò)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得的“白菜一甘藍(lán)”體細(xì)胞染色體數(shù)為20＋18＝38；通常情況下，由于白菜和甘藍(lán)之間存在生殖隔離，因此白菜和甘藍(lán)有性雜交是不能成功的；若對(duì)白菜和甘藍(lán)采用雜交育種方法能成功的話，得到的后代應(yīng)含＋＝19條染色體。(4)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)和傳統(tǒng)雜交技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)是克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育作物新品種。 2．(2018河北邯鄲一中二模)我國(guó)菊花主要有杭菊、亳菊、懷菊、貢菊等8種，是藥食兼優(yōu)的代表性植物。研究發(fā)現(xiàn)杭菊具有明顯的抗炎作用，懷菊具有良好的抗病毒作用(但是抗炎作用很弱)。結(jié)合所學(xué)知識(shí)回答下列問(wèn)題： (1)欲培育兼有明顯抗炎、抗病毒療效的菊花新品種，用杭菊和懷菊雜交的方法是做不到的，原因是__二者存在生殖隔離__。 (2)基因工程方法為培育上述新品種提供了可能性，在實(shí)施基因工程過(guò)程中，最關(guān)鍵的步驟是__基因表達(dá)載體的構(gòu)建__。受體細(xì)胞的選擇直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成功與否以及新生植株的品質(zhì)，我們一般選取未開(kāi)花的幼枝的芽尖，理由有__不帶病毒或帶病毒極少__、__分化程度低或易誘導(dǎo)脫分化和再分化(答案必須是兩個(gè)方面)__(寫出兩個(gè))。若想確定杭菊的受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了懷菊的抗病毒基因，常用的檢測(cè)方法是__DNA分子雜交技術(shù)__。 (3)如果利用植物體細(xì)胞雜交的方法培育“杭菊懷菊”雜種植株，首先要獲得這兩種植物細(xì)胞的__原生質(zhì)體__，用聚乙二醇誘導(dǎo)處理后，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)材料再生出__細(xì)胞壁__，再利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育出雜種植株。 (4)理論上利用植物體細(xì)胞雜交和基因工程的方法均可以培育出抗炎、抗病毒的優(yōu)良菊花，這兩項(xiàng)技術(shù)的共同特點(diǎn)有__定向改造生物(或克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙)__。 [解析]　(1)杭菊和懷菊屬于兩個(gè)不同的物種，二者之間存在生殖隔離，所以二者之間不能進(jìn)行有性雜交。(2)基因工程的關(guān)鍵步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建；由于幼枝的芽尖具有不帶病毒或帶病毒極少、分化程度低或易誘導(dǎo)脫分化和再分化的特點(diǎn)，所以通常選取未開(kāi)花的幼枝的芽尖做受體細(xì)胞；可用DNA分子雜交技術(shù)檢測(cè)懷菊的抗病毒基因(目的基因)是否導(dǎo)入了杭菊受體細(xì)胞。(3)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)首先要獲得這兩種植物細(xì)胞的原生質(zhì)體，用聚乙二醇誘導(dǎo)處理后，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)材料再生出細(xì)胞壁，再利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育出雜種植株。(4)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)和基因工程的共同特點(diǎn)是定向改造生物(或克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙)。 易錯(cuò)警示 辨析有關(guān)植物細(xì)胞工程的3個(gè)錯(cuò)混點(diǎn) (1)植物體細(xì)胞雜交即兩個(gè)細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，不管是染色體數(shù)、基因型還是染色體組都采用直接相加的方法。 (2)利用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)物時(shí)，有時(shí)只需將外植體培養(yǎng)到愈傷組織，從愈傷組織中獲取產(chǎn)物。 (3)人工種子發(fā)育初期需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由人工胚乳提供。 題型2　動(dòng)物細(xì)胞工程 3．(2018遼寧大連二模)白細(xì)胞介素4(IL－4)是具有多種免疫學(xué)調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，臨床及研究中需要大量高純度的IL－4，以及其高效檢測(cè)試劑。下圖是利用單克隆抗體技術(shù)制備抗IL－4特異性抗體的過(guò)程?；卮鹣嚓P(guān)問(wèn)題。 (1)在免疫系統(tǒng)組成中，IL－4屬于__免疫活性__物質(zhì)。研究人員從外周血中提取到IL－4蛋白分子的mRNA。將其反轉(zhuǎn)錄成__cDNA__，構(gòu)建特定表達(dá)載體，利用工程菌獲得用于臨床及研究需要的高純度的IL－4蛋白。 (2)圖中所示的a培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的是__骨髓瘤__細(xì)胞，其與M細(xì)胞融合產(chǎn)生雙核或多核細(xì)胞。再經(jīng)__有絲分裂__，進(jìn)一步形成兩個(gè)新的單核雜交細(xì)胞。 (3)b培養(yǎng)瓶所示過(guò)程中，要用特定的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞篩選，得到的__融合的雜種(雜交瘤)__細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖生長(zhǎng)。經(jīng)b獲得的細(xì)胞，還需要進(jìn)行__克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)(或答“克隆化培養(yǎng)和專一抗體陽(yáng)性檢測(cè)”)__。 (4)c培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞是__分泌抗IL－4抗體(答出此意即可)__的雜交瘤細(xì)胞。制備IL－4單克隆抗體的過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶通常置于特定培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，要求培養(yǎng)瓶松蓋，主要目的是__讓O2進(jìn)入培養(yǎng)瓶以供細(xì)胞代謝、使CO2進(jìn)入培養(yǎng)瓶維持培養(yǎng)液的pH__。 4．回答下列與動(dòng)物細(xì)胞工程有關(guān)的問(wèn)題： (1)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，在細(xì)胞發(fā)生貼壁生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)__接觸__抑制。貼滿瓶壁的細(xì)胞一般用__胰蛋白酶或膠原蛋白__酶處理后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，這種培養(yǎng)過(guò)程稱為_(kāi)_傳代__培養(yǎng)。 (2)在細(xì)胞核移植過(guò)程中常用到卵母細(xì)胞，通常情況下，采集到的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)到__減數(shù)第二次分裂中__期。在核移植之前，應(yīng)去除卵母細(xì)胞的__細(xì)胞核__，原因是__若不去掉卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，就會(huì)造成核移植后的卵母細(xì)胞中有兩個(gè)細(xì)胞核，使得遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定__。 (3)如圖表示制備單克隆抗體的過(guò)程。在獲得B淋巴細(xì)胞之前，小鼠已被多次注射__相同__(填“相同”或“不同”)抗原，注射后小鼠體內(nèi)發(fā)生__體液__(填“細(xì)胞”或“體液”)免疫反應(yīng)，生成能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞(漿細(xì)胞)。①過(guò)程中，如果細(xì)胞發(fā)生兩兩融合，融合后出現(xiàn)__三__種不同的融合細(xì)胞。②過(guò)程需在特定的__選擇__培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，從而得到__雜交瘤__細(xì)胞。③過(guò)程培養(yǎng)細(xì)胞需要的氣體環(huán)境為_(kāi)_95%的空氣＋5%的CO2__。 [解析]　(1)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象，貼滿瓶壁的細(xì)胞一般用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理后繼續(xù)培養(yǎng)，分瓶后的培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。(2)體細(xì)胞核移植過(guò)程中，卵母細(xì)胞一般培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期，并去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，否則核移植后有兩個(gè)細(xì)胞核，遺傳物質(zhì)表達(dá)發(fā)生混亂。(3)制備單克隆抗體前，對(duì)小鼠先要多次用同種抗原刺激，從而能產(chǎn)生足夠的相應(yīng)的漿細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合是隨機(jī)的，可能是兩個(gè)淋巴細(xì)胞之間融合或兩個(gè)骨髓瘤細(xì)胞之間融合，也可能是B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，因此有三種融合結(jié)果。為了得到雜交瘤細(xì)胞，需在特定的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的氣體環(huán)境是95%的空氣＋5%的CO2混合氣體。 