（浙江選考）2020版高考生物新導(dǎo)學(xué)大一輪復(fù)習(xí) 第33講 基因工程（含解析）講義.docx

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第33講　基因工程 [考綱要求]　1.工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生(a)。2.基因工程的原理和技術(shù)(b)。3.基因工程的應(yīng)用(a)。4.活動(dòng)：提出生活中的疑難問(wèn)題，設(shè)計(jì)用基因工程技術(shù)解決的方案(c)。 考點(diǎn)一　基因工程的含義及操作工具 1.基因工程的誕生 (1)概念：基因工程是狹義的遺傳工程。廣義的遺傳工程泛指把一種生物的遺傳物質(zhì)(細(xì)胞核、染色體脫氧核糖核酸等)移到另一種生物的細(xì)胞中去，并使這種遺傳物質(zhì)所帶的遺傳信息在受體細(xì)胞中表達(dá)。 (2)核心：構(gòu)建重組DNA分子，早期也將基因工程稱為重組DNA技術(shù)。 (3)誕生時(shí)間：20世紀(jì)70年代。 (4)理論基礎(chǔ)：DNA是生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立以及遺傳信息傳遞方式的認(rèn)定。 (5)技術(shù)保障：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒載體的發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用。 2.基因工程的基本工具 歸納總結(jié)　與DNA有關(guān)的酶的比較 項(xiàng)目 作用底物 作用部位 形成產(chǎn)物 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 粘性末端或平末端 DNA連接酶 DNA片段 磷酸二酯鍵 重組DNA分子 DNA聚合酶 脫氧核苷酸 磷酸二酯鍵 子代DNA DNA解旋酶 DNA分子 堿基對(duì)間的氫鍵 形成脫氧核苷酸單鏈 DNA(水解)酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 游離的脫氧核苷酸 (1)限制性核酸內(nèi)切酶只能用于切割目的基因(　　) (2)DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)形成的氫鍵連接起來(lái)(　　) (3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體(　√　) (4)載體的作用是攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中，使之穩(wěn)定存在并表達(dá)(　√　) (5)DNA連接酶能夠?qū)⑷我?個(gè)DNA片段連接在一起(　　) 觀察下圖所示過(guò)程，回答需要的工具酶及相關(guān)問(wèn)題： (1)①是限制性核酸內(nèi)切酶，②是DNA連接酶，二者的作用部位都是磷酸二酯鍵。 (2)限制性核酸內(nèi)切酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。 (3)說(shuō)明限制性核酸內(nèi)切酶有何特性？具有專一性。 1.科學(xué)家將人的生長(zhǎng)激素基因與大腸桿菌的DNA分子進(jìn)行重組，并使其成功地在大腸桿菌中得以表達(dá)。但在進(jìn)行基因工程的操作過(guò)程中，需使用特定的限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—，據(jù)圖回答： (1)過(guò)程①表示的是采用________的方法來(lái)獲取目的基因。 (2)根據(jù)圖示分析，在形成重組DNA分子的過(guò)程中，應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶_______(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)切割質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶_______(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)切割目的基因。 (3)人的基因之所以能與大腸桿菌的DNA分子進(jìn)行重組，原因是__________________。 (4)人體的生長(zhǎng)激素基因能在大腸桿菌體內(nèi)成功表達(dá)出人的生長(zhǎng)激素是因?yàn)開(kāi)____________。寫出目的基因?qū)氪竽c桿菌中后表達(dá)的過(guò)程：__________________________________。 答案　(1)逆轉(zhuǎn)錄　(2)Ⅰ?、颉?3)人的基因與大腸桿菌DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)相同　(4)人與細(xì)菌共用一套(遺傳)密碼子　生長(zhǎng)激素基因mRNA生長(zhǎng)激素 解析　(2)根據(jù)圖示分析可知，目的基因插入了質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因的內(nèi)部，而該位置有限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列，因此在形成重組DNA分子過(guò)程中，應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ切割質(zhì)粒；而目的基因的兩側(cè)均含有能被限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ識(shí)別的堿基序列，所以用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ切割目的基因。用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和載體后形成的末端按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行連接。(3)人的基因之所以能與大腸桿菌DNA分子進(jìn)行重組，是因?yàn)槿说幕蚺c大腸桿菌DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)相同。(4)人體的生長(zhǎng)激素基因能在大腸桿菌體內(nèi)成功表達(dá)是因?yàn)槿撕痛竽c桿菌共用一套(遺傳)密碼子；目的基因?qū)氪竽c桿菌中后表達(dá)的過(guò)程為生長(zhǎng)激素基因mRNA生長(zhǎng)激素。 2.(2018金麗衢十二校聯(lián)考)下表是幾種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： 限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識(shí)別序列及切割位點(diǎn) ↓ GGATCC CCTAGG ↑ ↓ TGATCA ACTAGT ↑ ↓ GATC CTAG ↑ ↓ AAGCTT TTCGAA ↑ (1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用____________兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過(guò)________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌中。 (2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________。 (3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為_(kāi)____，對(duì)于該部位，這兩種酶_____(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開(kāi)。 (4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒，最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。 (5)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自_____。 答案　(1)BclⅠ和HindⅢ　DNA連接　感受 (2)四環(huán)素　引物甲和引物丙 (3)　都不能 (4)7 (5)受體細(xì)胞 解析　(1)分析4種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列可知：BamHⅠ和BclⅠ的識(shí)別序列中含有Sau3AⅠ的識(shí)別序列，這三種酶切割DNA后可以產(chǎn)生相同的粘性末端。