《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》編制說(shuō)明

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《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明 1任務(wù)來(lái)源 1 2起草的目的意義 1 2.1企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要 1 2.2完善國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的需要 2 3芒果苷研究、應(yīng)用與標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀 2 3.1芒果苷研究 2 3.2芒果苷開(kāi)發(fā)應(yīng)用 2 3.3芒果苷標(biāo)準(zhǔn) 2 4主要起草過(guò)程 3 4.1成立標(biāo)準(zhǔn)制定工作組 3 4.2確定工作計(jì)劃和標(biāo)準(zhǔn)制定原則 3 4.3查詢(xún)國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料 3 4.4 研究建立標(biāo)準(zhǔn)方法，開(kāi)展條件實(shí)驗(yàn) 4 4.5方法驗(yàn)證 6 4.6形成標(biāo)準(zhǔn)討論稿和編制說(shuō)明 6 4.7形成標(biāo)準(zhǔn)草案 6 4.8形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明 7 4.9征求意見(jiàn)并形成標(biāo)準(zhǔn)送審稿和編制說(shuō)明 7 5 本標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)內(nèi)外分析方法的關(guān)系 7 6 主要技術(shù)指標(biāo)依據(jù)與說(shuō)明 8 6.1標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng) 8 6.2前言 8 6.3主體內(nèi)容 8 6.4“范圍”的界定 8 6.5原理 8 6.6試劑 8 6.7儀器和設(shè)備 9 6.8芒果葉樣品制備 10 6.9樣品中芒果苷的提取 10 6.9.1 提取溶劑比例 10 6.9.2超聲時(shí)間 11 6.9.3 提取溶劑體積 11 6.9.4 提取次數(shù) 12 6.10 芒果苷HPLC定量分析方法的建立 13 6.10.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 13 6.10.2 色譜柱的選擇 15 6.10.3不同洗脫條件 15 6.10.3.1等度洗脫 15 6.10.3.2梯度洗脫 16 6.10.4芒果苷HPLC法檢測(cè)優(yōu)化后的色譜條件 17 6.10.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 18 6.10.6 檢出限和定量限 18 6.10.7 精密度 19 6.10.8 穩(wěn)定性 19 6.10.9 重復(fù)性 20 6.10.10方法的準(zhǔn)確度 20 6.10.11小結(jié) 22 6.11 方法驗(yàn)證 22 6.11.1 參加驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室 22 6.11.2 方法驗(yàn)證結(jié)果 22 6.12實(shí)際樣品檢測(cè) 28 6.13驗(yàn)證結(jié)論 29 7采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)程度，以及與國(guó)際、國(guó)外同類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比情況 31 8與現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 31 9標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的意見(jiàn) 31 10實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的建議 31 11參考文獻(xiàn) 31 II 1任務(wù)來(lái)源 本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)是根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)下達(dá)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》項(xiàng)目（計(jì)劃號(hào)20193347-T-424）起草。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃《芒果葉中芒果苷的測(cè)定 高效液相色譜法》由424-cnis（中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院）歸口上報(bào)及執(zhí)行，主管部門(mén)為國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局(質(zhì)檢)。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心和中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院共同起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陽(yáng)辛鳳，蘭韜，席興軍，韓丙軍，趙方方，張?jiān)拢鶗越?，王盼，唐濤? 2起草的目的意義 芒果樹(shù)（Mangifera indica L.）屬于漆樹(shù)科植物，其葉片芒果葉為廣西等地方習(xí)用藥材, 收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》 1990年版。芒果葉及芒果葉提取物等制品的主要活性成分為芒果苷(Mangiferin，CAS 4773-96-0)，此外，芒果苷是百合科植物知母根莖、龍膽科植物藏茵陳等中藥材的主要活性成分。藥理研究表明, 芒果苷具有多種藥理活性, 如鎮(zhèn)咳、殺菌、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、降血脂等。芒果苷為2015年版中國(guó)藥典規(guī)定的知母等中藥材鑒別和質(zhì)量控制的重要檢測(cè)指標(biāo)。對(duì)于芒果葉及芒果葉提取物等加工產(chǎn)品，芒果苷含量水平是重要的質(zhì)量指標(biāo)。 2.1企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要 目前，市面上含有芒果苷的藥品有芒果止咳片（廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠(chǎng)、廣西桂西制藥有限公司）、銀花芒果片（廣西南珠制藥有限公司）、銀花芒果膠囊（廣西寶瑞坦制藥有限公司）等。 我國(guó)海南、廣西、云南、四川等省均有產(chǎn)業(yè)化的芒果栽培（例如2017年海南省芒果面積達(dá)到38萬(wàn)畝，產(chǎn)值3個(gè)億），每年產(chǎn)生大量的芒果葉廢棄物。同時(shí)，以芒果葉為原料生產(chǎn)芒果葉提取物/干浸膏和復(fù)方藥品的規(guī)模不斷擴(kuò)大。但是，芒果苷含量測(cè)定尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn), 且對(duì)芒果苷原料藥的提取工藝不同, 導(dǎo)致原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一, 藥品臨床療效不穩(wěn)定。因此，本標(biāo)準(zhǔn)的制定是企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制的需要。 