易錯(cuò)警示 辨析有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體的3個(gè)錯(cuò)混點(diǎn) (1)滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但是并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。 (2)除了受到注射的抗原的刺激，小鼠在生活過(guò)程中還可能受到其他抗原的刺激，因此從小鼠體內(nèi)取出的多個(gè)B淋巴細(xì)胞可能產(chǎn)生多種不同抗體，所以進(jìn)行第二次篩選是非常必要的。 (3)單克隆抗體制備過(guò)程中，進(jìn)行了多次動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作，說(shuō)明動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。 1．(2018深圳調(diào)研)葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因整合到葉綠體基因組中，該技術(shù)能有效改良植物的品質(zhì)。請(qǐng)回答： (1)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心步驟是__基因表達(dá)載體的構(gòu)建__，完成該步驟所需要的酶有__限制酶和DNA連接酶__。 (2)將植物體細(xì)胞處理得到原生質(zhì)體，再通過(guò)__農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法__或__基因槍__法，將目的基因?qū)朐|(zhì)體，使原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁之后，通過(guò)__植物組織培養(yǎng)__技術(shù)培養(yǎng)可得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因幼苗。 (3)來(lái)自原核生物中有重要價(jià)值的外源基因，無(wú)需改造和修飾就可在葉綠體中高效表達(dá)，就此分析，原因是__葉綠體DNA與原核生物DNA結(jié)構(gòu)類似(由于葉綠體大多數(shù)基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)均與原核生物類似)__。 (4)對(duì)大多數(shù)高等植物而言，與傳統(tǒng)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因相比，葉綠體轉(zhuǎn)基因更穩(wěn)定，其遺傳方式__不遵循__(答“遵循”或“不遵循”)分離定律，不會(huì)隨__花粉__(“花粉”或“卵細(xì)胞”)傳給后代，從而保持了__母本__(“父本”或“母本”)的遺傳特性。 [解析]　(1)基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建，所需要的酶有限制酶和DNA連接酶；(2)植物細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁之后，通過(guò)植物組織培養(yǎng)獲取幼苗；(3)葉綠體DNA與原核生物DNA結(jié)構(gòu)類似。(4)分離定律適用于有性生殖過(guò)程中細(xì)胞核遺傳，故葉綠體轉(zhuǎn)基因不遵循分離定律，為母系遺傳。 2．(2018天津市和平區(qū)生物一模)已知某傳染性疾病的病原體為RNA病毒，該病毒表面的A蛋白為主要抗原。疫苗的生產(chǎn)和抗體的制備流程如圖1所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)過(guò)程①代表的是__逆轉(zhuǎn)錄__，過(guò)程③構(gòu)建A基因重組載體時(shí)，啟動(dòng)子和終止子是重新構(gòu)建的，它們應(yīng)該能被受體細(xì)胞的__RNA聚合酶__所識(shí)別，以便于其催化轉(zhuǎn)錄過(guò)程。 (2)如圖2為A基因的結(jié)構(gòu)示意圖，已知Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個(gè)，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個(gè)，空白區(qū)域中G和C的總數(shù)共有400個(gè)，則由該區(qū)域能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA中A和U總數(shù)是__400__個(gè)。 (3)在給小鼠皮下注射A蛋白時(shí)，要重復(fù)注射幾次的目的是通過(guò)二次免疫，增加小鼠體內(nèi)的__漿細(xì)胞__數(shù)目。 (4)在將X進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)前，至少需要經(jīng)過(guò)2次篩選，第一次是將__雜交瘤細(xì)胞__篩選出來(lái)，第二次是將__能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞__篩選出來(lái)。 (5)對(duì)健康人進(jìn)行該傳染病免疫預(yù)防時(shí)，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的__A蛋白__來(lái)制備疫苗。對(duì)該傳染病疑似患者確診時(shí)，可以從疑似患者體內(nèi)分離出病毒與已知病毒進(jìn)行核酸序列比較，或用圖中的__抗A蛋白的單克隆抗體__與分離出的病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)。 [解析]　(1)由以上分析可知①是逆轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。(2)已知圖中Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個(gè)，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個(gè)，則空白區(qū)域中堿基總數(shù)為1200個(gè)，又已知空白區(qū)域中G和C的總數(shù)為400個(gè)，則A＋T總數(shù)為800個(gè)，每條鏈中A＋T總數(shù)為400個(gè)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，由該區(qū)轉(zhuǎn)錄形成的成熟mRNA中A和U總數(shù)也是400個(gè)。(3)在給小鼠皮下注射A蛋白時(shí)，要重復(fù)注射幾次的目的是通過(guò)二次免疫，增加小鼠體內(nèi)的漿細(xì)胞數(shù)目。(4)在將X進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)前，至少需要經(jīng)過(guò)2次篩選，第一次是用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次是采用抗體陽(yáng)性檢測(cè)法篩選出能夠產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。(5)對(duì)健康人進(jìn)行該傳染病免疫預(yù)防時(shí)，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的A蛋白所制備的疫苗。對(duì)該傳染病疑似患者確診時(shí)，可以從疑似患者體內(nèi)分離出病毒，與已知病毒進(jìn)行核酸序列比較；或采用抗原—抗體雜交法，即用圖中的抗A蛋白的單克隆抗體進(jìn)行特異性結(jié)合檢測(cè)。 3．如圖為三種質(zhì)粒和一個(gè)含目的基因的DNA片段，其中ApR為氨芐青霉素抗性基因，TcR為四環(huán)素抗性基因，lacZ為藍(lán)色顯色基因，EcoRⅠ(0.7kb)、PvuⅠ(0.8kb)等為限制酶和其切割位點(diǎn)及其與復(fù)制原點(diǎn)之間的距離。已知1kb＝1000個(gè)堿基對(duì)，請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)片段D為目的基因中的某一片段，則DNA聚合酶和DNA連接酶的作用形成的鍵依次是__②__(填圖中數(shù)字)。 (2)圖中作為目的基因運(yùn)載體最理想的質(zhì)粒是__B__(填“A”“B”或“C”)，請(qǐng)據(jù)圖分析，其他兩種質(zhì)粒一般不能作為運(yùn)載體的理由分別是__質(zhì)粒A不含有標(biāo)記基因；質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時(shí)，復(fù)制原點(diǎn)會(huì)被破壞，使該質(zhì)粒無(wú)法進(jìn)行復(fù)制__。 (3)用EcoRⅠ全酶切目的基因和質(zhì)粒B形成的重組質(zhì)粒，并進(jìn)行電泳觀察，可出現(xiàn)長(zhǎng)度分別為1．1kb和__5.6__kb的兩個(gè)片段，或者長(zhǎng)度分別為_(kāi)_3.6_kb和3.1_kb__的兩個(gè)片段(重組質(zhì)粒上目的基因的插入位點(diǎn)與EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)之間的堿基對(duì)忽略不計(jì))。 (4)將分別用限制酶PvuⅠ切開(kāi)的質(zhì)粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，進(jìn)行大腸桿菌受體細(xì)胞導(dǎo)入操作，則受體細(xì)胞的類型包含__ABD__(多選)。 A．ApR藍(lán)色　　 B．ApR白色 C．ApS、藍(lán)色　　 D．ApS白色 (5)動(dòng)物基因工程通常以受精卵作為受體細(xì)胞的根本原因是__B__。 A．受精卵能使目的基因高效表達(dá) B．受精卵可發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體 C．受精卵更易接受DNA的插入 D．受精卵體積較大，便于DNA導(dǎo)入操作 [解析]　(1)DNA聚合酶和DNA連接酶的作用形成的鍵均為磷酸二酯鍵，因此都應(yīng)為②。(2)由題圖可知，切割目的基因應(yīng)用PvuⅠ，但該限制酶會(huì)將c質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)破壞，使該質(zhì)粒無(wú)法進(jìn)行復(fù)制，而質(zhì)粒A不含有標(biāo)記基因，因此兩者都不能作為運(yùn)載體。(3)根據(jù)題意，質(zhì)粒B長(zhǎng)度為2.7kb，目的基因長(zhǎng)度為4.0kb，所以重組質(zhì)粒長(zhǎng)度為6.7kb，如果出現(xiàn)長(zhǎng)度為1．1kb的一個(gè)片段，則另外一個(gè)片段的長(zhǎng)度為5.6kb。若目的基因與運(yùn)載體反向連接，可形成長(zhǎng)度分別為3.1kb和3.6kb的兩個(gè)片段。(4)將分別用限制酶PvuⅠ切開(kāi)的質(zhì)粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，可得到質(zhì)粒自身環(huán)化形成的普通質(zhì)粒、重組質(zhì)粒和目的基因自身連接的DNA環(huán)三種類型。