為保證質(zhì)粒上含有標(biāo)記基因，切割質(zhì)粒時(shí)不能選用BamHⅠ和Sau3AⅠ，應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割；酶切后的載體和目的基因片段，需用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的大腸桿菌中。(2)重組質(zhì)粒中四環(huán)素抗性基因結(jié)構(gòu)完整，氨芐青霉素抗性基因結(jié)構(gòu)被破壞，在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素可以篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌。根據(jù)圖2可知，PCR擴(kuò)增該目的基因時(shí)，需用引物甲和引物丙兩種引物。(3)BamHⅠ酶切產(chǎn)生的粘性末端為和，BclⅠ酶切產(chǎn)生的粘性末端為和，經(jīng)DNA連接酶連接后，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為或，該部位的序列不能被BamHⅠ和BclⅠ識(shí)別，因此不能被這兩種酶切開(kāi)。(4)圖1質(zhì)粒中含有Sau3AⅠ酶的3個(gè)識(shí)別序列，如圖(A、B、C分別表示相鄰切點(diǎn)間的DNA片段)： 用Sau3AⅠ酶切，若在一個(gè)切點(diǎn)處切割可得到：B＋C＋A、C＋A＋B、A＋B＋C三種DNA片段(但其大小相同)；若在兩個(gè)切點(diǎn)處切割可得到：A、B＋C、A＋C、B、A＋B、C六種DNA片段(其大小均不同)；若在三個(gè)切點(diǎn)處均切割，可得到A、B、C三種大小不同的DNA片段，綜上所述，用Sau3AⅠ酶切質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。(5)噬菌體不能獨(dú)立生活，必需依賴活細(xì)胞才能生存，所以噬菌體作為載體時(shí)，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自所導(dǎo)入的受體細(xì)胞。 限制性核酸內(nèi)切酶的選擇方法 (1)根據(jù)目的基因兩端的限制性核酸內(nèi)切酶切點(diǎn)確定限制性核酸內(nèi)切酶的種類 ①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制性核酸內(nèi)切酶，如圖甲可選擇PstⅠ。 ②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制性核酸內(nèi)切酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。 ③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。 (2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制性核酸內(nèi)切酶的種類 ①所選限制性核酸內(nèi)切酶要與切割目的基因的限制性核酸內(nèi)切酶相一致，以確保具有相同的粘性末端(或平末端)。 ②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制性核酸內(nèi)切酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制性核酸內(nèi)切酶SmaⅠ會(huì)破壞標(biāo)記基因；如果所選酶的切點(diǎn)不只一個(gè)，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制原點(diǎn)，則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制。 考點(diǎn)二　基因工程的基本操作步驟、應(yīng)用及相關(guān)的設(shè)計(jì)方案 1.基因工程的基本操作步驟 (1)獲得目的基因 目的基因序列已知：化學(xué)合成或PCR擴(kuò)增； 目的基因序列未知：從基因文庫(kù)中獲取。 (2)形成重組DNA分子(基因工程的核心)：通常用相同的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體DNA，然后用DNA連接酶將目的基因和載體DNA連接在一起，形成重組DNA分子。 (3)將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 ①常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。 ②導(dǎo)入方法：用氯化鈣處理大腸桿菌，可以增加大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性，使重組質(zhì)粒容易進(jìn)入。 (4)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞 ①篩選原因：并不是所有的細(xì)胞都接納了重組DNA分子，因此，需篩選含目的基因的受體細(xì)胞。 ②篩選方法：用含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體細(xì)胞，選擇含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。 (5)目的基因的表達(dá) 目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生人們需要的功能物質(zhì)。 2.基因工程的應(yīng)用 應(yīng)用領(lǐng)域 優(yōu)點(diǎn) 基因工程與遺傳育種 轉(zhuǎn)基因植物 所需時(shí)間短，克服了遠(yuǎn)緣親本難以親合的缺陷 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 指轉(zhuǎn)入了外源基因的動(dòng)物。優(yōu)點(diǎn)是省時(shí)、省力，并能取得一定的經(jīng)濟(jì)效益 基因工程與疾病治療 基因工程藥物 主要有胰島素、干擾素和乙型肝炎疫苗等 基因治療 向目標(biāo)細(xì)胞中引入正常功能的基因，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，達(dá)到治療的目的 基因工程與生態(tài)環(huán)境保護(hù) 開(kāi)發(fā)可降解的新型塑料；改造分解石油的細(xì)菌，提高其分解石油的能力等 (1)抗蟲基因即使成功地插入到植物細(xì)胞染色體上也未必能正常表達(dá)(　√　) (2)應(yīng)用DNA探針技術(shù)，可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(dá)(　　) (3)將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株(　√　) (4)利用乳腺生物反應(yīng)器能夠獲得一些重要的醫(yī)藥產(chǎn)品，如人的血清白蛋白，這是因?yàn)閷⑷说难灏椎鞍谆驅(qū)肓藙?dòng)物的乳腺細(xì)胞中(　　) (5)為培育出抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體(　　)  如圖為抗蟲棉的培育過(guò)程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題： (1)該基因工程中的目的基因和載體分別是什么？一般情況下，為什么要用同一種限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和載體？ 提示　目的基因是Bt毒蛋白基因，載體是Ti質(zhì)粒。用同一種限制性核酸內(nèi)切酶處理目的基因和載體，可以獲得相同的粘性末端，便于形成重組DNA分子。 (2)該實(shí)例中為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？ 提示　由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞且能整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。 (3)該實(shí)例中，檢測(cè)目的基因是否表達(dá)常見(jiàn)的方法是什么？ 提示　用棉葉飼喂棉鈴蟲。 1.