《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》編制說明

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《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》國家標準編制說明 1任務來源 1 2起草的目的意義 1 2.1企業(yè)產(chǎn)品質量控制的需要 1 2.2完善國家標準的需要 2 3芒果苷研究、應用與標準現(xiàn)狀 2 3.1芒果苷研究 2 3.2芒果苷開發(fā)應用 2 3.3芒果苷標準 2 4主要起草過程 3 4.1成立標準制定工作組 3 4.2確定工作計劃和標準制定原則 3 4.3查詢國內外相關標準和文獻資料 3 4.4 研究建立標準方法，開展條件實驗 4 4.5方法驗證 6 4.6形成標準討論稿和編制說明 6 4.7形成標準草案 6 4.8形成標準征求意見稿和編制說明 7 4.9征求意見并形成標準送審稿和編制說明 7 5 本標準與國內外分析方法的關系 7 6 主要技術指標依據(jù)與說明 8 6.1標準名稱 8 6.2前言 8 6.3主體內容 8 6.4“范圍”的界定 8 6.5原理 8 6.6試劑 8 6.7儀器和設備 9 6.8芒果葉樣品制備 10 6.9樣品中芒果苷的提取 10 6.9.1 提取溶劑比例 10 6.9.2超聲時間 11 6.9.3 提取溶劑體積 11 6.9.4 提取次數(shù) 12 6.10 芒果苷HPLC定量分析方法的建立 13 6.10.1檢測波長選擇 13 6.10.2 色譜柱的選擇 15 6.10.3不同洗脫條件 15 6.10.3.1等度洗脫 15 6.10.3.2梯度洗脫 16 6.10.4芒果苷HPLC法檢測優(yōu)化后的色譜條件 17 6.10.5 標準曲線 18 6.10.6 檢出限和定量限 18 6.10.7 精密度 19 6.10.8 穩(wěn)定性 19 6.10.9 重復性 20 6.10.10方法的準確度 20 6.10.11小結 22 6.11 方法驗證 22 6.11.1 參加驗證的實驗室 22 6.11.2 方法驗證結果 22 6.12實際樣品檢測 28 6.13驗證結論 29 7采用國際標準和國外先進標準程度，以及與國際、國外同類標準水平的對比情況 31 8與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準的關系 31 9標準作為強制性或推薦性標準的意見 31 10實施標準的建議 31 11參考文獻 31 II 1任務來源 本國家標準的制定任務是根據(jù)國家標準化管理委員會下達的國家標準制定計劃《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》項目（計劃號20193347-T-424）起草。國家標準計劃《芒果葉中芒果苷的測定 高效液相色譜法》由424-cnis（中國標準化研究院）歸口上報及執(zhí)行，主管部門為國家市場監(jiān)督管理總局(質檢)。本標準由中國熱帶農業(yè)科學院分析測試中心和中國標準化研究院共同起草。本標準主要起草人：陽辛鳳，蘭韜，席興軍，韓丙軍，趙方方，張月，郭曉杰，王盼，唐濤。 2起草的目的意義 芒果樹（Mangifera indica L.）屬于漆樹科植物，其葉片芒果葉為廣西等地方習用藥材, 收載于《廣西中藥材標準》 1990年版。芒果葉及芒果葉提取物等制品的主要活性成分為芒果苷(Mangiferin，CAS 4773-96-0)，此外，芒果苷是百合科植物知母根莖、龍膽科植物藏茵陳等中藥材的主要活性成分。藥理研究表明, 芒果苷具有多種藥理活性, 如鎮(zhèn)咳、殺菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂等。芒果苷為2015年版中國藥典規(guī)定的知母等中藥材鑒別和質量控制的重要檢測指標。對于芒果葉及芒果葉提取物等加工產(chǎn)品，芒果苷含量水平是重要的質量指標。 2.1企業(yè)產(chǎn)品質量控制的需要 目前，市面上含有芒果苷的藥品有芒果止咳片（廣西中醫(yī)藥大學制藥廠、廣西桂西制藥有限公司）、銀花芒果片（廣西南珠制藥有限公司）、銀花芒果膠囊（廣西寶瑞坦制藥有限公司）等。 我國海南、廣西、云南、四川等省均有產(chǎn)業(yè)化的芒果栽培（例如2017年海南省芒果面積達到38萬畝，產(chǎn)值3個億），每年產(chǎn)生大量的芒果葉廢棄物。同時，以芒果葉為原料生產(chǎn)芒果葉提取物/干浸膏和復方藥品的規(guī)模不斷擴大。但是，芒果苷含量測定尚無國家標準, 且對芒果苷原料藥的提取工藝不同, 導致原料藥質量標準不統(tǒng)一, 藥品臨床療效不穩(wěn)定。因此，本標準的制定是企業(yè)進行產(chǎn)品質量控制的需要。 2.2完善國家標準的需要 我國現(xiàn)行檢測方法標準中，尚無芒果苷檢測方法標準。為了貫徹落實《國務院辦公廳關于促進熱帶作物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見》（國辦發(fā)[2010]45號）文件精神，科學指導芒果葉生產(chǎn)、加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，急需制定《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》國家標準，建立芒果葉中芒果苷含量檢測標準，為芒果苷原料藥的質量控制提供方法，為芒果苷產(chǎn)品研發(fā)及芒果葉綜合開發(fā)利用提供依據(jù)，進而引導生產(chǎn)，規(guī)范市場。所以，本標準的制定也是完善芒果葉等中藥材及其加工產(chǎn)品檢測方法國家標準的需要。 