如果導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒，受體細(xì)胞的類型為A(ApR、藍(lán)色)，如果導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，受體細(xì)胞的類型為B(ApR、白色)，如果導(dǎo)入的是DNA環(huán)，受體細(xì)胞的類型為D(ApS、白色)。(5)動(dòng)物基因工程通常選用受精卵作為受體細(xì)胞的根本原因是受精卵可發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。 4．人乳頭狀瘤病毒(HPV)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，抗HPV的單克隆抗體可以準(zhǔn)確檢測(cè)出HPV，從而及時(shí)監(jiān)控宮頸癌的發(fā)生，以下是以HPV衣殼蛋白為抗原制備出單克隆抗體的過(guò)程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題： (1)單克隆抗體制備過(guò)程中涉及的細(xì)胞工程技術(shù)有__動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞融合__。 (2)若要分析雜交瘤細(xì)胞中染色體，可通過(guò)__解離、漂洗、染色和制片__等過(guò)程制成裝片，然后在顯微鏡下觀察。雜交瘤細(xì)胞中染色體數(shù)目與普通淋巴細(xì)胞相比具有的特點(diǎn)是__染色體數(shù)目加倍__，在HAT培養(yǎng)基上存活的細(xì)胞可能包括__①②③__(填下列序號(hào))。 ①無(wú)抗體分泌的細(xì)胞 ②抗HPV抗體的分泌細(xì)胞 ③其他無(wú)關(guān)抗體的分泌細(xì)胞 (3)對(duì)于抗體檢測(cè)呈__陽(yáng)__性的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，克隆化的方法最常用的是有限稀釋法，即稀釋細(xì)胞到3～10個(gè)/mL，每孔加入細(xì)胞稀釋液__0.1__mL，使每個(gè)孔內(nèi)不多于一個(gè)細(xì)胞，達(dá)到單克隆培養(yǎng)的目的。 (4)由上述過(guò)程生產(chǎn)出的單克隆抗體不能直接用于人體，理由是__小鼠形成的抗體對(duì)人體來(lái)說(shuō)是抗原，存在著排異反應(yīng)__。 (5)科學(xué)家從某些無(wú)限增殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分離出了無(wú)限增殖調(diào)控基因(prG)，該基因能激發(fā)動(dòng)物細(xì)胞分裂，這為單克隆抗體的制備提供了更多的思路。除本題描述的制備單克隆抗體技術(shù)外，請(qǐng)?jiān)俸?jiǎn)要寫出一種制備單克隆抗體的思路。 __通過(guò)基因工程向漿細(xì)胞中導(dǎo)入prG；利用核移植技術(shù)將漿細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的無(wú)限增殖細(xì)胞中(答對(duì)其一即可)__。 [解析]　(2)利用顯微鏡觀察有絲分裂過(guò)程中的染色體，需先制作臨時(shí)裝片；雜交瘤細(xì)胞中含有漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的染色體，所以比普通淋巴細(xì)胞的染色體數(shù)目多一倍；在HAT培養(yǎng)基上生存的細(xì)胞均為雜交細(xì)胞，這些雜交細(xì)胞中有分泌HPV抗體的細(xì)胞，有分泌其他抗體的細(xì)胞，也有不能分泌抗體的細(xì)胞。(3)抗體檢驗(yàn)呈陽(yáng)性，說(shuō)明該雜交瘤細(xì)胞可產(chǎn)生所需抗體；為保證每個(gè)小孔不多于一個(gè)細(xì)胞，根據(jù)濃度可推斷加入細(xì)胞稀釋液的量：設(shè)加入細(xì)胞稀釋液的最大量是X，則10個(gè)/mLX＝1個(gè)，X＝0.1mL。(4)小鼠形成的抗體與人體抗體不同，故在人體內(nèi)可引起免疫反應(yīng)，所以上述過(guò)程生產(chǎn)出的單克隆抗體不能直接用于人體。(5)根據(jù)所給信息可知，還可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)或核移植技術(shù)獲得既能大量增殖，又能產(chǎn)生特定抗體的雜交細(xì)胞。 5．(2017陜西西安長(zhǎng)安一中第一次檢測(cè))下圖是植物體細(xì)胞雜交過(guò)程示意圖，請(qǐng)據(jù)圖回答： (1)植物體細(xì)胞雜交的第①步是去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體。目前此步驟最常用的方法是酶解法，也就是在溫和的條件下用__纖維素酶、果膠酶__等分解植物的細(xì)胞壁。 (2)②過(guò)程的發(fā)生，必須進(jìn)行人工誘導(dǎo)。人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的化學(xué)方法是用__聚乙二醇__試劑作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合。動(dòng)物細(xì)胞融合還常用到__滅活的病毒__作為誘導(dǎo)劑。 (3)與過(guò)程③密切相關(guān)的具有單層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器為_(kāi)_高爾基體__。 (4)④過(guò)程稱為_(kāi)_脫分化__，⑤過(guò)程稱為_(kāi)_再分化__。