三種獲取目的基因方法的比較 項(xiàng)目 化學(xué)合成法 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 建立基因文庫(kù)法 適用對(duì)象 目的基因序列已知 目的基因序列已知 目的基因序列未知 過(guò)程 ①逆轉(zhuǎn)錄法：獲取mRNA→合成DNA單鏈→合成DNA雙鏈(目的基因) ②以單個(gè)脫氧核苷酸為原料按照已知DNA序列直接人工合成 在體外通過(guò)酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增特定的DNA片段，即目的基因 利用限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、質(zhì)粒等工具建立基因文庫(kù)→篩選出目的基因 優(yōu)缺點(diǎn) 專一性強(qiáng)，獲取的目的基因較小 速度快，以指數(shù)方式 擴(kuò)增 操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但工作量大 2.形成重組DNA分子 通常是采用相同的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割目的基因和載體DNA(如質(zhì)粒)，獲得相同的粘性末端，在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒，如圖1所示。但應(yīng)用此種方式，在實(shí)際操作中目的基因、載體質(zhì)粒經(jīng)DNA連接酶處理后，獲得的產(chǎn)物可能有三種：①目的基因與目的基因連接物；②質(zhì)粒與質(zhì)粒連接物；③目的基因與質(zhì)粒連接物。為了使目的基因與質(zhì)粒能定向連接，可使用兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，然后在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒，如圖2所示。 3.有關(guān)基因工程操作易錯(cuò)分析 (1)基因文庫(kù)中的基因保存在受體菌中。 (2)原核生物繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，有利于目的基因的復(fù)制與表達(dá)，因此常采用大腸桿菌等原核生物作為受體細(xì)胞。 (3)植物細(xì)胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過(guò)程成為完整植物體，因此受體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞；動(dòng)物基因工程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。 (4)操作工具有三種，但常用工具酶有兩種，載體不是酶。在基因工程操作步驟“獲得目的基因”和“形成重組DNA分子”兩個(gè)過(guò)程中，通常用同種限制性核酸內(nèi)切酶，目的是產(chǎn)生相同的粘性末端(或平末端)；DNA連接酶只在“形成重組DNA分子”操作中用到。 (5)一般情況下，用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，但有時(shí)可用兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。 (6)標(biāo)記基因的種類和作用：標(biāo)記基因的作用——篩選、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，常見(jiàn)的標(biāo)記基因有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。 命題點(diǎn)一　基因工程的操作程序 1.為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C(圖1)，擬將其與質(zhì)粒(圖2)重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。 下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖?　　) A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞 C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞 D.用分子雜交技術(shù)檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上 答案　C 解析　在形成重組DNA分子時(shí)，為保證目的基因與載體的連接，需要用同種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割產(chǎn)生相同的粘性末端，才能通過(guò)DNA連接酶連接，圖中目的基因的兩端和啟動(dòng)子與終止子之間都有限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ的切割位點(diǎn)，因此選用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ切割目的基因和載體，A正確；菊花為雙子葉植物，將目的基因?qū)腚p子葉植物細(xì)胞的常用方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，B正確；圖2中重組質(zhì)粒中的抗性基因?yàn)槌泵顾乜剐曰?，?yīng)該在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞，C錯(cuò)誤；要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，常用DNA分子雜交技術(shù)，D正確。 2.在某些深海魚中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因afp對(duì)提高農(nóng)作物的抗寒能力有較高的應(yīng)用價(jià)值。如圖所示是獲得轉(zhuǎn)基因萵苣的技術(shù)流程，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題： (1)獲取目的基因的主要途徑包括從基因文庫(kù)中獲取和______________。 (2)①過(guò)程需要的酶有____________________、__________________。 (3)重組質(zhì)粒除了帶有抗凍蛋白基因afp以外，還必須含有啟動(dòng)子、終止子和____________，這樣才能構(gòu)成一個(gè)完整的基因表達(dá)載體。 (4)如果受體細(xì)胞C1是土壤農(nóng)桿菌，則將目的基因?qū)胨哪康氖抢棉r(nóng)桿菌的_________，使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞C2，并將其插入到受體細(xì)胞C2中的______________上，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)，形成轉(zhuǎn)基因萵苣。 答案　(1)化學(xué)方法合成　(2)限制性核酸內(nèi)切酶　DNA連接酶　(3)抗生素抗性基因(或標(biāo)記基因)　(4)轉(zhuǎn)化作用　染色體DNA 解析　(1)獲取目的基因的主要途徑有從基因文庫(kù)中獲取和化學(xué)方法合成。(2)①過(guò)程為形成重組DNA分子，需要用到限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。(3)一個(gè)完整的重組DNA分子包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因。(4)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用的是農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，將目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，進(jìn)而使目的基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。 命題點(diǎn)二　基因工程的原理和應(yīng)用 3.下列關(guān)于基因工程應(yīng)用的敘述，正確的是(　　) A.基因治療就是把缺陷基因誘變成正常基因 B.基因診斷的基本原理是DNA分子雜交 C.一種基因探針能檢測(cè)水體中的各種病毒 D.