3芒果苷研究、應用與標準現(xiàn)狀 3.1芒果苷研究 國內外對芒果苷的研究十分廣泛，可查詢到大量的論文與專利，研究范圍包括提取分離、純品制備、分析檢測、結構表征、藥理活性、毒性、分子結構改性、產(chǎn)品加工等方面。 3.2芒果苷開發(fā)應用 以芒果苷為活性成分的加工產(chǎn)品有芒果葉提取物、干浸膏、復方中成藥等。成都德思特生物技術有限公司、四川省維克奇生物科技有限公司、成都植標化純生物技術有限公司、陜西斯諾特生物技術有限公司、青島捷世康生物科技有限公司等眾多公司均生產(chǎn)芒果葉提取物、芒果葉干浸膏、高純芒果苷。 廣西中醫(yī)藥大學制藥廠、廣西桂西制藥有限公司、廣西南珠制藥有限公司、廣西寶瑞坦制藥有限公司生產(chǎn)含有芒果葉干浸膏的復方藥品，例如芒果止咳片、銀花芒果片、銀花芒果膠囊，均為國藥準字藥品。 總的說來，芒果苷的開發(fā)利用尚處于初級發(fā)展階段，雖然有干浸膏、復方中成藥等幾種類型的產(chǎn)品，但還沒有形成規(guī)?；?。 3.3芒果苷標準 可查詢到已廢止的芒果苷地方標準一項，地方標準《芒果苷》（DB45/T 512-2008，已廢止），該標準由廣西中醫(yī)學院歸口上報，主管部門為廣西壯族自治區(qū)質量技術監(jiān)督局，主要起草單位為廣西中醫(yī)學院，公布日期2008-07-28，實施日期2008-08-28。此外，未查到與芒果苷相關的國家標準、行業(yè)標準、地方標準和企業(yè)標準。芒果苷分析方法標準的缺失，使得相關企業(yè)在市場競爭中無標準可用，相關產(chǎn)品缺乏技術支撐，質量參差不齊。 因此，有必要盡快制定《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》國家標準，以滿足相關企業(yè)和檢測、管理結構的需要。 4主要起草過程 4.1成立標準制定工作組 國家重點研發(fā)項目立項后，2017年11月10日在北京市西藏大廈召開了國家標準《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》第一次工作會。參加單位有中國熱帶農業(yè)科學院、中國標準化研究院等。會議成立了由國熱帶農業(yè)科學院、中國標準化研究院等單位參加的標準工作組，主要由從事標準制修訂、儀器分析、具有豐富技術經(jīng)驗的專業(yè)研究人員組成，工作組制定了初步的標準編制工作計劃。 4.2確定工作計劃和標準制定原則 按照工作任務要求，工作組制定了標準起草工作計劃和任務分工。 在充分研究與討論的基礎上，制定了標準制定原則： （1）先進性：其準確度、精密度和靈敏度達到較高水平。 （2）適用性：要適應我國中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求，滿足中藥現(xiàn)代化的需要。 （3）可操作性：符合我國目前檢測儀器設備和試劑、材料的供應條件。 （4）實用性：符合檢測從業(yè)人員的技術水平，能被國內主要的環(huán)境分析實驗室所使用并達到所規(guī)定的要求。要有利于提高芒果葉及其制品質量，為中藥質量控制部門、有關企業(yè)和三農服務。 4.3查詢國內外相關標準和文獻資料 2017年，開始開展“芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法”方法研究。由于在現(xiàn)行國家標準、行業(yè)標準、地方標準、團體標準和企業(yè)標準中，均無相應的測定方法標準，所以我們查閱相關文獻并開展研究工作。分析芒果苷的結構特點，芒果苷具有雙苯吡酮結構，在258nm、317nm、368nm具有特征吸收。《中國藥典》2015年版中，有“知母”條目，芒果苷為知母鑒別和質量控制的重要檢測指標，知母中芒果苷的含量測定時采用液相色譜法。該方法的要點有：（1）以稀乙醇為芒果苷提取溶劑，（2）通過超聲進行輔助提取，（3）采用C18色譜柱，（4）檢測波長258nm，（5）流動相為乙腈-0.2%冰醋酸水溶液（15 : 85)。 中國知網(wǎng)、萬方等中文數(shù)據(jù)庫中查詢到的公開發(fā)表文獻中，關于芒果葉中芒果苷的測定幾乎都是依據(jù)或參考《中國藥典》2015年版規(guī)定的方法。通過對SpringerLink、Elsevier ScienceDirect(SD)、Wiley等國外數(shù)據(jù)庫檢索到少量以液相色譜-串聯(lián)質譜法對芒果苷進行檢測。 液相色譜法檢測芒果苷具有準確度好、精密度高、檢出限與定量限低、操作簡單等優(yōu)點，考慮到標準的適用性與可操作性，因此確定采用液相色譜法檢測樣品中芒果苷。借鑒《中國藥典》2015年版知母中芒果苷含量測定的方法，以芒果葉為樣品，經(jīng)過初步試驗，證明方法是可行的。而后對方法進行優(yōu)化，對方法進行驗證，結果表明方法的準確性、回收率、精密度等方面都能達到國家可標準的要求，并且基本符合制定國家標準的條件，并于2018年向國家標準化管理委員會提出立項申請。 4.4 研究建立標準方法，開展條件實驗 標準工作組按照計劃任務書的要求，結合制定標準的要求，研究建立標準方法的實驗方案，并進行方法前處理條件的選擇、儀器條件的確定和方法精密度、準確度及檢出限的測定等試驗。 2017年11月始，標準起草工作組赴海南省東方市、三亞市等芒果主產(chǎn)地進行調研，獲取了大量相關信息與數(shù)據(jù)。2017年11月27日從東方廣壩農場采集了24份芒果葉樣品（表1），其中臺農、貴妃、金煌葉片各8份。