基因組學(xué)基因診斷與基因治療PPT課件

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基 因 組 學(xué),1,Content,基因組學(xué)的概念 基因組學(xué)的特點(diǎn)：七性三化 基因組學(xué)發(fā)展的里程碑 基因組學(xué)的重要進(jìn)展 基因組學(xué)研究的意義 小鼠基因組技術(shù),2,基因組學(xué)的概念,所有生命都具有指令其生長(zhǎng)與發(fā)育，維持其結(jié)構(gòu)與功能所必需的遺傳信息，生物所具有的攜帶遺傳信息的遺傳物質(zhì)總和稱(chēng)為基因組?；蚪M學(xué)是研究生命體全部遺傳信息的一門(mén)科學(xué)?；蚪M學(xué)是一門(mén)年青的學(xué)科，并處在迅速發(fā)展之中。,3,基因組學(xué)的概念 基因組學(xué)的特點(diǎn)：七性三化 基因組學(xué)發(fā)展的里程碑 基因組學(xué)的重要進(jìn)展 基因組學(xué)研究的意義 小鼠基因組技術(shù),內(nèi) 容,4,1991 人類(lèi)基因圖數(shù)據(jù)庫(kù)正式建立 1992 人類(lèi)染色體低分辨率的基因聯(lián)鎖圖出版,BAC克隆技 術(shù)問(wèn)世 1993 國(guó)際基因分子表達(dá)式分析組織開(kāi)始，建立起有效的基因圖和cDNA基因序列，PAC克隆技術(shù)問(wèn)世 1994 基因圖5年計(jì)劃提前一年完成。完成了每個(gè)人類(lèi)染 色體的繪制 1995 鳥(niǎo)槍法完成流感嗜血桿菌基因組測(cè)序，發(fā)表人類(lèi)基因組YAC重疊群物理圖和STS物理圖,基因組學(xué)的重要進(jìn)展,5,1996 有30000個(gè)序列的人類(lèi)基因圖的細(xì)節(jié)被描出來(lái)。完 成酵母基因組和第一個(gè)古細(xì)菌詹氏甲烷球菌基因組 測(cè)序1997 完成大腸桿菌基因組測(cè)序1998 完成第一個(gè)多細(xì)胞生物線蟲(chóng)基因組測(cè)序 1999 Celera Genomics宣布首條人類(lèi)染色體完成測(cè)序，人 類(lèi)第22號(hào)染色體DNA全序列測(cè)定。1999 中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類(lèi)基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定人類(lèi)基因組全部序列的1%。 2000 完成果蠅基因組測(cè)序,6,基因診斷與基因治療,蚌埠醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,7,Content,基因診斷 gene diagnosis 基因治療 gene therapy,Content,8,基因診斷的概況,基因診斷經(jīng)歷了三個(gè)基本發(fā)展階段第一階段：以DNA分子雜交為基礎(chǔ)；RFLP進(jìn)行分析第二階段：應(yīng)用PCR技術(shù)第三階段：應(yīng)用基因芯片技術(shù),9,工 具：放射性同位素標(biāo)記或熒光分子標(biāo)記 的DNA分子探針 原 理：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則（DNA分子雜交） 基因診斷：是以DNA或RNA為診斷材料，通過(guò)檢 查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程，又稱(chēng)DNA診斷或分子診斷,10,基因診斷過(guò)程,制備基因探針提取目的基因，獲得單鏈DNAPCR擴(kuò)增DNA目的DNA與尼龍膜結(jié)合探針與目的DNA互補(bǔ)配對(duì)沖洗尼龍膜檢測(cè)雜合分子,關(guān)鍵要素： 探針DNA、目的DNA、信號(hào)檢測(cè),11,基因診斷的基礎(chǔ)技術(shù),核酸雜交PCRDNA序列測(cè)定DNA芯片技術(shù),12,基因診斷的臨床應(yīng)用,遺傳病的基因診斷 腫瘤的基因診斷 感染性疾病的基因診斷 基因診斷在法醫(yī)學(xué)鑒定中的應(yīng)用 基因診斷在器官移植配型中的應(yīng)用,13,舉例：鐮刀狀紅細(xì)胞貧血β－珠蛋白基因的第六個(gè)密碼子A→T↓表達(dá)產(chǎn)物：谷氨酸→纈氨酸一個(gè)堿基突變→缺失1個(gè)MstⅡ內(nèi)切酶位點(diǎn)正常人： 1.1kb患者： 1.3kb,,14,,,,,,,,,,5’,3’,,,,,5’,3’,1.1 kb,1.3kb,Mst II酶切位點(diǎn)（CCTNATG）,正?；?突變基因,,,,,,,,1.3kb,1.1kb,0.2kb,1,2,3,1、正常人2、突變攜帶者 3、患者,,,,,,,,,,,,,,,15,基因治療的概念,狹義概念將具有正常功能的基因置換或增補(bǔ)患者體內(nèi)有缺陷的基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。廣義概念將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，最終達(dá)到治療疾病的目的。