（浙江選考）2020版高考生物新導學大一輪復習 第33講 基因工程（含解析）講義.docx

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第33講　基因工程 [考綱要求]　1.工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生(a)。2.基因工程的原理和技術(shù)(b)。3.基因工程的應用(a)。4.活動：提出生活中的疑難問題，設計用基因工程技術(shù)解決的方案(c)。 考點一　基因工程的含義及操作工具 1.基因工程的誕生 (1)概念：基因工程是狹義的遺傳工程。廣義的遺傳工程泛指把一種生物的遺傳物質(zhì)(細胞核、染色體脫氧核糖核酸等)移到另一種生物的細胞中去，并使這種遺傳物質(zhì)所帶的遺傳信息在受體細胞中表達。 (2)核心：構(gòu)建重組DNA分子，早期也將基因工程稱為重組DNA技術(shù)。 (3)誕生時間：20世紀70年代。 (4)理論基礎：DNA是生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立以及遺傳信息傳遞方式的認定。 (5)技術(shù)保障：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒載體的發(fā)現(xiàn)和運用。 2.基因工程的基本工具 歸納總結(jié)　與DNA有關(guān)的酶的比較 項目 作用底物 作用部位 形成產(chǎn)物 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 粘性末端或平末端 DNA連接酶 DNA片段 磷酸二酯鍵 重組DNA分子 DNA聚合酶 脫氧核苷酸 磷酸二酯鍵 子代DNA DNA解旋酶 DNA分子 堿基對間的氫鍵 形成脫氧核苷酸單鏈 DNA(水解)酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 游離的脫氧核苷酸 (1)限制性核酸內(nèi)切酶只能用于切割目的基因(　　) (2)DNA連接酶能將兩堿基間通過形成的氫鍵連接起來(　　) (3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體(　√　) (4)載體的作用是攜帶目的基因?qū)胧荏w細胞中，使之穩(wěn)定存在并表達(　√　) (5)DNA連接酶能夠?qū)⑷我?個DNA片段連接在一起(　　) 觀察下圖所示過程，回答需要的工具酶及相關(guān)問題： (1)①是限制性核酸內(nèi)切酶，②是DNA連接酶，二者的作用部位都是磷酸二酯鍵。 (2)限制性核酸內(nèi)切酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。 (3)說明限制性核酸內(nèi)切酶有何特性？具有專一性。 1.科學家將人的生長激素基因與大腸桿菌的DNA分子進行重組，并使其成功地在大腸桿菌中得以表達。但在進行基因工程的操作過程中，需使用特定的限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ的識別序列和切點是—↓GATC—，據(jù)圖回答： (1)過程①表示的是采用________的方法來獲取目的基因。 (2)根據(jù)圖示分析，在形成重組DNA分子的過程中，應用限制性核酸內(nèi)切酶_______(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)切割質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶_______(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)切割目的基因。 (3)人的基因之所以能與大腸桿菌的DNA分子進行重組，原因是__________________。 (4)人體的生長激素基因能在大腸桿菌體內(nèi)成功表達出人的生長激素是因為_____________。寫出目的基因?qū)氪竽c桿菌中后表達的過程：__________________________________。 答案　(1)逆轉(zhuǎn)錄　(2)Ⅰ　Ⅱ　(3)人的基因與大腸桿菌DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)相同　(4)人與細菌共用一套(遺傳)密碼子　生長激素基因mRNA生長激素 解析　(2)根據(jù)圖示分析可知，目的基因插入了質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因的內(nèi)部，而該位置有限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列，因此在形成重組DNA分子過程中，應用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ切割質(zhì)粒；而目的基因的兩側(cè)均含有能被限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ識別的堿基序列，所以用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ切割目的基因。用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和載體后形成的末端按堿基互補配對原則進行連接。(3)人的基因之所以能與大腸桿菌DNA分子進行重組，是因為人的基因與大腸桿菌DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)相同。(4)人體的生長激素基因能在大腸桿菌體內(nèi)成功表達是因為人和大腸桿菌共用一套(遺傳)密碼子；目的基因?qū)氪竽c桿菌中后表達的過程為生長激素基因mRNA生長激素。 2.(2018金麗衢十二校聯(lián)考)下表是幾種限制性核酸內(nèi)切酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識別序列及切割位點 ↓ GGATCC CCTAGG ↑ ↓ TGATCA ACTAGT ↑ ↓ GATC CTAG ↑ ↓ AAGCTT TTCGAA ↑ (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應選用____________兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌中。 (2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為_____，對于該部位，這兩種酶_____(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒，最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 (5)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自_____。 