2019年2月27日從三亞閩新農場等采集芒果也樣品20份（表2），其中臺農、貴妃、金煌、象牙葉片各5份 表1 芒果葉樣品列表（1） 序號 品種 樣品編號 采樣地點 采樣時間 1 臺農 TN20171123-1 東方廣壩農場 2017.11.27 2 臺農 TN20171123-2 東方廣壩農場 2017.11.27 3 臺農 TN20171123-3 東方廣壩農場 2017.11.27 4 臺農 TN20171123-4 東方廣壩農場 2017.11.27 5 臺農 TN20171123-5 東方廣壩農場 2017.11.27 6 臺農 TN20171123-6 東方廣壩農場 2017.11.27 7 臺農 TN20171123-7 東方廣壩農場 2017.11.27 8 臺農 TN20171123-8 東方廣壩農場 2017.11.27 9 金煌 JH20171123-1 東方廣壩農場 2017.11.27 10 金煌 JH20171123-2 東方廣壩農場 2017.11.27 11 金煌 JH20171123-3 東方廣壩農場 2017.11.27 12 金煌 JH20171123-4 東方廣壩農場 2017.11.27 13 金煌 JH20171123-5 東方廣壩農場 2017.11.27 14 金煌 JH20171123-6 東方廣壩農場 2017.11.27 15 金煌 JH20171123-7 東方廣壩農場 2017.11.27 16 金煌 JH20171123-8 東方廣壩農場 2017.11.27 17 貴妃 GF20171123-1 東方廣壩農場 2017.11.27 18 貴妃 GF20171123-2 東方廣壩農場 2017.11.27 19 貴妃 GF20171123-3 東方廣壩農場 2017.11.27 20 貴妃 GF20171123-4 東方廣壩農場 2017.11.27 21 貴妃 GF20171123-5 東方廣壩農場 2017.11.27 22 貴妃 GF20171123-6 東方廣壩農場 2017.11.27 23 貴妃 GF20171123-7 東方廣壩農場 2017.11.27 24 貴妃 GF20171123-8 東方廣壩農場 2017.11.27 表2 芒果葉樣品列表（2） 序號 品種 樣品編號 采樣地點 采樣時間 1 象牙 2019-01 三亞北嶺村大矛小組 2019.2.27 2 象牙 2019-02 三亞北嶺村大矛小組 2019.2.27 3 象牙 2019-03 三亞北嶺村大哺叭小組 2019.2.27 4 象牙 2019-04 三亞閩新農場 2019.2.27 5 象牙 2019-05 三亞閩新農場 2019.2.27 6 金煌 2019-06 三亞北嶺村大矛小組 2019.2.27 7 金煌 2019-07 三亞北嶺村大矛小組 2019.2.27 8 金煌 2019-08 三亞北嶺村壩后小組 2019.2.27 9 金煌 2019-09 三亞南濱居南雅六隊 2019.2.27 10 金煌 2019-10 三亞南濱居閩新農場 2019.2.27 11 貴妃 2019-11 三亞北嶺村壩后小組 2019.2.27 12 貴妃 2019-12 三亞南濱居南雅六隊 2019.2.27 13 貴妃 2019-13 三亞南濱居雙聯(lián)農場 2019.2.27 14 貴妃 2019-14 三亞三公里鹿角園 2019.2.27 15 貴妃 2019-15 三亞海棠村山地 2019.2.27 16 臺農 2019-16 三亞南濱居雙聯(lián)農場 2019.2.27 17 臺農 2019-17 三亞三公里山地 2019.2.27 18 臺農 2019-18 三亞三公里山地 2019.2.27 19 臺農 2019-19 三亞三公里鹿角園 2019.2.27 20 臺農 2019-20 三亞三公里鹿角園 2019.2.27 第一批樣品采集后，開始開展實驗室驗證工作，建立芒果苷高效液相色譜分析方法，包括線性范圍、相關系數(shù)、加標回收率、準確度、精密度、檢出限、定量限等；樣品中芒果苷提取條件的摸索與優(yōu)化，如提取溶劑種類、提取溶劑體積、超聲提取時間等。 4.5方法驗證 2019年4～5月，由5家單位對“芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法”進行驗證，分別是海南大學分析測試中心、海南省食品檢驗檢測中心、海南省動物疫病預防控制中心、中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所、中國熱帶農業(yè)科學院分析測試中心，通過統(tǒng)計檢驗技術確認外部實驗室試驗結果的準確性。 4.6形成標準討論稿和編制說明 2019年7月5日，起草工作組組織相關單位和專家，在山東青島中國科學院蘭州化學物理研究所召開第二次標準起草工作會。參會單位包括中國熱帶農業(yè)科學院、中國標準化研究院、中國科學院蘭州化學物理研究所、北京化工大學、浙江大學等。 與會專家對《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》標準草案中的英文名稱、范圍、術語和定義、基本要求、主要技術指標、附錄等章條提出了詳細的意見，會后根據(jù)修改意見形成了《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》標準討論稿及其編制說明。 4.7形成標準草案 標準起草工作組查閱、收集和整理了國內外有關研究進展和專利、標準、法規(guī)等文獻資料，掌握了相關標準的現(xiàn)狀；對文獻中芒果苷測定方法進行了對比和總結，為標準文本的編制奠定理論基礎。在《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》國家標準第一次起草工作會議的基礎上，起草工作組相關單位共同討論起草形成了《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》國家標準的技術框架和主要內容，初步形成了《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》標準草案。 