2.2完善國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的需要 我國(guó)現(xiàn)行檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)中，尚無(wú)芒果苷檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。為了貫徹落實(shí)《國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于促進(jìn)熱帶作物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見(jiàn)》（國(guó)辦發(fā)[2010]45號(hào)）文件精神，科學(xué)指導(dǎo)芒果葉生產(chǎn)、加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，急需制定《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，建立芒果葉中芒果苷含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為芒果苷原料藥的質(zhì)量控制提供方法，為芒果苷產(chǎn)品研發(fā)及芒果葉綜合開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，進(jìn)而引導(dǎo)生產(chǎn)，規(guī)范市場(chǎng)。所以，本標(biāo)準(zhǔn)的制定也是完善芒果葉等中藥材及其加工產(chǎn)品檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的需要。 3芒果苷研究、應(yīng)用與標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀 3.1芒果苷研究 國(guó)內(nèi)外對(duì)芒果苷的研究十分廣泛，可查詢(xún)到大量的論文與專(zhuān)利，研究范圍包括提取分離、純品制備、分析檢測(cè)、結(jié)構(gòu)表征、藥理活性、毒性、分子結(jié)構(gòu)改性、產(chǎn)品加工等方面。 3.2芒果苷開(kāi)發(fā)應(yīng)用 以芒果苷為活性成分的加工產(chǎn)品有芒果葉提取物、干浸膏、復(fù)方中成藥等。成都德思特生物技術(shù)有限公司、四川省維克奇生物科技有限公司、成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司、陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司、青島捷世康生物科技有限公司等眾多公司均生產(chǎn)芒果葉提取物、芒果葉干浸膏、高純芒果苷。 廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠(chǎng)、廣西桂西制藥有限公司、廣西南珠制藥有限公司、廣西寶瑞坦制藥有限公司生產(chǎn)含有芒果葉干浸膏的復(fù)方藥品，例如芒果止咳片、銀花芒果片、銀花芒果膠囊，均為國(guó)藥準(zhǔn)字藥品。 總的說(shuō)來(lái)，芒果苷的開(kāi)發(fā)利用尚處于初級(jí)發(fā)展階段，雖然有干浸膏、復(fù)方中成藥等幾種類(lèi)型的產(chǎn)品，但還沒(méi)有形成規(guī)?；?。 3.3芒果苷標(biāo)準(zhǔn) 可查詢(xún)到已廢止的芒果苷地方標(biāo)準(zhǔn)一項(xiàng)，地方標(biāo)準(zhǔn)《芒果苷》（DB45/T 512-2008，已廢止），該標(biāo)準(zhǔn)由廣西中醫(yī)學(xué)院歸口上報(bào)，主管部門(mén)為廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，主要起草單位為廣西中醫(yī)學(xué)院，公布日期2008-07-28，實(shí)施日期2008-08-28。此外，未查到與芒果苷相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。芒果苷分析方法標(biāo)準(zhǔn)的缺失，使得相關(guān)企業(yè)在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中無(wú)標(biāo)準(zhǔn)可用，相關(guān)產(chǎn)品缺乏技術(shù)支撐，質(zhì)量參差不齊。 因此，有必要盡快制定《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，以滿(mǎn)足相關(guān)企業(yè)和檢測(cè)、管理結(jié)構(gòu)的需要。 4主要起草過(guò)程 4.1成立標(biāo)準(zhǔn)制定工作組 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目立項(xiàng)后，2017年11月10日在北京市西藏大廈召開(kāi)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》第一次工作會(huì)。參加單位有中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院等。會(huì)議成立了由國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院等單位參加的標(biāo)準(zhǔn)工作組，主要由從事標(biāo)準(zhǔn)制修訂、儀器分析、具有豐富技術(shù)經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)研究人員組成，工作組制定了初步的標(biāo)準(zhǔn)編制工作計(jì)劃。 4.2確定工作計(jì)劃和標(biāo)準(zhǔn)制定原則 按照工作任務(wù)要求，工作組制定了標(biāo)準(zhǔn)起草工作計(jì)劃和任務(wù)分工。 在充分研究與討論的基礎(chǔ)上，制定了標(biāo)準(zhǔn)制定原則： （1）先進(jìn)性：其準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度達(dá)到較高水平。 （2）適用性：要適應(yīng)我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求，滿(mǎn)足中藥現(xiàn)代化的需要。 （3）可操作性：符合我國(guó)目前檢測(cè)儀器設(shè)備和試劑、材料的供應(yīng)條件。 （4）實(shí)用性：符合檢測(cè)從業(yè)人員的技術(shù)水平，能被國(guó)內(nèi)主要的環(huán)境分析實(shí)驗(yàn)室所使用并達(dá)到所規(guī)定的要求。要有利于提高芒果葉及其制品質(zhì)量，為中藥質(zhì)量控制部門(mén)、有關(guān)企業(yè)和三農(nóng)服務(wù)。 4.3查詢(xún)國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料 2017年，開(kāi)始開(kāi)展“芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法”方法研究。由于在現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，均無(wú)相應(yīng)的測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)，所以我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)并開(kāi)展研究工作。分析芒果苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，芒果苷具有雙苯吡酮結(jié)構(gòu)，在258nm、317nm、368nm具有特征吸收?！吨袊?guó)藥典》2015年版中，有“知母”條目，芒果苷為知母鑒別和質(zhì)量控制的重要檢測(cè)指標(biāo)，知母中芒果苷的含量測(cè)定時(shí)采用液相色譜法。該方法的要點(diǎn)有：（1）以稀乙醇為芒果苷提取溶劑，（2）通過(guò)超聲進(jìn)行輔助提取，（3）采用C18色譜柱，（4）檢測(cè)波長(zhǎng)258nm，（5）流動(dòng)相為乙腈-0.2%冰醋酸水溶液（15 : 85)。 