答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受 (2)四環(huán)素　引物甲和引物丙 (3)　都不能 (4)7 (5)受體細胞 解析　(1)分析4種限制性核酸內(nèi)切酶識別的序列可知：BamHⅠ和BclⅠ的識別序列中含有Sau3AⅠ的識別序列，這三種酶切割DNA后可以產(chǎn)生相同的粘性末端。為保證質(zhì)粒上含有標記基因，切割質(zhì)粒時不能選用BamHⅠ和Sau3AⅠ，應選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割；酶切后的載體和目的基因片段，需用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒。為了擴增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的大腸桿菌中。(2)重組質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因結(jié)構(gòu)完整，氨芐青霉素抗性基因結(jié)構(gòu)被破壞，在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素可以篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌。根據(jù)圖2可知，PCR擴增該目的基因時，需用引物甲和引物丙兩種引物。(3)BamHⅠ酶切產(chǎn)生的粘性末端為和，BclⅠ酶切產(chǎn)生的粘性末端為和，經(jīng)DNA連接酶連接后，連接部位的6個堿基對序列為或，該部位的序列不能被BamHⅠ和BclⅠ識別，因此不能被這兩種酶切開。(4)圖1質(zhì)粒中含有Sau3AⅠ酶的3個識別序列，如圖(A、B、C分別表示相鄰切點間的DNA片段)： 用Sau3AⅠ酶切，若在一個切點處切割可得到：B＋C＋A、C＋A＋B、A＋B＋C三種DNA片段(但其大小相同)；若在兩個切點處切割可得到：A、B＋C、A＋C、B、A＋B、C六種DNA片段(其大小均不同)；若在三個切點處均切割，可得到A、B、C三種大小不同的DNA片段，綜上所述，用Sau3AⅠ酶切質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。(5)噬菌體不能獨立生活，必需依賴活細胞才能生存，所以噬菌體作為載體時，其DNA復制所需的原料來自所導入的受體細胞。 限制性核酸內(nèi)切酶的選擇方法 (1)根據(jù)目的基因兩端的限制性核酸內(nèi)切酶切點確定限制性核酸內(nèi)切酶的種類 ①應選擇切點位于目的基因兩端的限制性核酸內(nèi)切酶，如圖甲可選擇PstⅠ。 ②不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制性核酸內(nèi)切酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 ③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點)。 (2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制性核酸內(nèi)切酶的種類 ①所選限制性核酸內(nèi)切酶要與切割目的基因的限制性核酸內(nèi)切酶相一致，以確保具有相同的粘性末端(或平末端)。 ②質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制性核酸內(nèi)切酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制性核酸內(nèi)切酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選酶的切點不只一個，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復制原點，則切割重組后的片段進入受體細胞后不能自主復制。 考點二　基因工程的基本操作步驟、應用及相關(guān)的設計方案 1.基因工程的基本操作步驟 (1)獲得目的基因 目的基因序列已知：化學合成或PCR擴增； 目的基因序列未知：從基因文庫中獲取。 (2)形成重組DNA分子(基因工程的核心)：通常用相同的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體DNA，然后用DNA連接酶將目的基因和載體DNA連接在一起，形成重組DNA分子。 (3)將重組DNA分子導入受體細胞 ①常用的受體細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動植物細胞等。 ②導入方法：用氯化鈣處理大腸桿菌，可以增加大腸桿菌細胞壁的通透性，使重組質(zhì)粒容易進入。 (4)篩選含有目的基因的受體細胞 ①篩選原因：并不是所有的細胞都接納了重組DNA分子，因此，需篩選含目的基因的受體細胞。 ②篩選方法：用含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體細胞，選擇含重組質(zhì)粒的受體細胞。 (5)目的基因的表達 目的基因在宿主細胞中表達，產(chǎn)生人們需要的功能物質(zhì)。 2.基因工程的應用 應用領(lǐng)域 優(yōu)點 基因工程與遺傳育種 轉(zhuǎn)基因植物 所需時間短，克服了遠緣親本難以親合的缺陷 轉(zhuǎn)基因動物 指轉(zhuǎn)入了外源基因的動物。優(yōu)點是省時、省力，并能取得一定的經(jīng)濟效益 基因工程與疾病治療 基因工程藥物 主要有胰島素、干擾素和乙型肝炎疫苗等 基因治療 向目標細胞中引入正常功能的基因，以糾正或補償基因的缺陷，達到治療的目的 基因工程與生態(tài)環(huán)境保護 開發(fā)可降解的新型塑料；改造分解石油的細菌，提高其分解石油的能力等 (1)抗蟲基因即使成功地插入到植物細胞染色體上也未必能正常表達(　√　) (2)應用DNA探針技術(shù)，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(　　) (3)將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株(　√　) (4)利用乳腺生物反應器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因為將人的血清白蛋白基因?qū)肓藙游锏娜橄偌毎?　　) (5)為培育出抗除草劑的作物新品種，導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體(　　)  如圖為抗蟲棉的培育過程，請據(jù)圖回答下列問題： (1)該基因工程中的目的基因和載體分別是什么？一般情況下，為什么要用同一種限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和載體？ 提示　目的基因是Bt毒蛋白基因，載體是Ti質(zhì)粒。用同一種限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和載體，可以獲得相同的粘性末端，便于形成重組DNA分子。 (2)該實例中為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？ 提示　由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細胞且能整合到受體細胞的染色體DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受體細胞的染色體DNA上。 (3)該實例中，檢測目的基因是否表達常見的方法是什么？ 提示　用棉葉飼喂棉鈴蟲。 1.三種獲取目的基因方法的比較 項目 化學合成法 聚合酶鏈式反應(PCR) 建立基因文庫法 適用對象 目的基因序列已知 目的基因序列已知 目的基因序列未知 過程 ①逆轉(zhuǎn)錄法：獲取mRNA→合成DNA單鏈→合成DNA雙鏈(目的基因) ②以單個脫氧核苷酸為原料按照已知DNA序列直接人工合成 在體外通過酶促反應有選擇地大量擴增特定的DNA片段，即目的基因 利用限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、質(zhì)粒等工具建立基因文庫→篩選出目的基因 優(yōu)缺點 專一性強，獲取的目的基因較小 速度快，以指數(shù)方式 擴增 操作相對簡便，但工作量大 2.形成重組DNA分子 通常是采用相同的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體DNA(如質(zhì)粒)，獲得相同的粘性末端，在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒，如圖1所示。但應用此種方式，在實際操作中目的基因、載體質(zhì)粒經(jīng)DNA連接酶處理后，獲得的產(chǎn)物可能有三種：①目的基因與目的基因連接物；②質(zhì)粒與質(zhì)粒連接物；③目的基因與質(zhì)粒連接物。為了使目的基因與質(zhì)粒能定向連接，可使用兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，然后在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒，如圖2所示。 3.有關(guān)基因工程操作易錯分析 (1)基因文庫中的基因保存在受體菌中。 (2)原核生物繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少，有利于目的基因的復制與表達，因此常采用大腸桿菌等原核生物作為受體細胞。 (3)植物細胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過程成為完整植物體，因此受體細胞可以是受精卵也可以是體細胞；動物基因工程中的受體細胞一般是受精卵。 (4)操作工具有三種，但常用工具酶有兩種，載體不是酶。在基因工程操作步驟“獲得目的基因”和“形成重組DNA分子”兩個過程中，通常用同種限制性核酸內(nèi)切酶，目的是產(chǎn)生相同的粘性末端(或平末端)；DNA連接酶只在“形成重組DNA分子”操作中用到。 (5)一般情況下，用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，但有時可用兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。 (6)標記基因的種類和作用：標記基因的作用——篩選、檢測目的基因是否導入受體細胞，常見的標記基因有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。 命題點一　基因工程的操作程序 1.為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組，再借助農(nóng)桿菌導入菊花中。 下列操作與實驗目的不符的是(　　) A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰毎? C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞 D.用分子雜交技術(shù)檢測C基因是否整合到菊花染色體上 答案　C 解析　在形成重組DNA分子時，為保證目的基因與載體的連接，需要用同種限制性核酸內(nèi)切酶進行切割產(chǎn)生相同的粘性末端，才能通過DNA連接酶連接，圖中目的基因的兩端和啟動子與終止子之間都有限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ的切割位點，因此選用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ切割目的基因和載體，A正確；菊花為雙子葉植物，將目的基因?qū)腚p子葉植物細胞的常用方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，B正確；圖2中重組質(zhì)粒中的抗性基因為潮霉素抗性基因，應該在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細胞，C錯誤；要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，常用DNA分子雜交技術(shù)，D正確。 2.在某些深海魚中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因afp對提高農(nóng)作物的抗寒能力有較高的應用價值。如圖所示是獲得轉(zhuǎn)基因萵苣的技術(shù)流程，請據(jù)圖回答下列問題： (1)獲取目的基因的主要途徑包括從基因文庫中獲取和______________。 (2)①過程需要的酶有____________________、__________________。 (3)重組質(zhì)粒除了帶有抗凍蛋白基因afp以外，還必須含有啟動子、終止子和____________，這樣才能構(gòu)成一個完整的基因表達載體。 (4)如果受體細胞C1是土壤農(nóng)桿菌，則將目的基因?qū)胨哪康氖抢棉r(nóng)桿菌的_________，使目的基因進入受體細胞C2，并將其插入到受體細胞C2中的______________上，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達，形成轉(zhuǎn)基因萵苣。 答案　(1)化學方法合成　(2)限制性核酸內(nèi)切酶　DNA連接酶　(3)抗生素抗性基因(或標記基因)　(4)轉(zhuǎn)化作用　染色體DNA 解析　(1)獲取目的基因的主要途徑有從基因文庫中獲取和化學方法合成。(2)①過程為形成重組DNA分子，需要用到限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。(3)一個完整的重組DNA分子包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因。(4)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用的是農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA上，進而使目的基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達。 