4.8形成標準征求意見稿和編制說明 在前期工作的基礎上，起草工作組組織相關單位和專家于2019年10月22日在北京中國標準化研究院召開第三次標準起草工作會。參會單位包括中國熱帶農業(yè)科學院、中國標準化研究院、北京化工大學、浙江大學等。與會成員認真討論《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》標準討論稿后，根據(jù)討論結果修改形成了《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》征求意見稿及編制說明。會議同時討論了下一階段征求意見的單位和專家名單。 4.9征求意見并形成標準送審稿和編制說明 2019年月日-2019年月日，起草工作組根據(jù)討論的專家和單位名單，分別向相關的行業(yè)主管部門、科研機構、檢測部門和企業(yè)等30個單位和專家發(fā)出了標準征求意見稿，向相關單位和專家征求標準修改意見。截止到2019年月日，共收集到農業(yè)部農產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心（南寧）、…等25家科研機構、檢測機構、管理部門、生產(chǎn)企業(yè)等單位提出的反饋意見40條。起草工作組對提出的意見經(jīng)過反復研究、討論和處理后，修改形成了《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》送審稿及編制說明。具體意見匯總和處理表見《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》征求意見稿及編制說明。國家標準征求意見匯總處理表。 5 本標準與國內外分析方法的關系 本標準研究旨在建立一項滿足我國常用中草藥芒果葉中芒果苷含量檢測要求，在質量控制目標和技術手段上與國際接軌，適應我國大部分中草藥質控實驗室儀器設備和技術能力的檢測方法標準。通過查閱國內外相關文獻資料，制定條件優(yōu)化方案，確保本方法前處理所采用的裝置操作簡便，能夠滿足國內實驗室的條件要求。本標準擬采用高效液相色譜-紫外檢測分析方法（HPLC-UV）測定芒果苷。樣品的前處理，即芒果葉中芒果苷的提取采用超聲法，并對超聲時間、提取溶劑種類、提取溶劑比例、提取次數(shù)等因素進行優(yōu)化；檢測方法參考《中國藥典》2015年版關于知母藥材種芒果苷的檢測方法及其他文獻資料，選擇合適的色譜柱以及儀器條件。力求方法在穩(wěn)定、可靠和實用的基礎上，達到國際先進水平，以適應我國中草藥芒果葉中芒果苷含量檢測、質控與管理的需要。 6主要技術指標依據(jù)與說明 6.1標準名稱 本標準主要解決芒果葉中芒果苷測定的技術問題，所以將本標準的名稱定為：《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》。本標準名稱中芒果一詞的英文，根據(jù)芒果的拉丁文名稱、相關國家標準的翻譯方式、行業(yè)內的通行用法確定為“Mangifera indica L.”。因此將本標準的全稱《芒果葉中芒果苷含量的測定 高效液相色譜法》翻譯為“Determination of mangiferin in mango (Mangifera indica L.) leaves – high-performance liquid chromatorgraphy”。 6.2前言 明確了本標準的歸口單位及主要起草單位、起草人。 6.3主體內容 標準的主體內容包括：范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器和設備、測定步驟、空白試驗、結果計算與表示、精密度和回收率、檢出限、檢驗報告等。 6.4“范圍”的界定 本標準規(guī)定了用高效液相色譜-質譜法測定芒果葉中芒果苷含量的原理、材料、儀器與設備、測定步驟、結果計算與表示、精密度和回收率、檢驗報告。 本標準適用于芒果葉中芒果苷含量的測定。 6.5原理 樣品經(jīng)提取后，將提取液過濾，經(jīng)反向高效液相色譜分離測定，在258nm下檢測，根據(jù)保留時間定性，外標峰面積定量。 6.6試劑 6.6.1 甲醇（CH4O）：色譜純。 6.6.2 乙腈（C2H3N）：色譜純。 6.6.3 冰醋酸（CH4O2）：優(yōu)級純，含量≥98.8%。 6.6.4 甲醇溶液（50%）：甲醇與超純水按照1:1體積比混合。 6.6.5 冰醋酸溶液（0.2%）：1 L超純水中加入2 mL冰醋酸。 6.6.6 芒果苷（C19H18O11，CAS : 4773-96-0）標準品：純度≥98%。 6.6.7 有機濾模：孔徑0.22μm。 6.6.8 流動相：乙腈（4.2）：冰醋酸溶液（4.5）=15:85（體積比），冰醋酸溶液使用前經(jīng)濾膜過濾。 6.6.9 芒果苷標準儲備溶液（200 μg/mL）：稱取10 mg（精確至0.10mg）芒果苷標準品（4.6），置于50 mL容量瓶中（5.8），加甲醇（4.1）超聲溶解并定容至刻度線，混勻，配制成200 μg/mL的標準儲備溶液，–18℃冰箱避光保存，有效期3個月。 6.6.10 芒果苷中間濃度標準溶液：準確移取5mL芒果苷標準儲備溶液（4.9）于10mL容量瓶（5.8）中，用50%甲醇溶液（4.4）稀釋至定容刻度線，搖勻，得到芒果苷中間濃度標準溶液（質量濃度100 μg/mL）。 6.6.11 芒果苷系列標準工作液：分別準確移取0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL芒果苷中間濃度標準溶液（4.10）于不同的10mL容量瓶（5.8）中，用50%甲醇溶液（4.4）稀釋、定容刻度線，搖勻，得到芒果苷系列標準工作溶液（質量濃度分別為1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL）。 