中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方等中文數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)到的公開(kāi)發(fā)表文獻(xiàn)中，關(guān)于芒果葉中芒果苷的測(cè)定幾乎都是依據(jù)或參考《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定的方法。通過(guò)對(duì)SpringerLink、Elsevier ScienceDirect(SD)、Wiley等國(guó)外數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到少量以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)芒果苷進(jìn)行檢測(cè)。 液相色譜法檢測(cè)芒果苷具有準(zhǔn)確度好、精密度高、檢出限與定量限低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，考慮到標(biāo)準(zhǔn)的適用性與可操作性，因此確定采用液相色譜法檢測(cè)樣品中芒果苷。借鑒《中國(guó)藥典》2015年版知母中芒果苷含量測(cè)定的方法，以芒果葉為樣品，經(jīng)過(guò)初步試驗(yàn)，證明方法是可行的。而后對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確性、回收率、精密度等方面都能達(dá)到國(guó)家可標(biāo)準(zhǔn)的要求，并且基本符合制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的條件，并于2018年向國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)提出立項(xiàng)申請(qǐng)。 4.4 研究建立標(biāo)準(zhǔn)方法，開(kāi)展條件實(shí)驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)工作組按照計(jì)劃任務(wù)書(shū)的要求，結(jié)合制定標(biāo)準(zhǔn)的要求，研究建立標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)驗(yàn)方案，并進(jìn)行方法前處理?xiàng)l件的選擇、儀器條件的確定和方法精密度、準(zhǔn)確度及檢出限的測(cè)定等試驗(yàn)。 2017年11月始，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組赴海南省東方市、三亞市等芒果主產(chǎn)地進(jìn)行調(diào)研，獲取了大量相關(guān)信息與數(shù)據(jù)。2017年11月27日從東方廣壩農(nóng)場(chǎng)采集了24份芒果葉樣品（表1），其中臺(tái)農(nóng)、貴妃、金煌葉片各8份。2019年2月27日從三亞閩新農(nóng)場(chǎng)等采集芒果也樣品20份（表2），其中臺(tái)農(nóng)、貴妃、金煌、象牙葉片各5份 表1 芒果葉樣品列表（1） 序號(hào) 品種 樣品編號(hào) 采樣地點(diǎn) 采樣時(shí)間 1 臺(tái)農(nóng) TN20171123-1 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 2 臺(tái)農(nóng) TN20171123-2 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 3 臺(tái)農(nóng) TN20171123-3 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 4 臺(tái)農(nóng) TN20171123-4 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 5 臺(tái)農(nóng) TN20171123-5 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 6 臺(tái)農(nóng) TN20171123-6 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 7 臺(tái)農(nóng) TN20171123-7 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 8 臺(tái)農(nóng) TN20171123-8 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 9 金煌 JH20171123-1 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 10 金煌 JH20171123-2 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 11 金煌 JH20171123-3 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 12 金煌 JH20171123-4 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 13 金煌 JH20171123-5 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 14 金煌 JH20171123-6 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 15 金煌 JH20171123-7 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 16 金煌 JH20171123-8 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 17 貴妃 GF20171123-1 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 18 貴妃 GF20171123-2 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 19 貴妃 GF20171123-3 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 20 貴妃 GF20171123-4 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 21 貴妃 GF20171123-5 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 22 貴妃 GF20171123-6 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 23 貴妃 GF20171123-7 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 24 貴妃 GF20171123-8 東方廣壩農(nóng)場(chǎng) 2017.11.27 表2 芒果葉樣品列表（2） 序號(hào) 品種 樣品編號(hào) 采樣地點(diǎn) 采樣時(shí)間 1 象牙 2019-01 三亞北嶺村大矛小組 2019.2.27 2 象牙 2019-02 三亞北嶺村大矛小組 2019.2.27 3 象牙 2019-03 三亞北嶺村大哺叭小組 2019.2.27 4 象牙 2019-04 三亞閩新農(nóng)場(chǎng) 2019.2.27 5 象牙 2019-05 三亞閩新農(nóng)場(chǎng) 2019.2.27 6 金煌 2019-06 三亞北嶺村大矛小組 2019.2.27 7 金煌 2019-07 三亞北嶺村大矛小組 2019.2.27 8 金煌 2019-08 三亞北嶺村壩后小組 2019.2.27 9 金煌 2019-09 三亞南濱居南雅六隊(duì) 2019.2.27 10 金煌 2019-10 三亞南濱居閩新農(nóng)場(chǎng) 2019.2.27 11 貴妃 2019-11 三亞北嶺村壩后小組 2019.2.27 12 貴妃 2019-12 三亞南濱居南雅六隊(duì) 2019.2.27 13 貴妃 2019-13 