命題點二　基因工程的原理和應用 3.下列關(guān)于基因工程應用的敘述，正確的是(　　) A.基因治療就是把缺陷基因誘變成正常基因 B.基因診斷的基本原理是DNA分子雜交 C.一種基因探針能檢測水體中的各種病毒 D.利用基因工程生產(chǎn)乙肝疫苗時，目的基因存在于人體B淋巴細胞的DNA中 答案　B 解析　基因治療就是向目標細胞中引入正常功能的基因，以糾正或補償基因的缺陷，達到治療疾病的目的，A錯誤；基因診斷又稱DNA診斷或分子診斷，通過分子生物學和分子遺傳學的技術(shù)，直接檢測出分子結(jié)構(gòu)水平和表達水平是否異常，從而對疾病做出判斷，利用的原理就是DNA分子雜交，B正確；基因探針是用放射性同位素(或熒光分子)標記的含有目的基因的DNA片段，一種基因探針只能檢測水體中的一種或一類病毒，C錯誤；基因工程生產(chǎn)乙肝疫苗是通過構(gòu)建含有乙肝病毒表面抗原基因的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染(就是讓質(zhì)粒進入宿主細胞)相應的宿主細胞，如酵母菌、CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞，一種可以無限繁殖的細胞)，生產(chǎn)乙肝表面抗原蛋白，D錯誤。 4.科學家將魚抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相對寒冷的環(huán)境中生長。質(zhì)粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四種限制性核酸內(nèi)切酶切割位點，下圖是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程的示意圖(ampr為抗氨芐青霉素基因)，其中①～④是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程中的相關(guān)步驟，Ⅰ、Ⅱ表示相關(guān)結(jié)構(gòu)或細胞。請據(jù)圖作答： (1)在構(gòu)建重組DNA時，可用一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶進行切割，為了避免目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，在此實驗中應該選用限制性核酸內(nèi)切酶__________分別對______、______進行切割，切割后產(chǎn)生的DNA片段分別為______、______種。 (2)培養(yǎng)基中的氨芐青霉素會抑制番茄愈傷組織細胞的生長，要利用該培養(yǎng)基篩選已導入魚的抗凍蛋白基因的番茄細胞，應使Ⅰ重組DNA中含有________________作為標記基因。 (3)研究人員通常采用____________法將魚抗凍蛋白基因?qū)敕鸭毎麅?nèi)。 答案　(1)PstⅠ、SmaⅠ　含魚抗凍蛋白基因的DNA　質(zhì)?！?　2 (2)抗氨芐青霉素基因 (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 解析　(1)在形成重組DNA分子中，如果目的基因和載體用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割，獲得的粘性末端相同，將會發(fā)生自身環(huán)化現(xiàn)象，故應選用不同的限制性核酸內(nèi)切酶分別對目的基因和載體切割，以獲得不同的粘性末端，故應選用PstⅠ和SmaⅠ對含魚抗凍蛋白基因的DNA和質(zhì)粒進行切割，PstⅠ和SmaⅠ在魚抗凍蛋白基因的DNA上共有3個酶切位點，切割后產(chǎn)生4個DNA片段，而環(huán)狀質(zhì)粒上有兩個酶切位點，切割后產(chǎn)生2個DNA片段。 (2)能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長的細胞具有抗氨芐青霉素基因，故Ⅰ重組DNA分子中應含有抗氨芐青霉素基因作為標記基因。 (3)將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。 基因診斷與基因治療 (1)基因診斷 ①方法：DNA分子雜交法(即DNA探針法)，該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單鏈的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。 ②步驟：抽取病人的組織或體液作為化驗樣品；將樣品中的DNA分離出來，用化學法或熱處理法使樣品DNA解旋，將事先制作好的DNA探針引入化驗樣品中，這些已知的經(jīng)過標記的探針能夠在化驗樣品中找到互補鏈，并與之結(jié)合(雜交)在一起，找不到互補鏈的DNA探針，則可以被洗脫。這樣通過對遺留在樣品中的標記過的DNA探針進行基因分析，就能檢出病人所得的病。 (2)基因治療 ①原理：利用正常基因糾正或補償基因的缺陷，即把正?；?qū)牖颊唧w內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的，而原有缺陷基因一般不作處理。 ②方法：有體外基因治療和體內(nèi)基因治療，體外基因治療方法療效好。如重度免疫缺陷癥的體外基因治療方法： 體內(nèi)基因治療：用基因工程的方法，直接向人體組織細胞中轉(zhuǎn)移基因。 命題點三　設計用基因工程技術(shù)解決的方案 5.人組織纖溶酶原激活物(htPA)是一種重要的藥用蛋白，可在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中獲得。流程如下： (1)為獲取更多的卵(母)細胞，要對供體母羊注射____________，使其超數(shù)排卵。采集的精子需要經(jīng)過________，才具備受精能力。 (2)在htPA基因與質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子的過程中，下列哪項是必需的(　　) A.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 B.DNA連接酶和DNA聚合酶 C.DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶 D.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶 (3)轉(zhuǎn)基因羊的培育過程中，常用受精卵作為外源基因的受體細胞，主要原因是__________。為了獲得母羊，胚胎移植前需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行______________________。利用胚胎分割和胚胎移植技術(shù)可獲得多個轉(zhuǎn)基因個體，這些個體的基因型________。 (4)若在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中檢測到_________________，說明目的基因成功表達。 