熒光定量PCR技術講座理論基礎引物及探針設計體系優(yōu)化實驗方案數(shù)據(jù)分析污染防控ppt課件

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熒光定量PCR技術講座,------分子生物學實驗技術系列講座Ⅲ,1,大綱,一、熒光定量PCR技術的基礎理論 二、引物及Taqman探針的設計 三、內(nèi)參基因的選擇 四、反應體系的優(yōu)化 五、實驗方案的選擇 六、誤差分析及操作規(guī)范 七、實驗中污染的防控 八、實驗結(jié)果的分析,2,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,1、熒光定量PCR技術概論 熒光定量PCR技術產(chǎn)生并成熟于上世紀90年代，由于該技 術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應的全過程進 行實時監(jiān)控，并且自動化程度高，所以該技術從產(chǎn)生到現(xiàn)在短 短的十幾年時間，在科研及檢驗領域獲得了廣泛的應用，成為 分子生物學領域不可或缺的一項重要技術。,3,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,1、熒光定量PCR技術概論 熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用 熒光信號隨著PCR反應的積累來實時監(jiān)控PCR反應的進程，并通 過分析軟件對PCR的反應進行檢測分析的技術。 系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。,4,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,2、熒光定量PCR常用的三個概念 擴增曲線、閾值、CT值 （1）、擴增曲線及擴增曲線的兩種形式,左圖反映的是隨著PCR反應的進行相應的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號的變化量的對數(shù)與PCR反應循環(huán)數(shù)的關系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時具有簡單明了的特點，所以很多軟件都采用右圖的形式，當然了，這兩種實時擴增曲線可以根據(jù)實驗的需要相互轉(zhuǎn)換。,5,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,2、熒光定量PCR常用的三個概念 （2）、閾值線 在熒光定量PCR擴增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上， 所有樣品的熒光強度與其本底熒光強度的差值全部相同。,6,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,2、熒光定量PCR常用的三個概念 （3）、CT值 PCR過程中，各樣品擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時，所經(jīng)過的 擴增循環(huán)數(shù)。,7,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,3、熒光定量PCR的化學基礎 熒光定量PCR是隨著PCR循環(huán)的進行，以熒光信號強度的積 累來實時反映PCR反應進程的。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特 點： （1）、本底低 （2）、熒光強度高 （3）、每輪PCR反應完成后都有熒光強度的增高，而且這種熒 光強度的增高和每輪循環(huán)后PCR產(chǎn)物的量成線性關系 （4）、沒有PCR產(chǎn)物時，沒有熒光 （5）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長范圍窄，各種 熒光不會產(chǎn)生熒光的交叉干擾,8,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,3、熒光定量PCR的化學基礎 目前常用的幾種熒光物質(zhì) （1）、Taqman探針類,5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團，探針完整時，沒有熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團產(chǎn)生熒光； 探針本身序列與目的基因序列互補，特異性高，退火后探針與目的基因互補序列結(jié)合，隨著PCR反應的進行，在Taq酶5’---3’外切酶的作用下，探針水解斷裂，熒光產(chǎn)生。,9,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,3、熒光定量PCR的化學基礎 Taqman常用的熒光基團和淬滅基團 熒光基團：5’端常用熒光基團FAM標記，最佳激發(fā)光波長：494-495nm，最大 發(fā)射光波長：518-520nm。 淬滅基團：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。 TAMRA本身也是一種熒光基團，激發(fā)光波長范圍較寬，500— 560nm，最佳激發(fā)光波長在560nm附近，對FAM基團產(chǎn)生的發(fā)射光 具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長較寬，560—650nm，當做 多重熒光時，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已 不常用。 BHQ和ECLIPSE為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會 產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團較 為常用，尤其在多重熒光定量PCR時常常被采用。,10,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,3、熒光定量PCR的化學基礎 Taqman探針的特點及應用 （1）、特異性強、準確性高 本身具有序列特異性，保證了所檢測目的基因的特異 性；其結(jié)構(gòu)特點保證了其所產(chǎn)生的熒光強度與PCR產(chǎn)物 的量成正比關系，因此準確性極高。 （2）、對引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的Taq酶就能滿足實驗的要求。 （3）、常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達幾十個拷貝) 及基因表達變化的精確分析（精確度可達0.1倍的變 化）。 （4）、目前價格也不是太貴，2OD 1000.00左右,11,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,3、熒光定量PCR的化學基礎 （2）、熒光染料類 目前常用的熒光染料為SYBR GreenⅠ、SYBR GreenⅡ、 SYTO9、HRM等。其共同性質(zhì)為： （a）、結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處 （b）、與雙鏈DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光 （c）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失,12,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,3、熒光定量PCR的化學基礎 熒光染料的特點及應用 （1）、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強度與 雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高； （2）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析； （3）、SYBR GreenⅠ染料本身價格便宜，但是做熒光定量PCR時對引物設 計的要求很高；對Taq酶要求較高，最好是HotStar Taq酶，或者操 作時需要嚴格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴 增會嚴重干擾結(jié)果的準確性，尤其是模板含量較低時； （4）、適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩； （5）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。 （6）、對PCR反應的毒性，能抑制PCR反應，降低PCR反應的效率。,13,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,4、熒光定量PCR的數(shù)學原理 對于普通的PCR反應來說 n,Xn=X0（1＋E）,上式中， Xn為n輪PCR循環(huán)后，目的基因PCR產(chǎn)物的量；n為PCR循環(huán)數(shù)；X0 為目的基因的初始模板量，E為PCR的反應效率，0≤E≤1。,14,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,4、熒光定量PCR的數(shù)學原理 由于PCR反應體系中熒光物質(zhì)的熒光強度與PCR產(chǎn)物的量成正比，所以 用熒光強度來代替PCR產(chǎn)物的量，我們可以得到： Rn= RB+ X0(1+ E) Rs,n,總熒光信號強度=本底信號+分子數(shù)量×單位信號強度,Rn：第n個循環(huán)時的總信號 RB：本底 RS：單位信號強度 X0：起始DNA數(shù)目 E： PCR效率,15,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,4、熒光定量PCR的數(shù)學原理 當循環(huán)數(shù)n等于CT值時，所有樣品熒光信號強度變化量的 對數(shù)全部一致，都達到了閾值。 RT= RB+ X0(1+ E) Rs lg(RT -RB) = lgX0 + CT lg(1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) –lg Rs 此時，PCR反應處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應效率E穩(wěn)定且近似相 等； lg(RT -RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0為變量，且這兩個變 量之間成一次性方程。 也就是說， 所有樣品的lgX0與到達閾值時的循環(huán)數(shù)n（Ct值）呈線性 關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模 板量,CT,16,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,5、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析 CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) –lg Rs （1）、PCR效率相等，在PCR擴增的指數(shù)期，E穩(wěn)定且為常數(shù)； （2）、RT –RB 要相等；也就是說到達閾值時樣品的熒光強度與樣品的熒 光本底之差要相等； （3）、樣品的單位信號強度Rs要相等，用熒光染料做熒光基團時，Rs 就 是每條PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強度，此熒光強度和 PCR產(chǎn)物的長短有關，PCR產(chǎn)物越長，結(jié)合的熒光染料越多， Rs 值 越大；用探針做熒光基團時，Rs 就等于PCR反應時，Taq酶水解掉 探針，探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度，和PCR產(chǎn)物的長度沒有 直接關系。,17,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,5、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析,左圖橫坐標是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是總的熒光強度Rn，改圖反映的是各個樣品隨著每輪PCR反應，其總的熒光量的實時變化；右圖橫坐標也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標是總的熒光強度與熒光本底的差值RT –RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的RT –RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關系才會成立。,18,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,5、熒光定量PCR線性關系成立的條件分析,LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)未知樣品Ct值，就可以在標準曲線上計算出未知樣品初始模板量。