6.6.12 除另外有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水應復合GB/T6682中一級水的要求。 6.7儀器和設備 6.7.1 液相色譜儀：配紫外（UV）檢測器或PDA檢測器。 6.7.2 超聲波振蕩器：功率不低于250 W，或相當?shù)脑O備。 6.7.3分析天平：根據(jù)方法準確度的要求，芒果苷對照品的稱樣量需精確到0.1 mg，因此使用感量為0.1 mg的分析天平 6.7.3 電子天平：感量0.1 mg。 6.7.4 組織搗碎機 6.7.5渦旋振蕩器 6.10色譜柱：C18 液相色譜柱（250mm4.6mm，5μm）或其他等效色譜柱。 6.7.6針式微孔濾器：0.22 μm，直徑13 mm的聚四氟乙烯（PTFE）濾膜或者相當者。 6.7.7 離心管：100 mL（螺旋蓋）。 6.7.8 容量瓶：10 mL，50 mL，100 mL 6.7.9三角瓶：250 mL（磨口塞）。 6.8芒果葉樣品制備 新鮮芒果樹葉片，切碎，放入打漿機中打碎，裝入樣品瓶中，密封，于-20℃保存。 6.9樣品中芒果苷的提取 6.9.1 提取溶劑比例 稱取芒果葉樣品1.00g(精確至0.01g) 于100 mL離心管中。配置不同體積比的甲醇/水混合溶液（100/0、70/30、50/50、30/70）作為提取溶劑。離心管中加入提取溶劑50mL，高速勻漿1 min，將樣品全部轉移到250 mL具塞磨口三角瓶中。分別用40mL、30mL提取劑洗滌離心管和刀頭共2次，溶液合并至三角瓶中。將三角瓶瓶塞蓋上，放入超聲清洗儀中，室溫下超聲提取30 min。取出，靜置20min。將上清轉入250 mL容量瓶中，樣品殘渣留在三角瓶中。三角瓶中加入提取溶劑100mL，超聲30 min，進行二次提取。容量瓶上放置漏斗，放入脫脂棉，將樣品提取液過濾，濾液合并至250mL容量瓶，用少量提取溶劑洗滌三角瓶內壁與漏斗內壁共3次，洗滌液合并至250mL容量瓶，用提取溶劑定容至250mL，搖勻，得到芒果葉樣品提取液。用1.0 mL刻度玻璃移液管，吸取樣品提取液1.0mL，放入100mL容量瓶中，用提取溶劑定容，0.22 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶,供液相色譜分析。 不同配比的甲醇/水提取溶劑對芒果苷提取率的影響，結果如圖1 所示。當提取溶劑中甲醇/水比例為70/30（v/v）時，芒果苷提取率最高。 圖1 提取溶劑對芒果苷提取率的影響 6.9.2超聲時間 稱取芒果葉樣品1.00g，放入250mL具塞錐形瓶中，以 70/30的甲醇/水混合溶液為提取溶劑，按照3.3.1進行芒果苷提取，其中超聲提取時間分別采用10、20、30、40、50、60min。 不同的超聲時間對芒果苷提取率的影響，結果如圖2 所示。當超聲時間為30min的甲醇/水溶液時，芒果苷提取率最高。 圖2 超聲時間對芒果苷提取率的影響 6.9.3 提取溶劑體積 稱取芒果葉樣品1.00g，放入250mL具塞錐形瓶中，以 70/30的甲醇/水混合溶液為提取溶劑，超聲時間為30min，按照3.3.1進行芒果苷提取，其中提取溶劑體積分別采用150、180、220、250 mL。 不同的提取溶劑對芒果苷提取率的影響，結果如圖3 所示。當提取溶劑為220mL時，芒果苷提取率最高。 圖3 提取溶劑體積對芒果苷提取率的影響 6.9.4 提取次數(shù) 稱取芒果葉樣品1.00g，放入250mL具塞錐形瓶中，以體積比 70/30的甲醇/水混合溶液為提取溶劑，超聲時間為30min，提取溶劑總體積220mL，按照3.3.1進行芒果苷提取，其中提取次數(shù)分別采用1、2、3次。 提取1次的操作方法為：芒果葉樣品1.00g(精確至0.01g) ，加入體積比70/30的甲醇/水提取溶劑50mL，高速勻漿1 min，將樣品全部轉移到250 mL具塞磨口三角瓶中。分別用40mL、30mL提取劑洗滌離心管和刀頭共2次，溶液合并至三角瓶中，再加入100 mL, 提取溶劑，將三角瓶瓶塞蓋上，放入超聲清洗儀中，室溫下超聲提取30 min。 提取2次的操作方法按照3.3.1。 提取3次的操作方法為：芒果葉樣品1.00g(精確至0.01g) ，加入體積比70/30的甲醇/水提取溶劑50mL，高速勻漿1 min，將樣品全部轉移到150 mL具塞磨口三角瓶中。分別用40mL、30mL提取劑洗滌離心管和刀頭共2次，溶液合并至三角瓶中。將三角瓶瓶塞蓋上，放入超聲清洗儀中，室溫下超聲提取30 min。取出，靜置20min。將上清轉入250 mL容量瓶中，樣品殘渣留在三角瓶中。三角瓶中加入提取溶劑50mL，超聲30 min，進行二次提取，過濾。濾渣中加入提取溶劑50mL，超聲30 min，進行三次提取，過濾。合并濾液。 不同的提取次數(shù)對芒果苷提取率的影響，結果如圖3 所示。當提取次數(shù)為2次時，芒果苷提取率最高。 6.10 芒果苷HPLC定量分析方法的建立 6.10.1檢測波長選擇 為了了解芒果苷標樣在全波長下主成分與雜質的響應強度，采用HPLC法以PDA檢測器對樣品進行全波長掃描（200～400nm），結果如圖5。全掃描結果表明，芒果苷標準樣品在258nm 、317nm 、368nm有吸收峰，強度高。 a b 圖5 芒果苷HPLC 3D掃描圖 a 芒果苷標準樣品，b 溶劑空白 芒果苷最大紫外吸收波長為258nm，為了了解芒果苷標樣在不同波長下主成分與雜質的響應強度，采用HPLC法分別在258nm 、317nm 、368nm進行檢測，結果如圖6。三種波長下，258nm時芒果苷響應最強，317nm時次之，368nm時最弱。在《中華人民共和國藥典（一部）》方法（國家藥典委員會2015）及相關文獻報道中，多采用258nm作為芒果苷檢測波長。