答案　(1)促性腺激素　獲能處理　(2)A　(3)受精卵的全能性易于表達　性別鑒定　相同　(4)htPA(或人組織纖溶酶原激活物) 解析　(1)為獲取更多的卵(母)細胞，要對供體母羊注射促性腺激素，使其超數(shù)排卵。采集的精子需要經(jīng)過獲能處理，才具備受精能力。(2)在htPA基因與質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子的過程中，需要用到的工具酶為限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。(3)轉(zhuǎn)基因羊的培育過程中，常用受精卵作為外源基因的受體細胞，主要原因是受精卵的全能性易于表達。為了獲得母羊，胚胎移植前需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行性別鑒定。利用胚胎分割和胚胎移植技術(shù)可獲得多個轉(zhuǎn)基因個體，這些個體的基因型相同。(4)若在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中檢測到htPA(或人組織纖溶酶原激活物)，說明目的基因成功表達。 探究真題　預測考向 1.(2018浙江4月選考)回答與基因工程和植物克隆有關(guān)的問題： (1)將含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體pBI121均用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切，在切口處形成____________。選取含抗蟲基因的DNA片段與切割后的pBI121用DNA連接酶連接，在兩個片段相鄰處形成____________，獲得重組質(zhì)粒。 (2)已知用CaCl2處理細菌，會改變其某些生理狀態(tài)。取CaCl2處理過的農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒在離心管內(nèi)進行混合等操作，使重組質(zhì)粒進入農(nóng)桿菌，完成________實驗。在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床慢速培養(yǎng)一段時間，其目的是__________________________________，從而表達卡那霉素抗性基因，并大量增殖。 (3)取田間不同品種水稻的幼胚，先進行________，然后接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼胚發(fā)生________形成愈傷組織，并進行繼代培養(yǎng)。用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染愈傷組織，再培養(yǎng)愈傷組織，以便獲得抗蟲的轉(zhuǎn)基因水稻。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有：培養(yǎng)條件如光溫、培養(yǎng)基配方如植物激素配比、以及_____________________(答出2點即可)。 答案　(1)粘性末端　磷酸二酯鍵 (2)轉(zhuǎn)化　使CaCl2處理過的農(nóng)桿菌恢復細胞的正常狀態(tài) (3)消毒　脫分化　水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數(shù) 解析　(1)形成重組DNA時限制性核酸內(nèi)切酶酶切得到的是粘性末端，DNA連接酶連接兩個DNA片段之間形成的是磷酸二酯鍵。 (2)目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。Ca2＋處理方法可增加細菌細胞壁的通透性，讓其處于感受態(tài)，以利于重組質(zhì)粒導入。故細胞要正常表達相關(guān)基因，應讓其恢復為正常狀態(tài)。 (3)不同種類植物或同種植物的不同基因型個體之間存在遺傳的差異，細胞全能性的表達程度大小不同，小麥水稻等作物在多次繼代培養(yǎng)后，會喪失細胞全能性的表達能力。 2.(2016浙江4月選考)兔肝細胞中的基因E編碼代謝甲醛的酶，擬利用基因工程技術(shù)將基因E轉(zhuǎn)入矮牽牛中，以提高矮牽牛對甲醛的代謝能力。請回答下列問題： (1)從兔肝細胞中提取mRNA，在____________酶的作用下形成互補的DNA，然后以此DNA為模板擴增得到基因E。在相關(guān)酶的作用下，將基因E與Ti質(zhì)粒連接在一起，形成_____________，再導入用氯化鈣處理的_______________中，侵染矮牽牛葉片。將被侵染的葉片除菌后進行培養(yǎng)，最終得到轉(zhuǎn)基因矮牽牛。其中培養(yǎng)過程正確的是____________。 A.葉片在含適宜濃度生長素的培養(yǎng)基上分化形成愈傷組織 B.愈傷組織在含細胞分裂素和生長素配比較高的培養(yǎng)基上形成芽 C.再生的芽在細胞分裂素含量高的培養(yǎng)基上生根 D.愈傷組織在含適宜濃度植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上脫分化形成再生植株 (2)取轉(zhuǎn)基因矮牽牛葉片，放入含MS液體培養(yǎng)基和適量濃度甲醛且密封的試管中。將試管置于______上，進行液體懸浮培養(yǎng)。一段時間后測定培養(yǎng)基中甲醛的含量，以判斷基因E是否在轉(zhuǎn)基因矮牽牛中正常表達。培養(yǎng)過程中液體培養(yǎng)的作用：一是提供營養(yǎng)；二是________，從而使葉片保持正常的形態(tài)。 答案　(1)逆轉(zhuǎn)錄　重組DNA分子　農(nóng)桿菌　B (2)搖床　維持滲透壓 解析　(1)以mRNA為模板合成DNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄過程，這一過程需要在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行。獲得目的基因后，需在限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用下，將目的基因與載體(Ti質(zhì)粒)連接形成重組質(zhì)粒(重組DNA分子)，再將其導入受體細胞。將目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，先將重組DNA分子導入經(jīng)氯化鈣處理的農(nóng)桿菌中，再用導入目的基因的農(nóng)桿菌感染植物細胞，最終實現(xiàn)將目的基因?qū)胫参锛毎麅?nèi)的目的。導入目的基因的植物細胞經(jīng)組織培養(yǎng)過程形成轉(zhuǎn)基因植株。組織培養(yǎng)過程中，葉片在含適宜濃度的生長素和細胞分裂素的培養(yǎng)基上脫分化形成愈傷組織，然后在含細胞分裂素和生長素配比較高的培養(yǎng)基上形成芽，繼而在生長素含量高的培養(yǎng)基上生根，最后形成完整的植株，愈傷組織形成植株的過程中發(fā)生細胞的分化。 (2)植物組織培養(yǎng)過程中，將愈傷組織等細胞置于搖床上，進行液體懸浮培養(yǎng)，形成多個分散的細胞。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液一方面為植物細胞提供營養(yǎng)，另一面維持一定的滲透壓，從而使葉片保持正常的形態(tài)。 3.(2015四川，9)將蘇云金桿菌Bt蛋白的基因?qū)朊藁毎?，可獲得抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉，其過程如下圖所示： 注：農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上只有T－DNA片段能轉(zhuǎn)移到植物細胞中。 請回答下列問題： (1)過程①需用同種__________________酶對含Bt基因的DNA和Ti質(zhì)粒進行酶切。為將過程②獲得的含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌篩選出來，應使用________培養(yǎng)基。 (2)過程③中將棉花細胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng)，旨在讓________進入棉花細胞；除盡農(nóng)桿菌后，還須轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，目的是______________________。 (3)若過程④僅獲得大量的根，則應在培養(yǎng)基中增加__________________以獲得芽；部分接種在無激素培養(yǎng)基上的芽也能長根，原因是______________________________________。 (4)檢驗轉(zhuǎn)基因棉的抗蟲性狀，常用方法是________________________。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉能減少__________的使用，以減輕環(huán)境污染。 答案　(1)限制性核酸內(nèi)切　選擇 (2)T－DNA　篩選出獲得T－DNA片段的植物細胞 (3)細胞分裂素濃度　芽頂端合成的生長素向基部運輸，促進根的分化 (4)投放棉鈴蟲　農(nóng)藥 解析　(1)構(gòu)建重組DNA分子的過程需要用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，以便產(chǎn)生相同的粘性末端。只允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基叫做選擇培養(yǎng)基，這里只允許含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌生長，應使用選擇培養(yǎng)基。(2)過程③中將棉花細胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng)，旨在讓重組質(zhì)粒中的T－DNA片段進入棉花細胞，除盡農(nóng)桿菌后，還須轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，目的是篩選出含目的基因的受體細胞。(3)生長素可誘導根的形成，細胞分裂素可誘導芽的形成。在沒有激素的培養(yǎng)基上的芽也長出了根，可能與芽自身合成生長素并向下運輸促進根的形成有關(guān)。(4)檢驗轉(zhuǎn)基因棉的抗蟲性狀，常用方法是直接投放害蟲，觀察其生存情況。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉能減少農(nóng)藥的使用，以減輕環(huán)境污染。 課時作業(yè) 一、選擇題 1.(2018臺州模擬)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是(　　) A.目的基因和受體細胞均可來自動物、植物或微生物 B.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶 C.人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素無生物活性 D.載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達 答案　D 解析　目的基因來源于含有人們所需要性狀的一切生物，可以是動物、植物，也可以是真菌、細菌等，A正確；基因工程中一般要使用同種限制性核酸內(nèi)切酶進行切割，以獲得具有相同粘性末端的目的基因和載體，在DNA連接酶的作用下，將目的基因和載體連接起來，形成重組DNA分子，B正確；人的胰島素原基因可以在大腸桿菌內(nèi)表達，但是由于大腸桿菌是原核生物，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器，合成的胰島素不具有胰島素的功能，即沒有生物活性，C正確；標記基因是為了檢測并篩選含重組DNA的細胞，但對于目的基因的表達沒有影響，D錯誤。 2.(2019寧波模擬)基因編輯是指將外源DNA片段導入到細胞染色體特定位點或刪除基因內(nèi)部的片段，定點改造基因，獲得預期的生物體基因序列發(fā)生遺傳改變的技術(shù)。如圖是對某生物B基因進行編輯的過程，該過程中用sgRNA可指引核酸內(nèi)切酶Cas9結(jié)合到特定的切割位點，下列敘述正確的是(　　) A.sgRNA是合成Cas9酶的模板 B.sgRNA的堿基序列與靶基因堿基序列能夠全部互補 C.核酸內(nèi)切酶Cas9可在特定切割位點斷裂核苷酸之間的磷酸二酯鍵 D.B基因被編輯后因不能轉(zhuǎn)錄而無法表達相關(guān)蛋白質(zhì) 答案　C 解析　由題意知，sgRNA可指引核酸內(nèi)切酶Cas9結(jié)合到特定的切割位點，A錯誤；由圖可知，靶基因部分序列與sgRNA通過堿基互補配對原則進行配對，B錯誤；核酸內(nèi)切酶Cas9可斷裂脫氧核糖核苷酸之間的化學鍵——磷酸二酯鍵，C正確；被編輯后的B基因仍能進行轉(zhuǎn)錄，D錯誤。 3.(2018浙江模擬)科學家利用生物技術(shù)將人的生長激素基因?qū)胄∈笫芫训募毎酥校?jīng)培育獲得一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細胞可以合成人的生長激素并分泌到尿液中，在醫(yī)學研究及相關(guān)疾病治療方面都具有重要意義。下列有關(guān)敘述錯誤的是(　　) A.選擇受精卵作為外源基因的受體細胞是因為這種細胞具有全能性 B.采用DNA分子雜交技術(shù)可檢測外源基因在小鼠細胞內(nèi)是否成功表達 C.人的生長激素基因能在小鼠細胞內(nèi)表達，說明遺傳密碼在不同種生物中可以通用 D.將轉(zhuǎn)基因小鼠體細胞進行核移植(克隆)，可以獲得多個具有外源基因的后代 答案　B 解析　選擇受精卵作為外源基因的受體細胞是因為這種細胞具有全能性，而且全能性最高，A正確；采用DNA分子雜交技術(shù)可檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因，但不能檢測外源基因在小鼠細胞內(nèi)是否成功表達，B錯誤；人的生長激素基因能在小鼠細胞內(nèi)表達，說明遺傳密碼在不同種生物中可以通用，C正確；將轉(zhuǎn)基因小鼠體細胞進行核移植(克隆)，可以獲得多個具有外源基因的后代，D正確。 