,19,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,6、雙鏈核酸的熔解曲線分析 使用熒光染料作為熒光基團時，由于熒光染料的特性隨著PCR反應的進 行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，SYBR GreenⅠ與雙鏈PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越 來越強，當PCR反應結(jié)束時，熒光強度達到最大，此時對PCR產(chǎn)物進行緩慢 加熱，從50℃一直加熱到99℃，在此過程中PCR產(chǎn)物按照TM值的大小雙鏈被 依次打開，熒光強度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：,20,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,6、雙鏈核酸的熔解曲線分析 對于核酸序列相同的PCR產(chǎn)物，其TM值也相同，而且其TM值在一個很小 的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強 度急劇降低，以熒光強度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖：,21,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,6、雙鏈核酸的熔解曲線分析 上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核 酸雙鏈，在一定的離子強度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈 核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其TM值也不 同，所以通過熔解曲線，我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生 型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染 料，鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個堿基的差異，通過熔解曲線也 能分析出來。 電泳是通過核酸分子量的大小和構(gòu)象來分析的，熔解曲線 是根據(jù)雙鏈核酸的TM值來分析的，這與瓊脂糖電泳及SSCP有異 曲同工之處。,22,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,7、絕對定量和相對定量,23,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,7、mRNA差異表達的相對定量分析 研究基因表達的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化 趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。 實驗操作中，由于樣品選取時樣品的細胞個數(shù)不可能完全相同，RNA提取 時得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初 始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進行基因表達調(diào)控研 究中都會用一些看內(nèi)參基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成 的差異。常用的內(nèi)參基因是在各種生理條件下表達量恒定的基因，這些基 因也常被稱為看家基因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常 被用作內(nèi)參照，常用的內(nèi)參基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基 因等。,24,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,7、mRNA差異表達的相對定量分析,以上公式就是引入內(nèi)參基因后相對定量分析的基本公式，并由此派生出兩種相對定量的分析方法：雙標準曲線法和Delta-delta Ct法。,25,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,7、mRNA差異表達的相對定量分析 （1）、雙標準曲線法 所謂的雙標準曲線法就是對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。 雙標準曲線法的特點： （a）、考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效 率，最大限度的避免了誤差； （b）、思路直觀、條理清晰、應用簡便，操作靈活，無需像Delta- delta CT法那樣對實驗進行反復的優(yōu)化； （c）、其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做標準曲 線； （d）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實驗。,26,一、熒光定量PCR技術的基礎理論,7、mRNA差異表達的相對定量分析 （2）、2 -△△CT法,該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相同且都為1，在試驗開始前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因作標準曲線，看兩者擴增效率的差別，假如兩者擴增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實驗中，無需再做標準品。 該方法要求嚴格的重復，因為CT值的差異只要有很小的變化，測得的結(jié)果就會有很大的差別。 該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。