,16,基因治療的類(lèi)型,體細(xì)胞基因治療（somatic cell gene therapy）：需要對(duì)普通的細(xì)胞進(jìn)行操作，通常是可以從有機(jī)體內(nèi)取出細(xì)胞，轉(zhuǎn)染然后放回體內(nèi)。生殖細(xì)胞基因治療（germ cell gene therapy）：受精卵缺陷的基因被正常的基因所代替，然后重新移植到母體中。胚胎治療通常通過(guò)微注射的方法進(jìn)行的，從理論上講可以用來(lái)治療任何遺傳性疾病。,倫 理,17,基因治療的總體策略,基因矯正 基因置換 基因增補(bǔ) 基因失活 “自殺基因”的應(yīng)用免疫基因治療耐藥基因治療,18,（一）基因矯正（gene correction）對(duì)于致病基因中的異常堿基進(jìn)行精確修復(fù)，使其恢復(fù)正常功能； （二）基因置換（gene replacement）用正?；蛟谠惶鎿Q致病基因，使細(xì)胞DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)；,19,（三）基因增補(bǔ)（gene augmentation）將正常基因?qū)牖颊唧w細(xì)胞內(nèi)，使其整合到染色體中一起表達(dá)，以補(bǔ)償缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除。（四）基因失活（gene inactivation）：指將特定的反義核酸導(dǎo)入細(xì)胞，通過(guò)堿基互補(bǔ)作用與mRNA結(jié)合，阻斷腫瘤細(xì)胞中基因的異常表達(dá)，以抗腫瘤、抗病毒。反義RNA: 干擾mRNA的互補(bǔ)RNA;反義DNA: 干擾DNA的互補(bǔ)DNA.,20,（五）“自殺基因”的應(yīng)用自殺基因，這種基因?qū)胧荏w細(xì)胞后可產(chǎn)生一種酶，它可將原無(wú)細(xì)胞毒性或低毒藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)，將細(xì)胞受體細(xì)胞殺死，這種基因被稱(chēng)為“自殺基因”。自殺基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后，可將腫瘤細(xì)胞殺死。但對(duì)正常細(xì)胞則無(wú)傷害作用。,21,（六）免疫基因治療將某些細(xì)胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因?qū)肽[瘤患者體內(nèi)，以增強(qiáng)患者的抵抗力。 （七）耐藥基因治療在腫瘤化療過(guò)程中， 把產(chǎn)生抗藥物毒性的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而使患者能耐受更大劑量的化療。,22,基因治療的應(yīng)用及前景,(一)基因治療應(yīng)滿(mǎn)足的條件：1、單基因缺陷疾病2、僅限體細(xì)胞的基因治療3、靶細(xì)胞易獲取、培養(yǎng)、及回輸體內(nèi)。4、治療效果應(yīng)勝過(guò)對(duì)病人的危害。5、表達(dá)水平無(wú)需調(diào)控且無(wú)副作用。6、需經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證安全可行。,23,（二）基因治療有待解決的問(wèn)題1、難以獲得真正有治療作用的基因。 2、外源基因的表達(dá)難以在體內(nèi)精確調(diào)控。3、體細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其生物學(xué)特性會(huì)有改變。 4、過(guò)多的外源蛋白對(duì)機(jī)體帶來(lái)可能的影響。5、隨機(jī)整合潛在的威脅。,24,基因治療實(shí)例,1.復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。,SCID患者生存在無(wú)菌環(huán)境中,25,2.乙型血友病,XR ，患者凝血因子Ⅸ缺乏，臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時(shí)間長(zhǎng)，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。 例如：我國(guó)學(xué)者薛京倫實(shí)施的FⅨ的基因治療。,26,3.黑色素瘤的基因治療,腫瘤Gene治療是人們十分關(guān)注的問(wèn)題，進(jìn)行了廣泛的探索。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞——TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無(wú)副作用，利用此特點(diǎn)協(xié)助治療腫瘤。,27,4.胰腺癌的基因治療研究,28,胰腺癌是腹部外科最難獲得早期診斷，且預(yù)后最差的惡性腫瘤。 雖然目前在胰腺癌的發(fā)生、演進(jìn)、早期診斷和綜合治療等方面取得了一些進(jìn)展，但仍需要更多的研究去解決這些問(wèn)題，攻克胰腺癌依然任重道遠(yuǎn)。,胰腺癌治療現(xiàn)狀：,29,傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物對(duì)胰腺癌并無(wú)益，目前治療胰腺癌的一線藥物是吉西他濱。 1996年美國(guó)FDA批準(zhǔn)吉西他濱用于治療進(jìn)展期胰腺癌。 