利用基因工程生產(chǎn)乙肝疫苗時(shí)，目的基因存在于人體B淋巴細(xì)胞的DNA中 答案　B 解析　基因治療就是向目標(biāo)細(xì)胞中引入正常功能的基因，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，達(dá)到治療疾病的目的，A錯(cuò)誤；基因診斷又稱DNA診斷或分子診斷，通過(guò)分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)，直接檢測(cè)出分子結(jié)構(gòu)水平和表達(dá)水平是否異常，從而對(duì)疾病做出判斷，利用的原理就是DNA分子雜交，B正確；基因探針是用放射性同位素(或熒光分子)標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段，一種基因探針只能檢測(cè)水體中的一種或一類病毒，C錯(cuò)誤；基因工程生產(chǎn)乙肝疫苗是通過(guò)構(gòu)建含有乙肝病毒表面抗原基因的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染(就是讓質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞)相應(yīng)的宿主細(xì)胞，如酵母菌、CHO細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，一種可以無(wú)限繁殖的細(xì)胞)，生產(chǎn)乙肝表面抗原蛋白，D錯(cuò)誤。 4.科學(xué)家將魚抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相對(duì)寒冷的環(huán)境中生長(zhǎng)。質(zhì)粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四種限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，下圖是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過(guò)程的示意圖(ampr為抗氨芐青霉素基因)，其中①～④是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過(guò)程中的相關(guān)步驟，Ⅰ、Ⅱ表示相關(guān)結(jié)構(gòu)或細(xì)胞。請(qǐng)據(jù)圖作答： (1)在構(gòu)建重組DNA時(shí)，可用一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，為了避免目的基因和載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，在此實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該選用限制性核酸內(nèi)切酶__________分別對(duì)______、______進(jìn)行切割，切割后產(chǎn)生的DNA片段分別為_(kāi)_____、______種。 (2)培養(yǎng)基中的氨芐青霉素會(huì)抑制番茄愈傷組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，要利用該培養(yǎng)基篩選已導(dǎo)入魚的抗凍蛋白基因的番茄細(xì)胞，應(yīng)使Ⅰ重組DNA中含有________________作為標(biāo)記基因。 (3)研究人員通常采用____________法將魚抗凍蛋白基因?qū)敕鸭?xì)胞內(nèi)。 答案　(1)PstⅠ、SmaⅠ　含魚抗凍蛋白基因的DNA　質(zhì)?！?　2 (2)抗氨芐青霉素基因 (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 解析　(1)在形成重組DNA分子中，如果目的基因和載體用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割，獲得的粘性末端相同，將會(huì)發(fā)生自身環(huán)化現(xiàn)象，故應(yīng)選用不同的限制性核酸內(nèi)切酶分別對(duì)目的基因和載體切割，以獲得不同的粘性末端，故應(yīng)選用PstⅠ和SmaⅠ對(duì)含魚抗凍蛋白基因的DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割，PstⅠ和SmaⅠ在魚抗凍蛋白基因的DNA上共有3個(gè)酶切位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生4個(gè)DNA片段，而環(huán)狀質(zhì)粒上有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，切割后產(chǎn)生2個(gè)DNA片段。 (2)能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞具有抗氨芐青霉素基因，故Ⅰ重組DNA分子中應(yīng)含有抗氨芐青霉素基因作為標(biāo)記基因。 (3)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。 基因診斷與基因治療 (1)基因診斷 ①方法：DNA分子雜交法(即DNA探針?lè)?，該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開(kāi)，把單鏈的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測(cè)的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。 ②步驟：抽取病人的組織或體液作為化驗(yàn)樣品；將樣品中的DNA分離出來(lái)，用化學(xué)法或熱處理法使樣品DNA解旋，將事先制作好的DNA探針引入化驗(yàn)樣品中，這些已知的經(jīng)過(guò)標(biāo)記的探針能夠在化驗(yàn)樣品中找到互補(bǔ)鏈，并與之結(jié)合(雜交)在一起，找不到互補(bǔ)鏈的DNA探針，則可以被洗脫。這樣通過(guò)對(duì)遺留在樣品中的標(biāo)記過(guò)的DNA探針進(jìn)行基因分析，就能檢出病人所得的病。 (2)基因治療 ①原理：利用正常基因糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，即把正?；?qū)牖颊唧w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的，而原有缺陷基因一般不作處理。 ②方法：有體外基因治療和體內(nèi)基因治療，體外基因治療方法療效好。如重度免疫缺陷癥的體外基因治療方法： 體內(nèi)基因治療：用基因工程的方法，直接向人體組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因。 命題點(diǎn)三　設(shè)計(jì)用基因工程技術(shù)解決的方案 5.人組織纖溶酶原激活物(htPA)是一種重要的藥用蛋白，可在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中獲得。流程如下： (1)為獲取更多的卵(母)細(xì)胞，要對(duì)供體母羊注射____________，使其超數(shù)排卵。采集的精子需要經(jīng)過(guò)________，才具備受精能力。 (2)在htPA基因與質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子的過(guò)程中，下列哪項(xiàng)是必需的(　　) A.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 B.DNA連接酶和DNA聚合酶 C.DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶 D.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶 (3)轉(zhuǎn)基因羊的培育過(guò)程中，常用受精卵作為外源基因的受體細(xì)胞，主要原因是__________。為了獲得母羊，胚胎移植前需對(duì)已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進(jìn)行______________________。利用胚胎分割和胚胎移植技術(shù)可獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因個(gè)體，這些個(gè)體的基因型________。 (4)若在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中檢測(cè)到_________________，說(shuō)明目的基因成功表達(dá)。 答案　(1)促性腺激素　獲能處理　(2)A　(3)受精卵的全能性易于表達(dá)　性別鑒定　相同　(4)htPA(或人組織纖溶酶原激活物) 解析　(1)為獲取更多的卵(母)細(xì)胞，要對(duì)供體母羊注射促性腺激素，使其超數(shù)排卵。采集的精子需要經(jīng)過(guò)獲能處理，才具備受精能力。(2)在htPA基因與質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子的過(guò)程中，需要用到的工具酶為限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。