三亞南濱居雙聯(lián)農(nóng)場(chǎng) 2019.2.27 14 貴妃 2019-14 三亞三公里鹿角園 2019.2.27 15 貴妃 2019-15 三亞海棠村山地 2019.2.27 16 臺(tái)農(nóng) 2019-16 三亞南濱居雙聯(lián)農(nóng)場(chǎng) 2019.2.27 17 臺(tái)農(nóng) 2019-17 三亞三公里山地 2019.2.27 18 臺(tái)農(nóng) 2019-18 三亞三公里山地 2019.2.27 19 臺(tái)農(nóng) 2019-19 三亞三公里鹿角園 2019.2.27 20 臺(tái)農(nóng) 2019-20 三亞三公里鹿角園 2019.2.27 第一批樣品采集后，開(kāi)始開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證工作，建立芒果苷高效液相色譜分析方法，包括線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、加標(biāo)回收率、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限等；樣品中芒果苷提取條件的摸索與優(yōu)化，如提取溶劑種類(lèi)、提取溶劑體積、超聲提取時(shí)間等。 4.5方法驗(yàn)證 2019年4～5月，由5家單位對(duì)“芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法”進(jìn)行驗(yàn)證，分別是海南大學(xué)分析測(cè)試中心、海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心、海南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，通過(guò)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)技術(shù)確認(rèn)外部實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 4.6形成標(biāo)準(zhǔn)討論稿和編制說(shuō)明 2019年7月5日，起草工作組組織相關(guān)單位和專(zhuān)家，在山東青島中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所召開(kāi)第二次標(biāo)準(zhǔn)起草工作會(huì)。參會(huì)單位包括中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所、北京化工大學(xué)、浙江大學(xué)等。 與會(huì)專(zhuān)家對(duì)《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)草案中的英文名稱(chēng)、范圍、術(shù)語(yǔ)和定義、基本要求、主要技術(shù)指標(biāo)、附錄等章條提出了詳細(xì)的意見(jiàn)，會(huì)后根據(jù)修改意見(jiàn)形成了《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)討論稿及其編制說(shuō)明。 4.7形成標(biāo)準(zhǔn)草案 標(biāo)準(zhǔn)起草工作組查閱、收集和整理了國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究進(jìn)展和專(zhuān)利、標(biāo)準(zhǔn)、法規(guī)等文獻(xiàn)資料，掌握了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)狀；對(duì)文獻(xiàn)中芒果苷測(cè)定方法進(jìn)行了對(duì)比和總結(jié)，為標(biāo)準(zhǔn)文本的編制奠定理論基礎(chǔ)。在《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一次起草工作會(huì)議的基礎(chǔ)上，起草工作組相關(guān)單位共同討論起草形成了《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)框架和主要內(nèi)容，初步形成了《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)草案。 4.8形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明 在前期工作的基礎(chǔ)上，起草工作組組織相關(guān)單位和專(zhuān)家于2019年10月22日在北京中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院召開(kāi)第三次標(biāo)準(zhǔn)起草工作會(huì)。參會(huì)單位包括中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、北京化工大學(xué)、浙江大學(xué)等。與會(huì)成員認(rèn)真討論《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)討論稿后，根據(jù)討論結(jié)果修改形成了《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》征求意見(jiàn)稿及編制說(shuō)明。會(huì)議同時(shí)討論了下一階段征求意見(jiàn)的單位和專(zhuān)家名單。 4.9征求意見(jiàn)并形成標(biāo)準(zhǔn)送審稿和編制說(shuō)明 2019年月日-2019年月日，起草工作組根據(jù)討論的專(zhuān)家和單位名單，分別向相關(guān)的行業(yè)主管部門(mén)、科研機(jī)構(gòu)、檢測(cè)部門(mén)和企業(yè)等30個(gè)單位和專(zhuān)家發(fā)出了標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿，向相關(guān)單位和專(zhuān)家征求標(biāo)準(zhǔn)修改意見(jiàn)。截止到2019年月日，共收集到農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南寧）、…等25家科研機(jī)構(gòu)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)、管理部門(mén)、生產(chǎn)企業(yè)等單位提出的反饋意見(jiàn)40條。起草工作組對(duì)提出的意見(jiàn)經(jīng)過(guò)反復(fù)研究、討論和處理后，修改形成了《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》送審稿及編制說(shuō)明。具體意見(jiàn)匯總和處理表見(jiàn)《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》征求意見(jiàn)稿及編制說(shuō)明。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)匯總處理表。 5 本標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)內(nèi)外分析方法的關(guān)系 本標(biāo)準(zhǔn)研究旨在建立一項(xiàng)滿(mǎn)足我國(guó)常用中草藥芒果葉中芒果苷含量檢測(cè)要求，在質(zhì)量控制目標(biāo)和技術(shù)手段上與國(guó)際接軌，適應(yīng)我國(guó)大部分中草藥質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和技術(shù)能力的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，制定條件優(yōu)化方案，確保本方法前處理所采用的裝置操作簡(jiǎn)便，能夠滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室的條件要求。本標(biāo)準(zhǔn)擬采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)分析方法（HPLC-UV）測(cè)定芒果苷。