研究結(jié)果表明，接受吉西他濱治療者生活質(zhì)量?jī)?yōu)于氟尿嘧啶，但治療反應(yīng)率和生存時(shí)間相似。 吉西他濱+特羅凱聯(lián)合用藥延長(zhǎng)了數(shù)星期的生存期，其他的聯(lián)合用藥方案亦在研究中。,30,胰腺癌治療現(xiàn)狀：,近年來(lái)，胰腺癌的遠(yuǎn)期療效和預(yù)后并未帶來(lái)突破性進(jìn)展，研究表明胰腺癌的發(fā)生發(fā)展為多基因參與、多步驟發(fā)生的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。 基因治療是繼手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)療法之后腫瘤治療的最有前景治療方案之一。,31,自殺基因治療：,又稱(chēng)基因定向酶藥物前體療法： 是利用轉(zhuǎn)基因的方法將 藥敏基因 導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。 也就是說(shuō)，使無(wú)毒的藥物前體通過(guò)該基因表達(dá)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞有毒性作用的藥物，干擾腫瘤細(xì)胞DNA 的合成，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而殺死腫瘤細(xì)胞。 這種使腫瘤細(xì)胞自殺的基因稱(chēng)“自殺基因”。,32,如： 自殺基因 + 病毒載體 轉(zhuǎn)染重組載體,,,藥物前體 無(wú)毒 Gene→酶→ ↓藥物復(fù)合物 有毒,,細(xì)胞死亡,33,旁觀者效應(yīng):“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。,旁觀者效應(yīng),34,自殺基因治療進(jìn)展：,胰腺癌的自殺基因治療已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，有著廣闊的前景； 但目前的成果尚局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，要想進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療，還有許多問(wèn)題尚待解決。 雖然從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)過(guò)渡到臨床應(yīng)用仍有一段距離，相信隨著研究的不斷深入，基因治療在胰腺癌的治療中能夠發(fā)揮更大的作用，必將成為一種有效的胰腺癌輔助治療手段。,35,反義基因治療：,這種方法的目的是阻止腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。 反義寡核苷酸以互補(bǔ)的形式與特定的DNA或RNA序列結(jié)合, 從而阻止DNA的轉(zhuǎn)錄或RNA的翻譯, 使腫瘤基因無(wú)法表達(dá)。 由于K-ras基因突變?cè)谝认侔┲凶顬槌Ｒ?jiàn), 因此許多反義基因治療都以其為靶點(diǎn)，許多研究表明針對(duì)K-ras的反義寡核苷酸對(duì)胰腺癌有抑制作用。,36,干擾RNA基因治療,對(duì)RNA干擾的認(rèn)識(shí)來(lái)源于用線蟲(chóng)（C. elegans）和果蠅。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有義鏈RNA（sense RNA）或反義鏈RNA（anti-sense RNA）均能抑制線蟲(chóng)基因的表達(dá)，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲(chóng)體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達(dá)。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達(dá)途徑。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。,1.RNA干擾現(xiàn)象,RNA干擾（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過(guò)程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。,37,2. RNA干擾的機(jī)制,RNA干擾過(guò)程主要有2個(gè)步驟：,（1）小干擾性RNA（siRNA）,（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱(chēng)為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC)。,該復(fù)合體可識(shí)別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。,長(zhǎng)雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，稱(chēng)為小干擾性RNA（small interfering RNA，siRNA）。,38,