(3)轉(zhuǎn)基因羊的培育過(guò)程中，常用受精卵作為外源基因的受體細(xì)胞，主要原因是受精卵的全能性易于表達(dá)。為了獲得母羊，胚胎移植前需對(duì)已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進(jìn)行性別鑒定。利用胚胎分割和胚胎移植技術(shù)可獲得多個(gè)轉(zhuǎn)基因個(gè)體，這些個(gè)體的基因型相同。(4)若在轉(zhuǎn)htPA基因母羊的羊乳中檢測(cè)到htPA(或人組織纖溶酶原激活物)，說(shuō)明目的基因成功表達(dá)。 探究真題　預(yù)測(cè)考向 1.(2018浙江4月選考)回答與基因工程和植物克隆有關(guān)的問(wèn)題： (1)將含某抗蟲基因的載體和含卡那霉素抗性基因的載體pBI121均用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切，在切口處形成____________。選取含抗蟲基因的DNA片段與切割后的pBI121用DNA連接酶連接，在兩個(gè)片段相鄰處形成____________，獲得重組質(zhì)粒。 (2)已知用CaCl2處理細(xì)菌，會(huì)改變其某些生理狀態(tài)。取CaCl2處理過(guò)的農(nóng)桿菌與重組質(zhì)粒在離心管內(nèi)進(jìn)行混合等操作，使重組質(zhì)粒進(jìn)入農(nóng)桿菌，完成________實(shí)驗(yàn)。在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床慢速培養(yǎng)一段時(shí)間，其目的是__________________________________，從而表達(dá)卡那霉素抗性基因，并大量增殖。 (3)取田間不同品種水稻的幼胚，先進(jìn)行________，然后接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼胚發(fā)生________形成愈傷組織，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)。用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染愈傷組織，再培養(yǎng)愈傷組織，以便獲得抗蟲的轉(zhuǎn)基因水稻。影響愈傷組織能否成功再生出植株的因素有：培養(yǎng)條件如光溫、培養(yǎng)基配方如植物激素配比、以及_____________________(答出2點(diǎn)即可)。 答案　(1)粘性末端　磷酸二酯鍵 (2)轉(zhuǎn)化　使CaCl2處理過(guò)的農(nóng)桿菌恢復(fù)細(xì)胞的正常狀態(tài) (3)消毒　脫分化　水稻的基因型、愈傷組織繼代的次數(shù) 解析　(1)形成重組DNA時(shí)限制性核酸內(nèi)切酶酶切得到的是粘性末端，DNA連接酶連接兩個(gè)DNA片段之間形成的是磷酸二酯鍵。 (2)目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。Ca2＋處理方法可增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，讓其處于感受態(tài)，以利于重組質(zhì)粒導(dǎo)入。故細(xì)胞要正常表達(dá)相關(guān)基因，應(yīng)讓其恢復(fù)為正常狀態(tài)。 (3)不同種類植物或同種植物的不同基因型個(gè)體之間存在遺傳的差異，細(xì)胞全能性的表達(dá)程度大小不同，小麥水稻等作物在多次繼代培養(yǎng)后，會(huì)喪失細(xì)胞全能性的表達(dá)能力。 2.(2016浙江4月選考)兔肝細(xì)胞中的基因E編碼代謝甲醛的酶，擬利用基因工程技術(shù)將基因E轉(zhuǎn)入矮牽牛中，以提高矮牽牛對(duì)甲醛的代謝能力。請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)從兔肝細(xì)胞中提取mRNA，在____________酶的作用下形成互補(bǔ)的DNA，然后以此DNA為模板擴(kuò)增得到基因E。在相關(guān)酶的作用下，將基因E與Ti質(zhì)粒連接在一起，形成_____________，再導(dǎo)入用氯化鈣處理的_______________中，侵染矮牽牛葉片。將被侵染的葉片除菌后進(jìn)行培養(yǎng)，最終得到轉(zhuǎn)基因矮牽牛。其中培養(yǎng)過(guò)程正確的是____________。 A.葉片在含適宜濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上分化形成愈傷組織 B.愈傷組織在含細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比較高的培養(yǎng)基上形成芽 C.再生的芽在細(xì)胞分裂素含量高的培養(yǎng)基上生根 D.愈傷組織在含適宜濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上脫分化形成再生植株 (2)取轉(zhuǎn)基因矮牽牛葉片，放入含MS液體培養(yǎng)基和適量濃度甲醛且密封的試管中。將試管置于______上，進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)。一段時(shí)間后測(cè)定培養(yǎng)基中甲醛的含量，以判斷基因E是否在轉(zhuǎn)基因矮牽牛中正常表達(dá)。培養(yǎng)過(guò)程中液體培養(yǎng)的作用：一是提供營(yíng)養(yǎng)；二是________，從而使葉片保持正常的形態(tài)。 答案　(1)逆轉(zhuǎn)錄　重組DNA分子　農(nóng)桿菌　B (2)搖床　維持滲透壓 解析　(1)以mRNA為模板合成DNA的過(guò)程為逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，這一過(guò)程需要在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行。獲得目的基因后，需在限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用下，將目的基因與載體(Ti質(zhì)粒)連接形成重組質(zhì)粒(重組DNA分子)，再將其導(dǎo)入受體細(xì)胞。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，先將重組DNA分子導(dǎo)入經(jīng)氯化鈣處理的農(nóng)桿菌中，再用導(dǎo)入目的基因的農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)的目的。導(dǎo)入目的基因的植物細(xì)胞經(jīng)組織培養(yǎng)過(guò)程形成轉(zhuǎn)基因植株。組織培養(yǎng)過(guò)程中，葉片在含適宜濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上脫分化形成愈傷組織，然后在含細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比較高的培養(yǎng)基上形成芽，繼而在生長(zhǎng)素含量高的培養(yǎng)基上生根，最后形成完整的植株，愈傷組織形成植株的過(guò)程中發(fā)生細(xì)胞的分化。 (2)植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，將愈傷組織等細(xì)胞置于搖床上，進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，形成多個(gè)分散的細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液一方面為植物細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，另一面維持一定的滲透壓，從而使葉片保持正常的形態(tài)。 3.(2015四川，9)將蘇云金桿菌Bt蛋白的基因?qū)朊藁?xì)胞中，可獲得抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉，其過(guò)程如下圖所示： 注：農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上只有T－DNA片段能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。 請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)過(guò)程①需用同種__________________酶對(duì)含Bt基因的DNA和Ti質(zhì)粒進(jìn)行酶切。