樣品的前處理，即芒果葉中芒果苷的提取采用超聲法，并對(duì)超聲時(shí)間、提取溶劑種類(lèi)、提取溶劑比例、提取次數(shù)等因素進(jìn)行優(yōu)化；檢測(cè)方法參考《中國(guó)藥典》2015年版關(guān)于知母藥材種芒果苷的檢測(cè)方法及其他文獻(xiàn)資料，選擇合適的色譜柱以及儀器條件。力求方法在穩(wěn)定、可靠和實(shí)用的基礎(chǔ)上，達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，以適應(yīng)我國(guó)中草藥芒果葉中芒果苷含量檢測(cè)、質(zhì)控與管理的需要。 6主要技術(shù)指標(biāo)依據(jù)與說(shuō)明 6.1標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng) 本標(biāo)準(zhǔn)主要解決芒果葉中芒果苷測(cè)定的技術(shù)問(wèn)題，所以將本標(biāo)準(zhǔn)的名稱(chēng)定為：《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》。本標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)中芒果一詞的英文，根據(jù)芒果的拉丁文名稱(chēng)、相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的翻譯方式、行業(yè)內(nèi)的通行用法確定為“Mangifera indica L.”。因此將本標(biāo)準(zhǔn)的全稱(chēng)《芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定 高效液相色譜法》翻譯為“Determination of mangiferin in mango (Mangifera indica L.) leaves – high-performance liquid chromatorgraphy”。 6.2前言 明確了本標(biāo)準(zhǔn)的歸口單位及主要起草單位、起草人。 6.3主體內(nèi)容 標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容包括：范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器和設(shè)備、測(cè)定步驟、空白試驗(yàn)、結(jié)果計(jì)算與表示、精密度和回收率、檢出限、檢驗(yàn)報(bào)告等。 6.4“范圍”的界定 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定芒果葉中芒果苷含量的原理、材料、儀器與設(shè)備、測(cè)定步驟、結(jié)果計(jì)算與表示、精密度和回收率、檢驗(yàn)報(bào)告。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于芒果葉中芒果苷含量的測(cè)定。 6.5原理 樣品經(jīng)提取后，將提取液過(guò)濾，經(jīng)反向高效液相色譜分離測(cè)定，在258nm下檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積定量。 6.6試劑 6.6.1 甲醇（CH4O）：色譜純。 6.6.2 乙腈（C2H3N）：色譜純。 6.6.3 冰醋酸（CH4O2）：優(yōu)級(jí)純，含量≥98.8%。 6.6.4 甲醇溶液（50%）：甲醇與超純水按照1:1體積比混合。 6.6.5 冰醋酸溶液（0.2%）：1 L超純水中加入2 mL冰醋酸。 6.6.6 芒果苷（C19H18O11，CAS : 4773-96-0）標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%。 6.6.7 有機(jī)濾模：孔徑0.22μm。 6.6.8 流動(dòng)相：乙腈（4.2）：冰醋酸溶液（4.5）=15:85（體積比），冰醋酸溶液使用前經(jīng)濾膜過(guò)濾。 6.6.9 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（200 μg/mL）：稱(chēng)取10 mg（精確至0.10mg）芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品（4.6），置于50 mL容量瓶中（5.8），加甲醇（4.1）超聲溶解并定容至刻度線(xiàn)，混勻，配制成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，–18℃冰箱避光保存，有效期3個(gè)月。 6.6.10 芒果苷中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取5mL芒果苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（4.9）于10mL容量瓶（5.8）中，用50%甲醇溶液（4.4）稀釋至定容刻度線(xiàn)，搖勻，得到芒果苷中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度100 μg/mL）。 6.6.11 芒果苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確移取0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL芒果苷中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.10）于不同的10mL容量瓶（5.8）中，用50%甲醇溶液（4.4）稀釋、定容刻度線(xiàn)，搖勻，得到芒果苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度分別為1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL）。 6.6.12 除另外有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水應(yīng)復(fù)合GB/T6682中一級(jí)水的要求。 6.7儀器和設(shè)備 6.7.1 液相色譜儀：配紫外（UV）檢測(cè)器或PDA檢測(cè)器。 6.7.2 超聲波振蕩器：功率不低于250 W，或相當(dāng)?shù)脑O(shè)備。 6.7.3分析天平：根據(jù)方法準(zhǔn)確度的要求，芒果苷對(duì)照品的稱(chēng)樣量需精確到0.1 mg，因此使用感量為0.1 mg的分析天平 6.7.3 電子天平：感量0.1 mg。 6.7.4 組織搗碎機(jī) 6.7.5渦旋振蕩器 6.10色譜柱：C18 液相色譜柱（250mm4.6mm，5μm）或其他等效色譜柱。 6.7.6針式微孔濾器：0.22 μm，直徑13 mm的聚四氟乙烯（PTFE）濾膜或者相當(dāng)者。 6.7.7 離心管：100 mL（螺旋蓋）。 6.7.8 容量瓶：10 mL，50 mL，100 mL 6.7.9三角瓶：250 mL（磨口塞）。 6.8芒果葉樣品制備 新鮮芒果樹(shù)葉片，切碎，放入打漿機(jī)中打碎，裝入樣品瓶中，密封，于-20℃保存。 6.9樣品中芒果苷的提取 6.9.1 提取溶劑比例 稱(chēng)取芒果葉樣品1.00g(精確至0.01g) 于100 mL離心管中。配置不同體積比的甲醇/水混合溶液（100/0、70/30、50/50、30/70）作為提取溶劑。離心管中加入提取溶劑50mL，高速勻漿1 min，將樣品全部轉(zhuǎn)移到250 mL具塞磨口三角瓶中。分別用40mL、30mL提取劑洗滌離心管和刀頭共2次，溶液合并至三角瓶中。將三角瓶瓶塞蓋上，放入超聲清洗儀中，室溫下超聲提取30 min。取出，靜置20min。將上清轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，樣品殘?jiān)粼谌瞧恐?。三角瓶中加入提取溶?00mL，超聲30 min，進(jìn)行二次提取。容量瓶上放置漏斗，放入脫脂棉，將樣品提取液過(guò)濾，濾液合并至250mL容量瓶，用少量提取溶劑洗滌三角瓶?jī)?nèi)壁與漏斗內(nèi)壁共3次，洗滌液合并至250mL容量瓶，用提取溶劑定容至250mL，搖勻，得到芒果葉樣品提取液。用1.0 mL刻度玻璃移液管，吸取樣品提取液1.0mL，放入100mL容量瓶中，用提取溶劑定容，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾至樣品瓶,供液相色譜分析。 