綜合以上信息，選擇258nm作為本項目芒果苷HPLC測定的波長。 258nm 317nm 368nm 圖6 芒果苷不同波長的色譜圖 6.10.2 色譜柱的選擇 對照了2款不同的色譜柱，包括Waters Xbridge BEH C18液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）以及Agilent ZORBAX SB-Aq液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）發(fā)現(xiàn)在相同條件下，2種色譜柱均能使主成分與雜質有效分離，與主峰保留時間最接近的雜質的分離度也在2.0以上。但是使用C18柱時主成分響應更高，因此選擇采用C18液相色譜柱。 a b 圖16 芒果苷在不同的色譜柱分離結果 a, Waters Xbridge BEH C18液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）; b, 10ppm, Agilent 圖7 芒果苷在不同色譜柱分離色譜圖 a，Waters Xbridge BEH C18液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）；b，Agilent ZORBAX SB-Aq液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm） 6.10.3不同洗脫條件 6.10.3.1等度洗脫 儀器條件為：Waters 液相色譜儀，UV檢測器，Waters Xbridge BEH C18色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）,波長258nm，流量1mL/min，進樣體積10 μL，柱溫25 ℃。 等度洗脫方式為流動相A（0.1%甲酸-水溶液）/流動相B（乙腈）=85/15（v/v）。 a 芒果苷 a b 溶劑空白 圖3 等度洗脫模式 6.10.3.2梯度洗脫 梯度洗脫模式如表1所示，結果如圖8。 表3 芒果苷梯度洗脫模式 時間/min 0.1%甲酸-水/% 乙腈/% 90 10 2 90 10 5 80 20 7 80 20 10 20 80 12 20 80 14 90 10 15 90 10 a 芒果苷 b 溶劑空白 圖8 梯度洗脫模式 6.10.4芒果苷HPLC法檢測優(yōu)化后的色譜條件 芒果苷HPLC法檢測優(yōu)化后的色譜條件為： Waters 1525高效液相色譜儀，配置紫外檢測器； 色譜柱：Waters Xbridge BEH C18色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）； 紫外檢測波長：258nm； 流動相：0.1%甲酸-水溶液/乙腈=85/15（v/v），流量1mL/min； 進樣體積：10 μL； 柱溫：25 ℃。 在該優(yōu)化色譜條件下，對實際芒果葉樣品中芒果苷含量進行測定，典型的液相色譜譜圖如圖 所示，可以看出芒果苷與雜質分離很好。 a 樣品 b 溶劑空白 圖9 實際樣品HPLC譜圖 6.10.5 標準曲線 圖10 芒果苷標準曲線 以峰面積（y）為縱坐標，以含量（x）為橫坐標做標準曲線。得標準曲線回歸方程標準曲線y = 50600 x – 2930，線性關系良好。 線性范圍：0.01～ 5.0ug/mL 相關系數(shù) r = 0.9993 6.10.6 檢出限和定量限 將對照品溶液逐步稀釋，進行液相色譜分析，計算其峰高與基線噪音高的比，S/N=3（S為對照品峰高，N為基線噪音高）時的對照品濃度為檢出限（LOD），得到芒果苷的檢測限0.08 mg/g；S/N=10時的濃度為定量限（LOQ），得到芒果苷的定量限為0.25 mg/g。 6.10.7 精密度 取配制好的芒果苷對照品溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾后進行HPLC分析，連續(xù)進樣6次，芒果苷對照品HPLC分析結果相對標準偏差RSD為0.89%，表明儀器精密度良好，該方法精密度符合要求。結果見表4。 表4 芒果苷精密度實驗結果 樣品號 芒果苷濃度ug/mL 平均值ug/mL RSD% 1 0.992 1.002 0.89 2 1.013 3 0.995 4 1.004 5 1.011 6 0.995 6.10.8 穩(wěn)定性 取同一供試品制備的供試品溶液在0、4、8、12、16、20時，各進樣一次，按照上述色譜條件測定，記錄芒果苷的峰面積，算得RSD=3.12%，表明供試品溶液在20h內穩(wěn)定性較好。測定結果見表5。 表5 芒果苷穩(wěn)定性實驗結果 進樣時間h 芒果苷濃度mg/g 平均值mg/g RSD% 0 22.59 22.64 3.12 4 23.06 8 22.98 12 23.14 16 21.29 20 22.42 6.10.9 重復性 取同一樣品，共6 份，分別制備供試品溶液，按照“3.4.4”項下色譜條件進樣，測定峰面積，并計算芒果苷濃度。結果，樣品中芒果苷的平均濃度為22.64 mg/g，RSD為2.60％（n 均為6），表明本方法重復性良好。 表6 芒果苷重復性實驗結果 樣品號 芒果苷濃度mg/g 平均值mg/g RSD% 1 21.77 22.24 2.60 2 22.35 3 23.23 4 21.67 5 22.46 6 21.96 6.10.10方法的準確度 芒果苷加樣回收實驗結果見表7。實驗結果表明，此方法加標回收率良好，芒果苷的平均回收率為91.5%~94.8%，RSD范圍為2.36%~6.59%，說明方法準確度高。 