為將過(guò)程②獲得的含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌篩選出來(lái)，應(yīng)使用________培養(yǎng)基。 (2)過(guò)程③中將棉花細(xì)胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng)，旨在讓________進(jìn)入棉花細(xì)胞；除盡農(nóng)桿菌后，還須轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，目的是______________________。 (3)若過(guò)程④僅獲得大量的根，則應(yīng)在培養(yǎng)基中增加__________________以獲得芽；部分接種在無(wú)激素培養(yǎng)基上的芽也能長(zhǎng)根，原因是______________________________________。 (4)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因棉的抗蟲性狀，常用方法是________________________。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉能減少__________的使用，以減輕環(huán)境污染。 答案　(1)限制性核酸內(nèi)切　選擇 (2)T－DNA　篩選出獲得T－DNA片段的植物細(xì)胞 (3)細(xì)胞分裂素濃度　芽頂端合成的生長(zhǎng)素向基部運(yùn)輸，促進(jìn)根的分化 (4)投放棉鈴蟲　農(nóng)藥 解析　(1)構(gòu)建重組DNA分子的過(guò)程需要用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒，以便產(chǎn)生相同的粘性末端。只允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基叫做選擇培養(yǎng)基，這里只允許含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，應(yīng)使用選擇培養(yǎng)基。(2)過(guò)程③中將棉花細(xì)胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng)，旨在讓重組質(zhì)粒中的T－DNA片段進(jìn)入棉花細(xì)胞，除盡農(nóng)桿菌后，還須轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，目的是篩選出含目的基因的受體細(xì)胞。(3)生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)根的形成，細(xì)胞分裂素可誘導(dǎo)芽的形成。在沒(méi)有激素的培養(yǎng)基上的芽也長(zhǎng)出了根，可能與芽自身合成生長(zhǎng)素并向下運(yùn)輸促進(jìn)根的形成有關(guān)。(4)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因棉的抗蟲性狀，常用方法是直接投放害蟲，觀察其生存情況。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉能減少農(nóng)藥的使用，以減輕環(huán)境污染。 課時(shí)作業(yè) 一、選擇題 1.(2018臺(tái)州模擬)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯(cuò)誤的是(　　) A.目的基因和受體細(xì)胞均可來(lái)自動(dòng)物、植物或微生物 B.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶 C.人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素?zé)o生物活性 D.載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá) 答案　D 解析　目的基因來(lái)源于含有人們所需要性狀的一切生物，可以是動(dòng)物、植物，也可以是真菌、細(xì)菌等，A正確；基因工程中一般要使用同種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，以獲得具有相同粘性末端的目的基因和載體，在DNA連接酶的作用下，將目的基因和載體連接起來(lái)，形成重組DNA分子，B正確；人的胰島素原基因可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，但是由于大腸桿菌是原核生物，沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，合成的胰島素不具有胰島素的功能，即沒(méi)有生物活性，C正確；標(biāo)記基因是為了檢測(cè)并篩選含重組DNA的細(xì)胞，但對(duì)于目的基因的表達(dá)沒(méi)有影響，D錯(cuò)誤。 2.(2019寧波模擬)基因編輯是指將外源DNA片段導(dǎo)入到細(xì)胞染色體特定位點(diǎn)或刪除基因內(nèi)部的片段，定點(diǎn)改造基因，獲得預(yù)期的生物體基因序列發(fā)生遺傳改變的技術(shù)。如圖是對(duì)某生物B基因進(jìn)行編輯的過(guò)程，該過(guò)程中用sgRNA可指引核酸內(nèi)切酶Cas9結(jié)合到特定的切割位點(diǎn)，下列敘述正確的是(　　) A.sgRNA是合成Cas9酶的模板 B.sgRNA的堿基序列與靶基因堿基序列能夠全部互補(bǔ) C.核酸內(nèi)切酶Cas9可在特定切割位點(diǎn)斷裂核苷酸之間的磷酸二酯鍵 D.B基因被編輯后因不能轉(zhuǎn)錄而無(wú)法表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì) 答案　C 解析　由題意知，sgRNA可指引核酸內(nèi)切酶Cas9結(jié)合到特定的切割位點(diǎn)，A錯(cuò)誤；由圖可知，靶基因部分序列與sgRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行配對(duì)，B錯(cuò)誤；核酸內(nèi)切酶Cas9可斷裂脫氧核糖核苷酸之間的化學(xué)鍵——磷酸二酯鍵，C正確；被編輯后的B基因仍能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，D錯(cuò)誤。 3.(2018浙江模擬)科學(xué)家利用生物技術(shù)將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫训募?xì)胞核中，經(jīng)培育獲得一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中，在醫(yī)學(xué)研究及相關(guān)疾病治療方面都具有重要意義。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(　　) A.選擇受精卵作為外源基因的受體細(xì)胞是因?yàn)檫@種細(xì)胞具有全能性 B.采用DNA分子雜交技術(shù)可檢測(cè)外源基因在小鼠細(xì)胞內(nèi)是否成功表達(dá) C.人的生長(zhǎng)激素基因能在小鼠細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，說(shuō)明遺傳密碼在不同種生物中可以通用 D.將轉(zhuǎn)基因小鼠體細(xì)胞進(jìn)行核移植(克隆)，可以獲得多個(gè)具有外源基因的后代 答案　B 解析　選擇受精卵作為外源基因的受體細(xì)胞是因?yàn)檫@種細(xì)胞具有全能性，而且全能性最高，A正確；采用DNA分子雜交技術(shù)可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因，但不能檢測(cè)外源基因在小鼠細(xì)胞內(nèi)是否成功表達(dá)，B錯(cuò)誤；人的生長(zhǎng)激素基因能在小鼠細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，說(shuō)明遺傳密碼在不同種生物中可以通用，C正確；將轉(zhuǎn)基因小鼠體細(xì)胞進(jìn)行核移植(克隆)，可以獲得多個(gè)具有外源基因的后代，D正確。 4.北極比目魚中有抗凍基因，其編碼的抗凍蛋白具有11個(gè)氨基酸的重復(fù)序列，該序列重復(fù)次數(shù)越多，抗凍能力越強(qiáng)。如圖是獲取轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株的過(guò)程示意圖，有關(guān)敘述正確的是(　　) A.過(guò)程①獲取的目的基因，可用于基因工程和比目魚基因組測(cè)序 B.