4.北極比目魚中有抗凍基因，其編碼的抗凍蛋白具有11個氨基酸的重復序列，該序列重復次數(shù)越多，抗凍能力越強。如圖是獲取轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株的過程示意圖，有關(guān)敘述正確的是(　　) A.過程①獲取的目的基因，可用于基因工程和比目魚基因組測序 B.將多個抗凍基因編碼區(qū)依次相連成能表達的新基因，不能得到抗凍性增強的抗凍蛋白 C.過程②構(gòu)成的重組質(zhì)粒缺乏標記基因，需要轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌才能進行篩選 D.應用DNA探針技術(shù)，可以檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達 答案　B 解析　將多個抗凍基因編碼區(qū)相連形成能表達的新基因，合成的蛋白質(zhì)為新的蛋白質(zhì)，不能得到抗凍性增強的抗凍蛋白，B正確；過程①是利用逆轉(zhuǎn)錄法合成目的基因，由于沒有非編碼區(qū)和編碼區(qū)中的內(nèi)含子，所以不能用于比目魚基因組測序；用作載體的質(zhì)粒，必須具有標記基因才能便于檢測和篩選；應用DNA探針技術(shù)，可檢測轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在和轉(zhuǎn)錄，但不能檢測目的基因是否成功表達，A、C、D錯誤。 二、非選擇題 5.(2018嘉興模擬)我國目前臨床使用的乙肝疫苗大多為基因工程疫苗，其有效成分是一種叫做乙肝表面抗原的蛋白質(zhì)(S蛋白)，對應的基因為s基因。請回答： (1)在構(gòu)建重組DNA分子時，要用限制性核酸內(nèi)切酶處理________，并用__________酶使兩者結(jié)合。將重組DNA分子導入到哺乳動物細胞，經(jīng)篩選得到工程細胞。 (2)在細胞培養(yǎng)過程中，工程細胞在生長過程中有________________現(xiàn)象，需要定期使用____________酶處理，以便于分瓶培養(yǎng)。 (3)為提高工程細胞培養(yǎng)的成功率，下列措施中不需采用的是________。 A.取單個細胞進行培養(yǎng) B.加入胰島素 C.二氧化碳培養(yǎng)箱 D.加入動物血清 (4)由于哺乳動物細胞培養(yǎng)較難，成本較高，近些年科學家們又發(fā)明了“乳腺生物發(fā)生器”，進而從轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中提取所需產(chǎn)品。在這種技術(shù)中，作為重組DNA分子受體細胞的一般是________________。 答案　(1)s基因和載體DNA　DNA連接　(2)接觸抑制　胰蛋白　(3)A　(4)受精卵 解析　(1)在構(gòu)建重組DNA分子時，要用限制性核酸內(nèi)切酶處理s基因和載體DNA，并用DNA連接酶使兩者結(jié)合。(2)在動物細胞培養(yǎng)過程中存在接觸抑制現(xiàn)象，需要定期使用胰蛋白酶處理，以便于分瓶培養(yǎng)。(3)取單個細胞進行培養(yǎng)不會提高工程細胞培養(yǎng)的成功率，A錯誤；胰島素能促進血糖進入組織細胞，因此提高工程細胞培養(yǎng)的成功率，應該在培養(yǎng)基中添加胰島素，B正確；動物細胞培養(yǎng)時需要一定的氣體環(huán)境，因此需要放在二氧化碳培養(yǎng)箱中，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH，C正確；動物細胞培養(yǎng)時，為了給細胞提供充足的營養(yǎng)，需要在培養(yǎng)基中加入動物血清，D正確。(4)培育轉(zhuǎn)基因動物時，應該以受精卵作為受體細胞，因為受精卵的全能性最高。 6.(2018紹興聯(lián)考)基因敲除是針對某個序列已知但功能未知的基因，改變其基因結(jié)構(gòu)，令該基因功能喪失，從而對生物體造成影響，進而推測出該基因功能的一門技術(shù)。以下是制備APOE基因敲除小鼠的常規(guī)過程： 注：Neo基因是抗新霉素的抗藥基因；APOE是載脂蛋白E，參與脂蛋白的代謝與轉(zhuǎn)化。 請回答： (1)為了獲得APOE基因，可以用_______________或者PCR擴增。過程②中所需的工具酶有__________。Neo基因除了破壞APOE基因外，還具有的作用最可能是____________。 (2)培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞時，首先要在培養(yǎng)皿底部制備飼養(yǎng)層，用于飼養(yǎng)層的細胞一般是__________________。經(jīng)過⑥克隆以后的細胞的后裔細胞群稱為純系，細胞純系的特點是________________________________，從而便于研究。 (3)純合的APOE基因敲除小鼠________(填“能”或“不能”)表達APOE，與正常小鼠相比表現(xiàn)出____________________________性狀。 答案　(1)化學方法合成　限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶　作為標記基因，便于篩選　(2)胚胎成纖維細胞　遺傳性狀均一，表現(xiàn)的性狀相似　(3)不能　脂蛋白的代謝和轉(zhuǎn)化異常 解析　(1)為了獲得APOE基因(目的基因)，可以用化學方法合成或者PCR擴增。過程②是形成重組DNA分子的過程。Neo基因除了破壞APOE基因外，還具有的作用最可能是作為標記基因，便于篩選出能在含新霉素的培養(yǎng)基中生長的受體細胞。(2)培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞時，首先要在培養(yǎng)皿底部制備飼養(yǎng)層，用于飼養(yǎng)層的細胞一般是胚胎成纖維細胞。經(jīng)過⑥克隆以后的細胞的后裔細胞群稱為純系，細胞純系的特點是遺傳性狀均一，表現(xiàn)的性狀相似，從而便于研究。(3)純合的APOE基因敲除小鼠由于APOE基因結(jié)構(gòu)被破壞，因而不能表達APOE基因，由于APOE參與脂蛋白的代謝與轉(zhuǎn)化，因此與正常小鼠相比，APOE基因敲除小鼠會表現(xiàn)出脂蛋白的代謝和轉(zhuǎn)化異常性狀。 7.(2018溫州3月選考模擬)請回答下列有關(guān)轉(zhuǎn)基因的問題： (1)利用圖示質(zhì)粒和目的基因培育轉(zhuǎn)基因醋化醋桿菌。圖中標注了相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列和酶切位點，其中酶切位點相同的酶不重復標注。 利用圖示質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應選用____________________兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割。