若利用此技術(shù)生產(chǎn)治療癌癥的藥物——紫杉醇，培養(yǎng)將進(jìn)行到__e__(填字母編號(hào))即可。 (5)植物體細(xì)胞雜交在育種工作中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其突出的優(yōu)點(diǎn)是可以__克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙__。 [解析]　(1)植物體細(xì)胞雜交的第①步是用纖維素酶和果膠酶去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體。(2)人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的化學(xué)方法是用聚乙二醇試劑作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合。動(dòng)物細(xì)胞融合還常用到滅活的病毒作為誘導(dǎo)劑。(3)過(guò)程⑧是雜種細(xì)胞生出細(xì)胞壁，高爾基體與植物細(xì)胞壁形成有關(guān)。(4)④⑤過(guò)程分別為脫分化和再分化，治療癌癥的藥物——紫杉醇是從紫杉細(xì)胞中提取的，只需將植物組織培養(yǎng)進(jìn)行到愈傷組織階段即可。(5)植物體細(xì)胞雜交在育種工作中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其突出的優(yōu)點(diǎn)是可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，大大擴(kuò)展可用于雜交的親本組合范圍。 6．(2018全國(guó)卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。某科研團(tuán)隊(duì)將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡(jiǎn)稱為甲)，并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達(dá)載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點(diǎn)的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。 回答下列問(wèn)題： (1)據(jù)圖推斷，該團(tuán)隊(duì)在將甲插入質(zhì)粒P0時(shí)，使用了兩種限制酶，這兩種酶是__E1和E4__。使用這兩種酶進(jìn)行酶切是為了保證__甲的完整__，也是為了保證__甲與載體正確連接__。 (2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細(xì)胞后，若在該細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說(shuō)明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了__轉(zhuǎn)錄__和__翻譯__過(guò)程。 (3)為了獲得含有甲的牛，該團(tuán)隊(duì)需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的__細(xì)胞核__移入牛的__去核卵母細(xì)胞__中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)為了檢測(cè)甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，某同學(xué)用PCR方法進(jìn)行鑒定，在鑒定時(shí)應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的__核DNA__(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。 [解析]　(1)由題意可知，L1基因和GFP基因合成了L1－GFP融合基因(簡(jiǎn)稱為甲)，題圖中顯示了四個(gè)酶切位點(diǎn)，當(dāng)將L1－GFP融合基因插入質(zhì)粒P0時(shí)，可用E1和E4限制酶進(jìn)行酶切，用這兩種酶進(jìn)行酶切不會(huì)破壞甲的完整性，同時(shí)能保證甲按照正確的方向與載體連接。 (2)若在牛皮膚細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說(shuō)明L1－GFP融合基因得到表達(dá)，即目的基因在受體細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成了熒光蛋白。 (3)為了獲得含有甲的牛，可將含有目的基因的細(xì)胞的細(xì)胞核移入牛的去核卵母細(xì)胞中，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，可以檢測(cè)目的基因是否存在。PCR擴(kuò)增的模板是DNA。 7．(2018天津卷)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國(guó)科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)DNA后，利用__PCR__技術(shù)擴(kuò)增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個(gè)別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達(dá)時(shí)不