,27,二、引物及Taqman探針的設計,1、染料法引物的設計原則： （1）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異； （2）、避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物 自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)； （3）、檢測mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯 子； （4）、引物之間的TM相差避免超過2℃； （5）、典型的引物18到24個核苷長； （6）、目的基因和內(nèi)參基因所擴增的PCR產(chǎn)物長度盡量一致，不大于 300bp，這樣有利于使兩種基因PCR效率相同 （7）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其 特異性,28,二、引物及Taqman探針的設計,2、Taqman探針及引物的設計原則： 在Taqman探針法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，還要5’-3’外切酶 的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通PCR的延伸溫度為72℃，此溫度為Taq 酶聚合作用的最佳溫度；Taqman探針法反應中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活 性的同時，還需要Taq酶5’-3’外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，Taq酶 5’-3’外切酶活性的最佳溫度為60℃，所以Taqman PCR反應的一般采用兩步 法，即95℃變性，60℃復性延伸。 在Taqman探針及引物的設計過程中，引物的TM值已經(jīng)確定為60℃左 右，在每輪PCR循環(huán)的復性過程中（95→60℃），為了確保探針先于引物與 模板結(jié)合，這就要求探針的TM值高于引物10℃左右，所以Taqman探針及引 物一般都是引物TM值為60℃左右，探針的TM值為70℃左右。,29,二、引物及Taqman探針的設計,2、Taqman探針及引物的設計原則： （1）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異； （2）、檢測mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯 子； （3）、引物TM值為60℃左右，探針的TM值為70℃左右； （4）、探針的5’端應避免使用鳥嘌呤G，因為5’G會有淬滅作用，而且即使 是被切割下來還會存在淬滅作用； （5）、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量 G含量高會降低反應 效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針； （6）、引物之間的TM相差避免超過2℃； （7）、典型的引物長度為18-24bp，探針長度為15-45bp； （8）、PCR產(chǎn)物長度在50-150bp之間，這樣有利于使PCR效率相同； （9）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其 特異性,30,二、引物及Taqman探針的設計,2、Taqman探針及引物的設計原則：,探針中GC含量的差異對定量PCR反應效率的影響,31,二、引物及Taqman探針的設計,3、Taqman探針及引物的設計舉例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG 61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT 121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC 181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA 241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT 301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG 361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA 421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA 481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC 541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA 601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT 661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT 721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC,經(jīng)Oligo軟件驗證，探針TM值70℃左右，上下游引物的TM值都為60 ℃左右，二級結(jié)構(gòu) 分析，引物和探針比較理想，再經(jīng)BLAST分析，引物和探針特異性較好。,32,二、引物及Taqman探針的設計,4、Taqman探針及引物合成時注意事項 （1）、引物及探針設計好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測PCR產(chǎn)物，看是否和設計的長度吻合，再看看非特異 性擴增情況，必要時進行PCR產(chǎn)物的測序驗證； （3）、確定引物沒有問題后，再將探針送交合成，這樣安排能避免很多以 外的損失； （4）、探針合成好后，先檢測一下探針的質(zhì)量，250nm的探針終濃度， 25ul水，反應體系中只有水和探針，在熒光定量PCR儀上檢測， 95℃，2min; 95℃，20s，60℃，20s，40個cycles；看熒光本底和 熒光強度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著PCR反應，熒 光強度不會變化，假如熒光強度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量 較差，建議重新合成。,33,三、內(nèi)參基因的選擇,1、理想的內(nèi)參基因具有的特點 （1）、不存在假基因； （2）、高度或中度表達，排除太高或低表達 （3）、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織(如正常細胞和癌細胞)，而且其 表達量是近似的，無顯著性差別； （4）、表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關； （5）、其穩(wěn)定的表達水平與目標基因相似； （6）、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的 影響。 理想的內(nèi)參基因很少或者說不存在，因為所有基因在不同的細胞或組 織中、在細胞的不同生理時期、在不同的理化等外界刺激下，其表達量都 會有所差異，有時可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。