不同配比的甲醇/水提取溶劑對(duì)芒果苷提取率的影響，結(jié)果如圖1 所示。當(dāng)提取溶劑中甲醇/水比例為70/30（v/v）時(shí)，芒果苷提取率最高。 圖1 提取溶劑對(duì)芒果苷提取率的影響 6.9.2超聲時(shí)間 稱(chēng)取芒果葉樣品1.00g，放入250mL具塞錐形瓶中，以 70/30的甲醇/水混合溶液為提取溶劑，按照3.3.1進(jìn)行芒果苷提取，其中超聲提取時(shí)間分別采用10、20、30、40、50、60min。 不同的超聲時(shí)間對(duì)芒果苷提取率的影響，結(jié)果如圖2 所示。當(dāng)超聲時(shí)間為30min的甲醇/水溶液時(shí)，芒果苷提取率最高。 圖2 超聲時(shí)間對(duì)芒果苷提取率的影響 6.9.3 提取溶劑體積 稱(chēng)取芒果葉樣品1.00g，放入250mL具塞錐形瓶中，以 70/30的甲醇/水混合溶液為提取溶劑，超聲時(shí)間為30min，按照3.3.1進(jìn)行芒果苷提取，其中提取溶劑體積分別采用150、180、220、250 mL。 不同的提取溶劑對(duì)芒果苷提取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)提取溶劑為220mL時(shí)，芒果苷提取率最高。 圖3 提取溶劑體積對(duì)芒果苷提取率的影響 6.9.4 提取次數(shù) 稱(chēng)取芒果葉樣品1.00g，放入250mL具塞錐形瓶中，以體積比 70/30的甲醇/水混合溶液為提取溶劑，超聲時(shí)間為30min，提取溶劑總體積220mL，按照3.3.1進(jìn)行芒果苷提取，其中提取次數(shù)分別采用1、2、3次。 提取1次的操作方法為：芒果葉樣品1.00g(精確至0.01g) ，加入體積比70/30的甲醇/水提取溶劑50mL，高速勻漿1 min，將樣品全部轉(zhuǎn)移到250 mL具塞磨口三角瓶中。分別用40mL、30mL提取劑洗滌離心管和刀頭共2次，溶液合并至三角瓶中，再加入100 mL, 提取溶劑，將三角瓶瓶塞蓋上，放入超聲清洗儀中，室溫下超聲提取30 min。 提取2次的操作方法按照3.3.1。 提取3次的操作方法為：芒果葉樣品1.00g(精確至0.01g) ，加入體積比70/30的甲醇/水提取溶劑50mL，高速勻漿1 min，將樣品全部轉(zhuǎn)移到150 mL具塞磨口三角瓶中。分別用40mL、30mL提取劑洗滌離心管和刀頭共2次，溶液合并至三角瓶中。將三角瓶瓶塞蓋上，放入超聲清洗儀中，室溫下超聲提取30 min。取出，靜置20min。將上清轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，樣品殘?jiān)粼谌瞧恐?。三角瓶中加入提取溶?0mL，超聲30 min，進(jìn)行二次提取，過(guò)濾。濾渣中加入提取溶劑50mL，超聲30 min，進(jìn)行三次提取，過(guò)濾。合并濾液。 不同的提取次數(shù)對(duì)芒果苷提取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，芒果苷提取率最高。 6.10 芒果苷HPLC定量分析方法的建立 6.10.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 為了了解芒果苷標(biāo)樣在全波長(zhǎng)下主成分與雜質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度，采用HPLC法以PDA檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（200～400nm），結(jié)果如圖5。全掃描結(jié)果表明，芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品在258nm 、317nm 、368nm有吸收峰，強(qiáng)度高。 a b 圖5 芒果苷HPLC 3D掃描圖 a 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)樣品，b 溶劑空白 芒果苷最大紫外吸收波長(zhǎng)為258nm，為了了解芒果苷標(biāo)樣在不同波長(zhǎng)下主成分與雜質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度，采用HPLC法分別在258nm 、317nm 、368nm進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6。三種波長(zhǎng)下，258nm時(shí)芒果苷響應(yīng)最強(qiáng)，317nm時(shí)次之，368nm時(shí)最弱。在《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》方法（國(guó)家藥典委員會(huì)2015）及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，多采用258nm作為芒果苷檢測(cè)波長(zhǎng)。綜合以上信息，選擇258nm作為本項(xiàng)目芒果苷HPLC測(cè)定的波長(zhǎng)。 258nm 317nm 368nm 圖6 芒果苷不同波長(zhǎng)的色譜圖 6.10.2 色譜柱的選擇 對(duì)照了2款不同的色譜柱，包括Waters Xbridge BEH C18液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）以及Agilent ZORBAX SB-Aq液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）發(fā)現(xiàn)在相同條件下，2種色譜柱均能使主成分與雜質(zhì)有效分離，與主峰保留時(shí)間最接近的雜質(zhì)的分離度也在2.0以上。但是使用C18柱時(shí)主成分響應(yīng)更高，因此選擇采用C18液相色譜柱。 a b 圖16 芒果苷在不同的色譜柱分離結(jié)果 a, Waters Xbridge BEH C18液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）; b, 10ppm, Agilent 圖7 芒果苷在不同色譜柱分離色譜圖 a，Waters Xbridge BEH C18液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）；b，Agilent ZORBAX SB-Aq液相色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm） 6.10.3不同洗脫條件 6.10.3.1等度洗脫 儀器條件為：Waters 液相色譜儀，UV檢測(cè)器，Waters Xbridge BEH C18色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）,波長(zhǎng)258nm，流量1mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫25 ℃。 等度洗脫方式為流動(dòng)相A（0.1%甲酸-水溶液）/流動(dòng)相B（乙腈）=85/15（v/v）。 a 芒果苷 a b 溶劑空白 圖3 等度洗脫模式 6.10.3.2梯度洗脫 梯度洗脫模式如表1所示，結(jié)果如圖8。 表3 芒果苷梯度洗脫模式 時(shí)間/min 0.1%甲酸-水/% 乙腈/% 90 10 2 90 10 5 80 20 7 80 20 10 20 80 12 20 80 14 90 10 15 90 10 a 芒果苷 b 溶劑空白 圖8 梯度洗脫模式 6.10.4芒果苷HPLC法檢測(cè)優(yōu)化后的色譜條件 芒果苷HPLC法檢測(cè)優(yōu)化后的色譜條件為： Waters 1525高效液相色譜儀，配置紫外檢測(cè)器； 色譜柱：Waters Xbridge BEH C18色譜柱（250mm*4.6mm, 5 μm）； 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：258nm； 流動(dòng)相：0.1%甲酸-水溶液/乙腈=85/15（v/v），流量1mL/min； 進(jìn)樣體積：10 μL； 柱溫：25 ℃。 在該優(yōu)化色譜條件下，對(duì)實(shí)際芒果葉樣品中芒果苷含量進(jìn)行測(cè)定，典型的液相色譜譜圖如圖 所示，可以看出芒果苷與雜質(zhì)分離很好。 