表7 芒果苷加標回收結果（n=5） 樣品 添加水平（mg/g） 重復 測定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對標準偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0 0 - - - 基質 （本底） - 1 20.63 20.73 - - - 2 20.60 - 3 20.75 - 4 20.63 - 5 21.05 - 加標 水平1 2.50 1 22.88 23.10 85.80 94.80 6.59 2 23.23 99.80 3 23.23 99.80 4 23.00 90.80 5 23.18 97.80 加標 水平2 5.00 1 25.25 25.31 90.40 91.50 2.36 2 25.15 88.40 3 25.38 92.90 4 25.43 93.90 5 25.33 91.90 加標 水平3 7.50 1 27.85 27.79 94.93 94.07 4.29 2 27.88 95.27 3 27.60 91.60 4 27.40 88.93 5 28.20 99.60 34 6.10.11小結 上述結果表明，高效液相色譜法測定芒果葉中芒果苷，實驗室內方法檢出限為0.08 mg/g，定量限為0.25 mg/g。對芒果葉實際樣品進行加標回收實驗，回收率在91.50% ~ 94.80%之間，相對標準偏差為2.36% ~ 6.59%，說明方法的精密度和準確度良好。 綜上所述，本標準方法能夠滿足芒果葉中芒果苷含量測定要求。 6.11 方法驗證 6.11.1 參加驗證的實驗室 選擇5 家具有資質的實驗室參加方法的驗證工作（表8）。向驗證單位提供方法草案、驗證方案、標準溶液和驗證報告格式。驗證單位按照方法草案準備實驗用品，在規(guī)定時間內完成驗證實驗并反饋驗證結果報告。在方法驗證前，參加驗證的操作人員應熟悉和掌握方法原理、操作步驟及流程。方法驗證過程中所用的試劑和材料、儀器和設備及分析步驟應符合方法相關要求。 表8 驗證單位與儀器型號 序號 定值單位 HPLC/檢測器 色譜柱 1 海南大學分析測試中心 Waters e2695 / UV 資生堂Tech Mate C18 （250mm*4.6mm, 5 μm） 2 海南省食品檢驗檢測中心 Waters e2695 / DAD Waters Xbridge BEH C18（250mm*4.6mm, 5 μm） 3 海南省動物疫病預防控制中心 Waters e2695 / DAD Waters XTerre MS C18（250mm*4.6mm, 5 μm） 4 中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所 Waters e2695 / DAD Athena C18 （250mm*4.6mm, 5 μm） 5 中國熱帶農業(yè)科學院分析測試中心 Waters 1525 / UV Waters Xbridge BEH C18（250mm*4.6mm, 5 μm） 6.11.2 方法驗證結果 5家實驗室對芒果苷加標量為2.50、5.00、7.50 mg/g的三個加標水平的芒果葉樣品進行了分析測定，結果列于表9~表13。 海南大學分析測試中心（單位1）驗證結果（表9）表明，芒果苷的平均回收率為100.43% ~107.84%，RSD范圍為2.25% ~ 7.82%。 海南省食品檢驗檢測中心（單位2）驗證結果（表10）表明，芒果苷的平均回收率為91.17% ~104.54%，RSD范圍為0.35% ~ 0.74%。 海南省動物疫病預防控制中心（單位3）驗證結果（表11）表明，芒果苷的平均回收率為99.40% ~104.40%，RSD范圍為5.40% ~ 7.69%。 中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所（單位4）驗證結果（表12）表明，芒果苷的平均回收率為97.00% ~100.10%，RSD范圍為1.38% ~ 4.75%。 中國熱帶農業(yè)科學院分析測試中心（單位5）驗證結果（表12）表明，芒果苷的平均回收率為85.10% ~98.10%，RSD范圍為7.31% ~ 9.74%。 表9 方法的回收率 驗證單位 1 驗證日期 2019-04-23 樣品 添加水平（mg/g） 重復 測定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對標準偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質 （本底） 1 20.04 19.99 - - - 2 19.71 - 3 20.60 - 4 19.54 - 5 20.14 - 6 20.23 - 7 20.33 - 8 19.47 - 9 19.72 - 10 20.13 - 芒果葉 2.50 1 22.44 22.63 97.68 105.32 7.82 2 22.73 109.04 3 22.40 96.11 4 22.79 111.64 5 22.92 116.68 6 22.59 103.46 7 22.43 97.37 8 22.92 116.70 9 22.41 96.38 10 22.70 108.16 芒果葉 5.00 1 24.60 25.02 91.91 100.43 7.30 2 24.82 96.48 3 25.29 105.90 4 24.55 90.96 5 25.50 110.04 6 25.22 104.47 7 25.06 103.13 8 25.38 107.69 9 24.52 90.50 10 25.16 103.27 芒果葉 7.50 1 27.89 28.09 105.20 107.84 2.25 2 27.96 106.14 3 28.26 110.19 4 27.96 106.13 5 28.36 111.49 6 28.34 