將多個(gè)抗凍基因編碼區(qū)依次相連成能表達(dá)的新基因，不能得到抗凍性增強(qiáng)的抗凍蛋白 C.過(guò)程②構(gòu)成的重組質(zhì)粒缺乏標(biāo)記基因，需要轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌才能進(jìn)行篩選 D.應(yīng)用DNA探針技術(shù)，可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表達(dá) 答案　B 解析　將多個(gè)抗凍基因編碼區(qū)相連形成能表達(dá)的新基因，合成的蛋白質(zhì)為新的蛋白質(zhì)，不能得到抗凍性增強(qiáng)的抗凍蛋白，B正確；過(guò)程①是利用逆轉(zhuǎn)錄法合成目的基因，由于沒(méi)有非編碼區(qū)和編碼區(qū)中的內(nèi)含子，所以不能用于比目魚基因組測(cè)序；用作載體的質(zhì)粒，必須具有標(biāo)記基因才能便于檢測(cè)和篩選；應(yīng)用DNA探針技術(shù)，可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株中目的基因的存在和轉(zhuǎn)錄，但不能檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)，A、C、D錯(cuò)誤。 二、非選擇題 5.(2018嘉興模擬)我國(guó)目前臨床使用的乙肝疫苗大多為基因工程疫苗，其有效成分是一種叫做乙肝表面抗原的蛋白質(zhì)(S蛋白)，對(duì)應(yīng)的基因?yàn)閟基因。請(qǐng)回答： (1)在構(gòu)建重組DNA分子時(shí)，要用限制性核酸內(nèi)切酶處理________，并用__________酶使兩者結(jié)合。將重組DNA分子導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，經(jīng)篩選得到工程細(xì)胞。 (2)在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，工程細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中有________________現(xiàn)象，需要定期使用____________酶處理，以便于分瓶培養(yǎng)。 (3)為提高工程細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，下列措施中不需采用的是________。 A.取單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng) B.加入胰島素 C.二氧化碳培養(yǎng)箱 D.加入動(dòng)物血清 (4)由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)較難，成本較高，近些年科學(xué)家們又發(fā)明了“乳腺生物發(fā)生器”，進(jìn)而從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中提取所需產(chǎn)品。在這種技術(shù)中，作為重組DNA分子受體細(xì)胞的一般是________________。 答案　(1)s基因和載體DNA　DNA連接　(2)接觸抑制　胰蛋白　(3)A　(4)受精卵 解析　(1)在構(gòu)建重組DNA分子時(shí)，要用限制性核酸內(nèi)切酶處理s基因和載體DNA，并用DNA連接酶使兩者結(jié)合。(2)在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中存在接觸抑制現(xiàn)象，需要定期使用胰蛋白酶處理，以便于分瓶培養(yǎng)。(3)取單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)不會(huì)提高工程細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，A錯(cuò)誤；胰島素能促進(jìn)血糖進(jìn)入組織細(xì)胞，因此提高工程細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，應(yīng)該在培養(yǎng)基中添加胰島素，B正確；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需要一定的氣體環(huán)境，因此需要放在二氧化碳培養(yǎng)箱中，CO2的主要作用是維持培養(yǎng)液的pH，C正確；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，為了給細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)，需要在培養(yǎng)基中加入動(dòng)物血清，D正確。(4)培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，應(yīng)該以受精卵作為受體細(xì)胞，因?yàn)槭芫训娜苄宰罡摺? 6.(2018紹興聯(lián)考)基因敲除是針對(duì)某個(gè)序列已知但功能未知的基因，改變其基因結(jié)構(gòu)，令該基因功能喪失，從而對(duì)生物體造成影響，進(jìn)而推測(cè)出該基因功能的一門技術(shù)。以下是制備APOE基因敲除小鼠的常規(guī)過(guò)程： 注：Neo基因是抗新霉素的抗藥基因；APOE是載脂蛋白E，參與脂蛋白的代謝與轉(zhuǎn)化。 請(qǐng)回答： (1)為了獲得APOE基因，可以用_______________或者PCR擴(kuò)增。過(guò)程②中所需的工具酶有__________。Neo基因除了破壞APOE基因外，還具有的作用最可能是____________。 (2)培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞時(shí)，首先要在培養(yǎng)皿底部制備飼養(yǎng)層，用于飼養(yǎng)層的細(xì)胞一般是__________________。經(jīng)過(guò)⑥克隆以后的細(xì)胞的后裔細(xì)胞群稱為純系，細(xì)胞純系的特點(diǎn)是________________________________，從而便于研究。 (3)純合的APOE基因敲除小鼠________(填“能”或“不能”)表達(dá)APOE，與正常小鼠相比表現(xiàn)出____________________________性狀。 答案　(1)化學(xué)方法合成　限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶　作為標(biāo)記基因，便于篩選　(2)胚胎成纖維細(xì)胞　遺傳性狀均一，表現(xiàn)的性狀相似　(3)不能　脂蛋白的代謝和轉(zhuǎn)化異常 解析　(1)為了獲得APOE基因(目的基因)，可以用化學(xué)方法合成或者PCR擴(kuò)增。過(guò)程②是形成重組DNA分子的過(guò)程。Neo基因除了破壞APOE基因外，還具有的作用最可能是作為標(biāo)記基因，便于篩選出能在含新霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的受體細(xì)胞。(2)培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞時(shí)，首先要在培養(yǎng)皿底部制備飼養(yǎng)層，用于飼養(yǎng)層的細(xì)胞一般是胚胎成纖維細(xì)胞。經(jīng)過(guò)⑥克隆以后的細(xì)胞的后裔細(xì)胞群稱為純系，細(xì)胞純系的特點(diǎn)是遺傳性狀均一，表現(xiàn)的性狀相似，從而便于研究。(3)純合的APOE基因敲除小鼠由于APOE基因結(jié)構(gòu)被破壞，因而不能表達(dá)APOE基因，由于APOE參與脂蛋白的代謝與轉(zhuǎn)化，因此與正常小鼠相比，APOE基因敲除小鼠會(huì)表現(xiàn)出脂蛋白的代謝和轉(zhuǎn)化異常性狀。 7.(2018溫州3月選考模擬)請(qǐng)回答下列有關(guān)轉(zhuǎn)基因的問(wèn)題： (1)利用圖示質(zhì)粒和目的基因培育轉(zhuǎn)基因醋化醋桿菌。圖中標(biāo)注了相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)，其中酶切位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。 利用圖示質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用____________________兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割。