a 樣品 b 溶劑空白 圖9 實(shí)際樣品HPLC譜圖 6.10.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 圖10 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以含量（x）為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y = 50600 x – 2930，線(xiàn)性關(guān)系良好。 線(xiàn)性范圍：0.01～ 5.0ug/mL 相關(guān)系數(shù) r = 0.9993 6.10.6 檢出限和定量限 將對(duì)照品溶液逐步稀釋?zhuān)M(jìn)行液相色譜分析，計(jì)算其峰高與基線(xiàn)噪音高的比，S/N=3（S為對(duì)照品峰高，N為基線(xiàn)噪音高）時(shí)的對(duì)照品濃度為檢出限（LOD），得到芒果苷的檢測(cè)限0.08 mg/g；S/N=10時(shí)的濃度為定量限（LOQ），得到芒果苷的定量限為0.25 mg/g。 6.10.7 精密度 取配制好的芒果苷對(duì)照品溶液，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，芒果苷對(duì)照品HPLC分析結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.89%，表明儀器精密度良好，該方法精密度符合要求。結(jié)果見(jiàn)表4。 表4 芒果苷精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 樣品號(hào) 芒果苷濃度ug/mL 平均值ug/mL RSD% 1 0.992 1.002 0.89 2 1.013 3 0.995 4 1.004 5 1.011 6 0.995 6.10.8 穩(wěn)定性 取同一供試品制備的供試品溶液在0、4、8、12、16、20時(shí)，各進(jìn)樣一次，按照上述色譜條件測(cè)定，記錄芒果苷的峰面積，算得RSD=3.12%，表明供試品溶液在20h內(nèi)穩(wěn)定性較好。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。 表5 芒果苷穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 進(jìn)樣時(shí)間h 芒果苷濃度mg/g 平均值mg/g RSD% 0 22.59 22.64 3.12 4 23.06 8 22.98 12 23.14 16 21.29 20 22.42 6.10.9 重復(fù)性 取同一樣品，共6 份，分別制備供試品溶液，按照“3.4.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，并計(jì)算芒果苷濃度。結(jié)果，樣品中芒果苷的平均濃度為22.64 mg/g，RSD為2.60％（n 均為6），表明本方法重復(fù)性良好。 表6 芒果苷重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 樣品號(hào) 芒果苷濃度mg/g 平均值mg/g RSD% 1 21.77 22.24 2.60 2 22.35 3 23.23 4 21.67 5 22.46 6 21.96 6.10.10方法的準(zhǔn)確度 芒果苷加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法加標(biāo)回收率良好，芒果苷的平均回收率為91.5%~94.8%，RSD范圍為2.36%~6.59%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度高。 表7 芒果苷加標(biāo)回收結(jié)果（n=5） 樣品 添加水平（mg/g） 重復(fù) 測(cè)定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0 0 - - - 基質(zhì) （本底） - 1 20.63 20.73 - - - 2 20.60 - 3 20.75 - 4 20.63 - 5 21.05 - 加標(biāo) 水平1 2.50 1 22.88 23.10 85.80 94.80 6.59 2 23.23 99.80 3 23.23 99.80 4 23.00 90.80 5 23.18 97.80 加標(biāo) 水平2 5.00 1 25.25 25.31 90.40 91.50 2.36 2 25.15 88.40 3 25.38 92.90 4 25.43 93.90 5 25.33 91.90 加標(biāo) 水平3 7.50 1 27.85 27.79 94.93 94.07 4.29 2 27.88 95.27 3 27.60 91.60 4 27.40 88.93 5 28.20 99.60 34 6.10.11小結(jié) 上述結(jié)果表明，高效液相色譜法測(cè)定芒果葉中芒果苷，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法檢出限為0.08 mg/g，定量限為0.25 mg/g。對(duì)芒果葉實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在91.50% ~ 94.80%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.36% ~ 6.59%，說(shuō)明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。 綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)方法能夠滿(mǎn)足芒果葉中芒果苷含量測(cè)定要求。 6.11 方法驗(yàn)證 6.11.1 參加驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室 選擇5 家具有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室參加方法的驗(yàn)證工作（表8）。向驗(yàn)證單位提供方法草案、驗(yàn)證方案、標(biāo)準(zhǔn)溶液和驗(yàn)證報(bào)告格式。驗(yàn)證單位按照方法草案準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)并反饋驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告。在方法驗(yàn)證前，參加驗(yàn)證的操作人員應(yīng)熟悉和掌握方法原理、操作步驟及流程。方法驗(yàn)證過(guò)程中所用的試劑和材料、儀器和設(shè)備及分析步驟應(yīng)符合方法相關(guān)要求。 表8 驗(yàn)證單位與儀器型號(hào) 序號(hào) 定值單位 HPLC/檢測(cè)器 色譜柱 1 海南大學(xué)分析測(cè)試中心 Waters e2695 / UV 資生堂Tech Mate C18 （250mm*4.6mm, 5 μm） 2 海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 Waters e2695 / DAD Waters Xbridge BEH C18（250mm*4.6mm, 5 μm） 3 海南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 Waters e2695 / DAD Waters XTerre MS C18（250mm*4.6mm, 5 μm） 4 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 Waters e2695 / DAD Athena C18 （250mm*4.6mm, 5 μm） 5 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心 Waters 1525 / UV Waters Xbridge BEH C18（250mm*4.6mm, 5 μm） 6.11.2 方法驗(yàn)證結(jié)果 5家實(shí)驗(yàn)室對(duì)芒果苷加標(biāo)量為2.50、5.00、7.50 mg/g的三個(gè)加標(biāo)水平的芒果葉樣品進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果列于表9~表13。 