在首次篩選轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的醋化醋桿菌時，可用移液管取0.1mL醋化醋桿菌懸液，涂布在添加__________的培養(yǎng)基中進行篩選。配制該培養(yǎng)基時，通常加入___________來調(diào)節(jié)滲透壓。當成功選出所需菌種進行醋酸發(fā)酵時，發(fā)酵瓶中的醋化醋桿菌通常用鋸末或刨花等材料____________化。 (2)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)(目的基因能1個或多個導入并整合到受體細胞染色體上)獲得抗蟲(E)抗除草劑(T)的大豆植株甲，若甲自交F1中抗蟲抗除草劑∶抗蟲不抗除草劑∶不抗蟲抗除草劑＝11∶4∶1。則導入受體細胞的基因E和T分別至少有幾個？________。 A.1、1B.1、2C.2、1D.2、2 答案　(1)BamHⅠ、HindⅢ(缺一不可)　四環(huán)素　甘露醇　固定　(2)C 解析　(1)為防止錯誤連接及自身環(huán)化，應采用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割。篩選含重組DNA分子的醋化醋桿菌時，用移液管取懸液，涂布在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基中來篩選。醋化醋桿菌培養(yǎng)時，通常加甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓。發(fā)酵瓶中的醋化醋桿菌通常用鋸末或刨花等材料固定化。(2)根據(jù)甲自交F1中抗蟲∶不抗蟲＝15∶1，抗除草劑∶不抗除草劑＝3∶1推測導入的抗蟲基因2個，抗除草劑基因1個，C正確。 8.浙江大學農(nóng)學院喻景權(quán)教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，一種植物激素——油菜素內(nèi)酯能促進農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝。用油菜素內(nèi)酯處理后，許多參與農(nóng)藥降解的基因(如P450基因和GST)的表達和酶活性都得到提高，在這些基因“指導”下合成的蛋白酶能把農(nóng)藥逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒甚至無毒物質(zhì)，有的則被直接排出體外。某課題組進一步進行了如下的實驗操作，請回答下列問題： (1)獲得油菜素內(nèi)酯合成酶基因的方法有______________________________(至少兩種方法)。步驟①用PCR技術(shù)擴增基因時用到的耐高溫酶通常是指_____________________________；步驟②用到的酶有__________________________________________________________。 (2)圖中導入重組質(zhì)粒的方法是_____________，在導入之前應用一定濃度的______________處理受體細菌。 (3)導入重組質(zhì)粒2以后，往往還需要進行檢測和篩選，可用_________制成探針，檢測是否導入了重組基因，在培養(yǎng)基中加入______________可將含有目的基因的細胞篩選出來。 (4)請你為該課題命名：______________________________________________________。 答案　(1)從cDNA文庫中獲取、從基因組文庫中獲取、化學方法合成目的基因或PCR技術(shù)擴增(任選其中兩項即可)　TaqDNA聚合酶　限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶　(2)感受態(tài)細胞法　氯化鈣溶液　(3)紅霉素抗性基因　紅霉素　(4)探究油菜素內(nèi)酯能否促進土壤中農(nóng)藥的降解 解析　進行基因工程操作時，首先要獲取目的基因，其方法有多種：從cDNA文庫中獲取、從基因組文庫中獲取、化學方法合成目的基因或PCR技術(shù)擴增等。在構(gòu)建重組DNA分子的過程中，用到的工具酶有限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。圖中的受體細胞是細菌，故用感受態(tài)細胞法導入重組DNA分子，導入后需檢測和篩選。從圖中可以看出，最終是通過對照實驗來檢驗轉(zhuǎn)基因細菌對土壤中殘留農(nóng)藥的降解能力。 9.我國一科研團隊將小麥液泡膜Na＋/K＋逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(TaNHX2基因)轉(zhuǎn)移到水稻細胞內(nèi)，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽水稻新品種。請回答下列有關(guān)問題： (1)為保證目的基因在水稻細胞中能夠表達，載體上應含有特定的___________(A.復制原點　B.啟動子　C.標記基因)。 (2)水稻的轉(zhuǎn)化過程為：將水稻幼胚接種到誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)過____________過程，培養(yǎng)出愈傷組織，然后用________________法，將目的基因和相關(guān)功能片段整合到愈傷組織細胞的染色體DNA上，最后誘導愈傷組織形成水稻植株。 (3)為驗證外源基因整合到水稻基因組后是否轉(zhuǎn)錄，可從轉(zhuǎn)基因植株的細胞中提取所有mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成____________，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用TaNHX2基因特異引物，通過________方法進行基因擴增。若以根細胞為材料擴增結(jié)果為陽性(有產(chǎn)物生成)，以葉細胞為材料擴增結(jié)果為陰性(無產(chǎn)物生成)，則說明____________________________________。 (4)將生長至4葉期的轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)入高濃度的NaCl溶液中培養(yǎng)，進行耐鹽試驗，用非轉(zhuǎn)基因幼苗作為對照。培養(yǎng)30天后觀察現(xiàn)象，若_______________________________________，則說明轉(zhuǎn)基因植株獲得了耐鹽特性。 答案　(1)B　(2)脫分化　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化　(3)cDNA　PCR　目的基因僅在根細胞中轉(zhuǎn)錄，未在葉細胞中轉(zhuǎn)錄　(4)轉(zhuǎn)基因植株存活率高于非轉(zhuǎn)基因植株