在首次篩選轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的醋化醋桿菌時(shí)，可用移液管取0.1mL醋化醋桿菌懸液，涂布在添加__________的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。配制該培養(yǎng)基時(shí)，通常加入___________來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓。當(dāng)成功選出所需菌種進(jìn)行醋酸發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵瓶中的醋化醋桿菌通常用鋸末或刨花等材料____________化。 (2)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)(目的基因能1個(gè)或多個(gè)導(dǎo)入并整合到受體細(xì)胞染色體上)獲得抗蟲(E)抗除草劑(T)的大豆植株甲，若甲自交F1中抗蟲抗除草劑∶抗蟲不抗除草劑∶不抗蟲抗除草劑＝11∶4∶1。則導(dǎo)入受體細(xì)胞的基因E和T分別至少有幾個(gè)？________。 A.1、1B.1、2C.2、1D.2、2 答案　(1)BamHⅠ、HindⅢ(缺一不可)　四環(huán)素　甘露醇　固定　(2)C 解析　(1)為防止錯(cuò)誤連接及自身環(huán)化，應(yīng)采用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割。篩選含重組DNA分子的醋化醋桿菌時(shí)，用移液管取懸液，涂布在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基中來(lái)篩選。醋化醋桿菌培養(yǎng)時(shí)，通常加甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓。發(fā)酵瓶中的醋化醋桿菌通常用鋸末或刨花等材料固定化。(2)根據(jù)甲自交F1中抗蟲∶不抗蟲＝15∶1，抗除草劑∶不抗除草劑＝3∶1推測(cè)導(dǎo)入的抗蟲基因2個(gè)，抗除草劑基因1個(gè)，C正確。 8.浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院喻景權(quán)教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，一種植物激素——油菜素內(nèi)酯能促進(jìn)農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝。用油菜素內(nèi)酯處理后，許多參與農(nóng)藥降解的基因(如P450基因和GST)的表達(dá)和酶活性都得到提高，在這些基因“指導(dǎo)”下合成的蛋白酶能把農(nóng)藥逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒甚至無(wú)毒物質(zhì)，有的則被直接排出體外。某課題組進(jìn)一步進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)操作，請(qǐng)回答下列問(wèn)題： (1)獲得油菜素內(nèi)酯合成酶基因的方法有______________________________(至少兩種方法)。步驟①用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因時(shí)用到的耐高溫酶通常是指_____________________________；步驟②用到的酶有__________________________________________________________。 (2)圖中導(dǎo)入重組質(zhì)粒的方法是_____________，在導(dǎo)入之前應(yīng)用一定濃度的______________處理受體細(xì)菌。 (3)導(dǎo)入重組質(zhì)粒2以后，往往還需要進(jìn)行檢測(cè)和篩選，可用_________制成探針，檢測(cè)是否導(dǎo)入了重組基因，在培養(yǎng)基中加入______________可將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。 (4)請(qǐng)你為該課題命名：______________________________________________________。 答案　(1)從cDNA文庫(kù)中獲取、從基因組文庫(kù)中獲取、化學(xué)方法合成目的基因或PCR技術(shù)擴(kuò)增(任選其中兩項(xiàng)即可)　TaqDNA聚合酶　限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶　(2)感受態(tài)細(xì)胞法　氯化鈣溶液　(3)紅霉素抗性基因　紅霉素　(4)探究油菜素內(nèi)酯能否促進(jìn)土壤中農(nóng)藥的降解 解析　進(jìn)行基因工程操作時(shí)，首先要獲取目的基因，其方法有多種：從cDNA文庫(kù)中獲取、從基因組文庫(kù)中獲取、化學(xué)方法合成目的基因或PCR技術(shù)擴(kuò)增等。在構(gòu)建重組DNA分子的過(guò)程中，用到的工具酶有限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。圖中的受體細(xì)胞是細(xì)菌，故用感受態(tài)細(xì)胞法導(dǎo)入重組DNA分子，導(dǎo)入后需檢測(cè)和篩選。從圖中可以看出，最終是通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)菌對(duì)土壤中殘留農(nóng)藥的降解能力。 9.我國(guó)一科研團(tuán)隊(duì)將小麥液泡膜Na＋/K＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(TaNHX2基因)轉(zhuǎn)移到水稻細(xì)胞內(nèi)，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽水稻新品種。請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題： (1)為保證目的基因在水稻細(xì)胞中能夠表達(dá)，載體上應(yīng)含有特定的___________(A.復(fù)制原點(diǎn)　B.啟動(dòng)子　C.標(biāo)記基因)。 (2)水稻的轉(zhuǎn)化過(guò)程為：將水稻幼胚接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)____________過(guò)程，培養(yǎng)出愈傷組織，然后用________________法，將目的基因和相關(guān)功能片段整合到愈傷組織細(xì)胞的染色體DNA上，最后誘導(dǎo)愈傷組織形成水稻植株。 (3)為驗(yàn)證外源基因整合到水稻基因組后是否轉(zhuǎn)錄，可從轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞中提取所有mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成____________，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用TaNHX2基因特異引物，通過(guò)________方法進(jìn)行基因擴(kuò)增。若以根細(xì)胞為材料擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性(有產(chǎn)物生成)，以葉細(xì)胞為材料擴(kuò)增結(jié)果為陰性(無(wú)產(chǎn)物生成)，則說(shuō)明____________________________________。 (4)將生長(zhǎng)至4葉期的轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)入高濃度的NaCl溶液中培養(yǎng)，進(jìn)行耐鹽試驗(yàn)，用非轉(zhuǎn)基因幼苗作為對(duì)照。培養(yǎng)30天后觀察現(xiàn)象，若_______________________________________，則說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株獲得了耐鹽特性。 答案　(1)B　(2)脫分化　農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化　(3)cDNA　PCR　目的基因僅在根細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，未在葉細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄　(4)轉(zhuǎn)基因植株存活率高于非轉(zhuǎn)基因植株