海南大學(xué)分析測(cè)試中心（單位1）驗(yàn)證結(jié)果（表9）表明，芒果苷的平均回收率為100.43% ~107.84%，RSD范圍為2.25% ~ 7.82%。 海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（單位2）驗(yàn)證結(jié)果（表10）表明，芒果苷的平均回收率為91.17% ~104.54%，RSD范圍為0.35% ~ 0.74%。 海南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（單位3）驗(yàn)證結(jié)果（表11）表明，芒果苷的平均回收率為99.40% ~104.40%，RSD范圍為5.40% ~ 7.69%。 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所（單位4）驗(yàn)證結(jié)果（表12）表明，芒果苷的平均回收率為97.00% ~100.10%，RSD范圍為1.38% ~ 4.75%。 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心（單位5）驗(yàn)證結(jié)果（表12）表明，芒果苷的平均回收率為85.10% ~98.10%，RSD范圍為7.31% ~ 9.74%。 表9 方法的回收率 驗(yàn)證單位 1 驗(yàn)證日期 2019-04-23 樣品 添加水平（mg/g） 重復(fù) 測(cè)定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質(zhì) （本底） 1 20.04 19.99 - - - 2 19.71 - 3 20.60 - 4 19.54 - 5 20.14 - 6 20.23 - 7 20.33 - 8 19.47 - 9 19.72 - 10 20.13 - 芒果葉 2.50 1 22.44 22.63 97.68 105.32 7.82 2 22.73 109.04 3 22.40 96.11 4 22.79 111.64 5 22.92 116.68 6 22.59 103.46 7 22.43 97.37 8 22.92 116.70 9 22.41 96.38 10 22.70 108.16 芒果葉 5.00 1 24.60 25.02 91.91 100.43 7.30 2 24.82 96.48 3 25.29 105.90 4 24.55 90.96 5 25.50 110.04 6 25.22 104.47 7 25.06 103.13 8 25.38 107.69 9 24.52 90.50 10 25.16 103.27 芒果葉 7.50 1 27.89 28.09 105.20 107.84 2.25 2 27.96 106.14 3 28.26 110.19 4 27.96 106.13 5 28.36 111.49 6 28.34 111.13 7 27.94 105.93 8 28.08 107.72 9 28.17 108.99 10 27.91 105.44 表10 方法的回收率 驗(yàn)證單位 2 驗(yàn)證日期 2019-05-13 樣品 添加水平（mg/g） 重復(fù) 測(cè)定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質(zhì) （本底） 1 20.75 20.72 - - - 2 20.72 - 3 20.32 - 4 20.75 - 5 20.40 - 6 20.68 - 7 20.68 - 8 20.82 - 9 20.80 - 10 21.22 - 芒果葉 2.50 1 22.95 23.00 89.40 91.20 0.71 2 22.98 90.40 3 22.92 88.40 4 22.82 84.40 5 22.98 90.40 6 23.18 98.40 7 23.30 103.40 8 23.15 97.40 9 22.78 82.40 10 22.90 87.40 芒果葉 5.00 1 25.95 25.94 104.69 104.54 0.74 2 25.75 100.69 3 25.80 101.69 4 26.20 109.69 5 25.68 99.19 6 25.92 104.19 7 25.80 101.69 8 26.02 106.19 9 26.05 106.69 10 26.25 110.69 芒果葉 7.50 1 28.18 28.00 99.47 97.17 0.35 2 27.85 95.13 3 28.00 97.13 4 27.98 96.80 5 28.02 97.47 6 28.00 97.13 7 28.08 98.13 8 27.90 95.80 9 28.10 98.47 10 27.92 96.13 表11 方法的回收率 驗(yàn)證單位 3 驗(yàn)證日期 2019-04-17 樣品 添加水平（mg/g） 重復(fù) 測(cè)定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質(zhì) （本底） 1 21.25 21.165 - - - 2 21.10 - 3 21.10 - 4 21.28 - 5 21.10 - 芒果葉 2.50 1 23.58 23.65 96.40 99.40 7.69 2 23.80 105.40 3 23.90 109.40 4 23.53 94.40 5 23.45 91.40 芒果葉 5.00 1 26.55 26.385 107.70 104.40 7.08 2 26.38 104.20 3 25.75 91.70 4 26.63 109.20 5 26.63 109.20 芒果葉 7.50 1 29.00 28.88 104.47 102.87 5.40 2 29.30 108.47 3 29.20 107.13 4 28.33 95.47 5 28.58 98.80 表12 方法的回收率 驗(yàn)證單位 4 驗(yàn)證日期 2019-04-28 樣品 添加水平（mg/g） 重復(fù) 測(cè)定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質(zhì) （本底） 1 21.38 21.44 - - - 2 21.65 - 3 21.65 - 4 21.28 - 5 21.28 - 6 21.40 - 7 21.55 - 8 21.45 - 9 21.72 - 10 21.62 - 芒果葉 2.50 1 23.92 23.83 99.20 97.00 4.75 2 23.80 94.20 3 23.95 100.20 4 23.68 89.20 5 23.80 94.20 6 23.75 92.20 7 24.02 103.20 8 23.88 97.20 9 23.92 99.20 10 23.98 101.20 芒果葉 5.00 1 26.55 26.49 102.10 100.10 2.34 2 26.45 100.10 3 26.38 98.60 4 26.58 102.60 5 26.50 101.10 6 26.32 97.60 7 26.42 99.60 8 26.48 100.60 9 26.60 103.10 10 26.22 95.60 芒果葉 7.50 1 28.62 28.84 95.73 98.97 1.38 2 28.88 99.07 3 28.85 98.73 4 28.82 98.40 5 29.00 100.73 6 28.90 99.40 7 28.90 99.40 8 28.90 99.40 9 28.98 100.40 10 28.82 98.40 表13 方法的回收率 驗(yàn)證單位 5 驗(yàn)證日期 2019-04-28 樣品 添加水平（mg/g） 重復(fù) 測(cè)定值（mg/g） 平均值（mg/g） 回收率(%) 平均回收率(%) 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%) 溶劑空白 - - 0.00 0.00 - - - 芒果葉 基質(zhì) （本底） 1 20.48 20.80 - - - 2 20.63 - 3 20.60 - 4 20.98 - 5 21.13 - 6 20.63 - 7 20.75 - 8 20.63 - 9 21.18 - 10 21.05 - 芒果葉 2.50 1 22.88 23.25 83.00 98.10 9.74 2 23.23 97.00 3 2