盲目地使用 一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另 一方面可能引致錯誤甚至相反的結(jié)論。,34,三、內(nèi)參基因的選擇,2、常用內(nèi)參基因的表達情況 （1）、GAPDH GAPDH mRNA在不同癌組織(包括肺癌、乳腺癌、腎細胞癌等)中的表達 升高，在不同個體間、懷孕期間以及細胞周期的不同階段等變化很大，在 正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變 化。在各種因素(例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等) 刺激下，培養(yǎng)細胞GAPDH mRNA的表達水平也不同。 （2）、β-actin 當細胞向惡性轉(zhuǎn)化時，β-actin mRNA的表達水平增加。 （3）、18srRNA 當細胞有絲分裂時， 18srRNA表達量顯著上調(diào)。,35,三、內(nèi)參基因的選擇,3、內(nèi)參基因的選擇策略 根據(jù)實驗的實際情況，不同組織、不同細胞、細胞的不同生理時期、 不同的理化條件刺激等，查閱相關資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做 熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其 相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因 表達穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。 也可用geNorm內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。 對于比較精確的實驗，最好采用兩種或兩種以上表達穩(wěn)定的基因作為 內(nèi)參，對每種內(nèi)參基因測得的基因表達變化求方差和平均值。 http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/index.php,36,四、反應體系的優(yōu)化,1、為什么要優(yōu)化反應體系 與普通PCR反應相比，熒光定量PCR在反應中加入了熒光物質(zhì)，用以實 時顯示反應的進程，Taqman探針法在普通PCR反應體系中加入了與擴增片段 互補的一段帶熒光標記的核酸序列，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，還要 發(fā)揮5′-3′外切酶的活性來水解探針鏈來產(chǎn)生熒光；SybrGreen法加入了 能與雙鏈核酸結(jié)合的熒光染料，這些熒光物質(zhì)都能影響Taq酶的活性進而影 響PCR的反應效率。,普通PCR反應體系 模板 引物 Taq酶 Buffer Mg2＋ 水,定量PCR反應體系 模板 引物 熒光基團 Taq酶 Buffer Mg2＋ 水,37,四、反應體系的優(yōu)化,1、為什么要優(yōu)化反應體系,普通PCR結(jié)果電泳圖,添加熒光基團后PCR結(jié)果電泳圖,38,四、反應體系的優(yōu)化,2、如何優(yōu)化 由上圖可知，添加熒光基團后，PCR的反應效率幾乎為0，所以必須對 熒光定量PCR反應體系進行優(yōu)化，對體系中各個反應成分的濃度進行調(diào)整。 其中最關鍵的因素：Mg2＋濃度、熒光基團濃度、引物濃度 對于SYBR GreenⅠ熒光染料定量PCR反應體系來說， Mg2＋的最佳濃度 為3.0-4.0mM； 對于Taqman探針反應體系來說， Mg2＋的最佳濃度為5.0mM左右，引物 最佳濃度為500nM，探針的最佳濃度為250nM。,39,四、反應體系的優(yōu)化,2、如何優(yōu)化,SYBR GreenⅠ反應體系中Mg2＋濃度梯度優(yōu)化PCR電泳結(jié)果,40,四、反應體系的優(yōu)化,2、如何優(yōu)化,優(yōu)化后的Taqman探針體系實驗結(jié)果，Mg2＋濃度為5.0mM左右，引物濃度為500nM，探針濃度為250nM。,41,四、反應體系的優(yōu)化,3、自行配制熒光定量PCR試劑 （1）、常用的SYBR GreenⅠ預混酶（2X） HotStar TaqE ＋ Buffer ＋ Mg2 其中Mg2＋濃度為6～7mM （2）、常用的Taqman預混酶（2X） TaqE ＋ Buffer ＋ Mg2 其中Mg2＋濃度為10mM,42,五、實驗方案的選擇,定量PCR實驗方案,,定量PCR實驗方案,,熒光染料法,Taqman探針法,,雙標準曲線法,2 -△△CT法,雙標準曲線法,2 -△△CT法,43,五、實驗方案的選擇,定量PCR實驗方案 （1）、染料法適合于基因含量及基因表達變化的粗略分析或初篩；在分析 的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。 （2）、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達幾十個拷貝) 及基因表達變化的精確分析（精確度可達0.1倍的變化）。 （3）、雙標準曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求 較高的實驗。 （4）、 2 -△△CT法適合檢測精度要求一般，樣品量相對較少，檢測的基 因種類相對較多的實驗。 根據(jù)實驗的實際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、 經(jīng)費情況等來選擇合適的實驗方案。,44,六、誤差分析及操作規(guī)范,1、誤差分析 （1）、實驗方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差； 2 -△△CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會引起 誤差； Taqman探針法誤差相對較??； 雙標準曲線法誤差相對較小。 （2）、儀器設備引起的誤差 測量標準品核酸濃度時，分光光度計的誤差，從光密度值到質(zhì)量再 到摩爾量，誤差本身就很大（雙標準曲線法不一定非要測標準品的 濃度）； 定量PCR儀的誤差 耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等,45,六、誤差分析及操作規(guī)范,1、誤差分析 （3）、相對定量時內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定引起的誤差 （4）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤 差。 