111.13 7 27.94 105.93 8 28.08 107.72 9 28.17 108.99 10 27.91 105.44 表10 方法的回收率 驗證單位 2 驗證日期 2019-05-13 樣品 添加水平（mg/g） 重復 測定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對標準偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質 （本底） 1 20.75 20.72 - - - 2 20.72 - 3 20.32 - 4 20.75 - 5 20.40 - 6 20.68 - 7 20.68 - 8 20.82 - 9 20.80 - 10 21.22 - 芒果葉 2.50 1 22.95 23.00 89.40 91.20 0.71 2 22.98 90.40 3 22.92 88.40 4 22.82 84.40 5 22.98 90.40 6 23.18 98.40 7 23.30 103.40 8 23.15 97.40 9 22.78 82.40 10 22.90 87.40 芒果葉 5.00 1 25.95 25.94 104.69 104.54 0.74 2 25.75 100.69 3 25.80 101.69 4 26.20 109.69 5 25.68 99.19 6 25.92 104.19 7 25.80 101.69 8 26.02 106.19 9 26.05 106.69 10 26.25 110.69 芒果葉 7.50 1 28.18 28.00 99.47 97.17 0.35 2 27.85 95.13 3 28.00 97.13 4 27.98 96.80 5 28.02 97.47 6 28.00 97.13 7 28.08 98.13 8 27.90 95.80 9 28.10 98.47 10 27.92 96.13 表11 方法的回收率 驗證單位 3 驗證日期 2019-04-17 樣品 添加水平（mg/g） 重復 測定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對標準偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質 （本底） 1 21.25 21.165 - - - 2 21.10 - 3 21.10 - 4 21.28 - 5 21.10 - 芒果葉 2.50 1 23.58 23.65 96.40 99.40 7.69 2 23.80 105.40 3 23.90 109.40 4 23.53 94.40 5 23.45 91.40 芒果葉 5.00 1 26.55 26.385 107.70 104.40 7.08 2 26.38 104.20 3 25.75 91.70 4 26.63 109.20 5 26.63 109.20 芒果葉 7.50 1 29.00 28.88 104.47 102.87 5.40 2 29.30 108.47 3 29.20 107.13 4 28.33 95.47 5 28.58 98.80 表12 方法的回收率 驗證單位 4 驗證日期 2019-04-28 樣品 添加水平（mg/g） 重復 測定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對標準偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質 （本底） 1 21.38 21.44 - - - 2 21.65 - 3 21.65 - 4 21.28 - 5 21.28 - 6 21.40 - 7 21.55 - 8 21.45 - 9 21.72 - 10 21.62 - 芒果葉 2.50 1 23.92 23.83 99.20 97.00 4.75 2 23.80 94.20 3 23.95 100.20 4 23.68 89.20 5 23.80 94.20 6 23.75 92.20 7 24.02 103.20 8 23.88 97.20 9 23.92 99.20 10 23.98 101.20 芒果葉 5.00 1 26.55 26.49 102.10 100.10 2.34 2 26.45 100.10 3 26.38 98.60 4 26.58 102.60 5 26.50 101.10 6 26.32 97.60 7 26.42 99.60 8 26.48 100.60 9 26.60 103.10 10 26.22 95.60 芒果葉 7.50 1 28.62 28.84 95.73 98.97 1.38 2 28.88 99.07 3 28.85 98.73 4 28.82 98.40 5 29.00 100.73 6 28.90 99.40 7 28.90 99.40 8 28.90 99.40 9 28.98 100.40 10 28.82 98.40 表13 方法的回收率 驗證單位 5 驗證日期 2019-04-28 樣品 添加水平（mg/g） 重復 測定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對標準偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質 （本底） 1 20.48 20.80 - - - 2 20.63 - 3 20.60 - 4 20.98 - 5 21.13 - 6 20.63 - 7 20.75 - 8 20.63 - 9 21.18 - 10 21.05 - 芒果葉 2.50 1 22.88 23.25 83.00 98.10 9.74 2 23.23 97.00 3 2