2、操作規(guī)范 熒光定量PCR是一項對操作要求很高的實驗，同時又是花費很高的一項 實驗，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達到這個目 標，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。 （1）、樣品的處理及選取 處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物 到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白 鼠攝食；選取試驗樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污 染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié) 締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。,46,六、誤差分析及操作規(guī)范,2、操作規(guī)范 （2）、核酸提取 加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保 得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計檢測核算質(zhì)量，RNA OD260/280＝ 2.0左右，DNA OD260/280＝1.8左右，最好再做電泳檢測；同一樣 品要提取2到3個RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。 （3）、得到的RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得 cDNA要用看家基因檢測。 （4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達恒定基因作為內(nèi)參。 （5）、做定量PCR時，先把除模板外的所有試劑預混，然后分裝到PCR管 中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。 （6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。,47,六、誤差分析及操作規(guī)范,2、操作規(guī)范 （7）、重復操作 讓重復操作最大的修正偏差？最有意義的重復是在提取樣品RNA時 就重復，同一個樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所 得的3份cDNA都做定量PCR檢測，這樣的重復之所以最有意義是因 為我們是把RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機檢測三步做了重復，這樣得出 的平均值要比只在上機檢測時對同一cDNA樣品做三個重復要有意義 的多。 同一個cDNA樣品做三個重復定量檢測求平均值主要是消除加樣時的 誤差，排槍加樣時，誤差很小，加樣時的誤差可以通過設幾個重復 檢測出來。,48,六、誤差分析及操作規(guī)范,2、操作規(guī)范,同一cDNA樣品的三個重復,49,六、誤差分析及操作規(guī)范,模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們 在擴增曲線上的CT值之差，應該相等，但是后邊幾個濃度低的樣品CT值明顯提 前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴重。,50,七、實驗中污染的防控,1、熒光定量PCR實驗中污染源的分析 （1）、PCR產(chǎn)物引起的污染 在檢測過程中，熒光定量PCR產(chǎn)物都是封閉在PCR管中的，不存在開 管檢測，所以有污染的話，最有可能是因為電泳檢測熒光定量PCR 產(chǎn)物時引起的污染，只要將電泳室與PCR加樣室隔離開，就能有效 的避免PCR產(chǎn)物的污染。 （2）、標準品引起的污染 常用的標準品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的PCR產(chǎn)物等，由于 標準品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中， 有可能引起污染。 （3）、高濃度的樣品引起的污染 高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會形成氣溶膠，造成污染。,51,七、實驗中污染的防控,2、熒光定量PCR實驗中污染的防控 （1）、對于PCR產(chǎn)物引起的污染 最簡單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個房 間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用dU代替dT配合 UNG酶，是解決PCR產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。 （2）、對于標準品引起的污染 目前只能是以預防，加標準品時最好采用專用移液器，不要和加樣 的移液器交叉使用，加標準品時最好在通風廚中進行，和加樣的操 作臺隔離開。 （3）、對于樣品間的檢查污染 樣品間的交叉污染往往是因為高濃度的樣品在加樣室形成了氣溶 膠，因為樣品的cDNA鏈較長，經(jīng)常開紫外燈，把長鏈cDNA打斷，能 有效避免此類污染的發(fā)生，另外保持加樣室空氣流通也有助于防止 此類污染。,52,七、實驗中污染的防控,2、熒光定量PCR實驗中污染的防控 （4）、對于未知污染源的頑固的污染的防控 這類污染也經(jīng)常出現(xiàn)，找不到明確的污染源，而且此類污染又非常 頑固，對于這種情況，最好的辦法就是不去管它，在采用絕對定量 和雙標準曲線法時，污染的初始模板量可由陰性對照檢測出來，知 道了污染的初始模板量后，我們可以把測得樣品的初始模板量減去 污染的初始模板量，在分析時就避免了污染造成的誤差。,53,七、實驗中污染的防控,圖中最后一個樣品為陰性對照，本來應該是一直線，但是儀器也檢測到了熒光信號,54,七、實驗中污染的防控,電泳結(jié)果顯示，該陰性對照確實有PCR產(chǎn)物出現(xiàn),55,七、實驗中污染的防控,通過定量PCR檢測，測得該陰性樣品中含有227個初始模板。假如這個污染屬于是頑 固的未知污染，可以用正常樣品測得的初始模板量減去227，來避免污染引起的誤差,56,八、實驗結(jié)果的分析,實驗結(jié)束后將得到的結(jié)果進行分析，現(xiàn)在很多軟件都帶有結(jié)果的自動分 析功能，可以將結(jié)果直接轉(zhuǎn)化為各種圖表及柱狀圖。對于和實驗預期偏離 比較大的樣品，需重復實驗。,57,謝 謝！,電話：15238020968，QQ ：458261751，都市巡洋艦 如有問題需要交流，請隨時聯(lián)系！,58,