疾病與人類健康(基因治療).ppt

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基因治療,概念美國(guó)的聯(lián)邦食品與藥品管理局(FDA)于1993年給出的定義是:“基于修飾活細(xì)胞遺傳物質(zhì)而進(jìn)行的醫(yī)學(xué)干預(yù)。細(xì)胞可以體外修飾,隨后再注入患者體內(nèi)；或?qū)⒒蛑委煯a(chǎn)品直接注入患者體內(nèi),使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生遺傳學(xué)改變。這種遺傳學(xué)操縱的目的：預(yù)防、治療、治愈、診斷或緩解人類疾病”,1、體細(xì)胞基因治療(somaticgenetherapy)治療基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞內(nèi)使之表達(dá)基因產(chǎn)物,以達(dá)到治療目的；只影響受試者本人,而與后代無關(guān)。2、生殖細(xì)胞基因治療(germlinegenetherapy)將治療基因轉(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞或早期胚胎內(nèi)的一種基因療法；永久地改變后代的遺傳組成,其目的是要預(yù)防后代患特定的遺傳疾病。,生殖細(xì)胞基因治療是體細(xì)胞基因治療的延伸與擴(kuò)展；各國(guó)均禁止將生殖細(xì)胞基因治療用于臨床；我國(guó)于1993年制定了《人的體細(xì)胞治療和基因治療臨床研究質(zhì)控要點(diǎn)》，明確規(guī)定僅能進(jìn)行體細(xì)胞基因治療。,特點(diǎn),技術(shù)路線的多樣性；學(xué)科的交叉性；高風(fēng)險(xiǎn)性；高度的靶向性。,基因治療發(fā)展經(jīng)歷的3個(gè)階段,第一階段：70年代－80末，準(zhǔn)備時(shí)期又被稱為“禁錮時(shí)期”第二階段：1989－1995年，狂熱時(shí)期FDA于1989年批準(zhǔn)基因治療正式臨床試驗(yàn)第三階段：1996－現(xiàn)在，理性時(shí)期目前中國(guó)有“B型血友病治療”、“腦瘤自殺基因治療”和“Ad－P53”已通過國(guó)家藥審進(jìn)入臨床試用,基因治療的3Y原則,安全性(safety)有效性(efficacy)穩(wěn)定性(stability),倫理原則,1、最后選擇原則某種疾病在所有的療法均無效或微效時(shí)。2、安全原則安全不僅僅針對(duì)個(gè)體，更重要的是針對(duì)人類。3、知情同意原則基因治療尚處于實(shí)驗(yàn)階段，必須讓患者認(rèn)識(shí)到基因治療可能的危害4、公正原則目前，基因治療只能用于治病救人5、保密原則患者的遺傳信息，尤其是基因缺陷不泄露給外界,基因治療中存在的技術(shù)難點(diǎn),①突變基因定位與定點(diǎn)修復(fù)技術(shù)未解決,不能去除或糾正異常基因。②目前的基因?qū)胂到y(tǒng)尚不成熟,存在結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、影響基因組的功能以及治療基因難以到達(dá)靶細(xì)胞等隱患；③轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源性基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)難以控制,有一定的隨機(jī)性，有激活致癌基因或產(chǎn)生野生型病毒的潛在危害；④無法保障干預(yù)生殖細(xì)胞基因而不對(duì)后代產(chǎn)生醫(yī)源性的傷害。,常用病毒載體系統(tǒng),反轉(zhuǎn)錄病毒腺病毒腺相關(guān)病毒單純皰疹病毒,（1）反轉(zhuǎn)錄病毒載體,RNA病毒,基因組大小在8～11kb之間；以基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄出雙鏈DNA；雙鏈DNA能夠隨機(jī)整合到寄主細(xì)胞的染色體上,隨著寄主細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制。,1981年，Wei等構(gòu)建了第1個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒載體；臨床上應(yīng)用最多的以小鼠白血病病毒為基本骨架構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒載體。,優(yōu)點(diǎn):宿主細(xì)胞廣泛,能夠感染不同生物種類的多種類型細(xì)胞;能高效的感染分裂細(xì)胞,感染率高達(dá)100%;能使外源基因整合到宿主細(xì)胞染色體上。,不足之處：1)不能感染非分裂的細(xì)胞;2)可能產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒;3)由于是隨機(jī)整合,可能引起“插入誘變”;4)包裝外源DNA能力有限,小于8kb;5)要求靶細(xì)胞表面要具有反轉(zhuǎn)錄病毒的相應(yīng)受體。,新進(jìn)展,1)慢病毒載體的研究和應(yīng)用（HIV-1)基因組中存在核定位信號(hào)序列,它能夠有效感染并整合到非分裂細(xì)胞和最終分化的細(xì)胞(除G0期)2)人泡沫病毒目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有疾病與人泡沫病毒相關(guān),2）腺病毒載體,線性雙鏈的DNA病毒,基因組為36kb；不整合到宿主細(xì)胞染色體上,而是以染色體外成分存在；上皮細(xì)胞、角膜和消化道上皮細(xì)胞具有天然的嗜性；與臨床疾病相關(guān)的腺病毒通常較溫和,很少危及生命。,293細(xì)胞是由人胚腎細(xì)胞經(jīng)Ad5DNA片段轉(zhuǎn)染后發(fā)生轉(zhuǎn)化而形成的細(xì)胞，該基因組中整合有AdE1區(qū)的片段，可持續(xù)表達(dá)E1區(qū)蛋白。,優(yōu)點(diǎn):1)人類是腺病毒的天然宿主,所以比較安全;2)該病毒在體外穩(wěn)定,易于制備與純化;3)宿主范圍廣,既可感染分裂細(xì)胞,又可感染非分裂細(xì)胞;4)可原位感染,特別是肺,可經(jīng)口服,噴霧,氣管內(nèi)滴注等多途徑進(jìn)行治療;5)外源基因表達(dá)水平較高。,不足之處:1)它幾乎可以感染所有的細(xì)胞,因此缺乏特異性;2)不能整合到宿主染色體上,所以不能持續(xù)表達(dá)所需產(chǎn)物,表達(dá)時(shí)間短暫,需重復(fù)給予載體制劑治療;3)因可能刺激免疫反應(yīng),使反復(fù)治療的效果會(huì)逐漸降低。,（3）腺相關(guān)（腺伴隨)病毒載體,線性單鏈的DNA病毒,基因組在4.6kb;繁殖依賴于輔助病毒-腺病毒和皰疹病毒。生活周期有兩個(gè)不同的胞內(nèi)期:1)缺乏輔助病毒時(shí),腺相關(guān)病毒感染宿主細(xì)胞,其基因組會(huì)整合到宿主細(xì)胞染色體上,形成潛伏感染狀態(tài);2)當(dāng)有輔助病毒感染同一個(gè)細(xì)胞時(shí),腺相關(guān)病毒基因組DNA就會(huì)復(fù)制。,優(yōu)點(diǎn):目前尚未發(fā)現(xiàn)該病毒在人體中致病,所以比較安全;感染宿主細(xì)胞廣泛,包括非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞,特別是能夠感染神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;能特異整合于人的第19號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端,減少了插入突變的可能性;外源基因表達(dá)穩(wěn)定,3個(gè)月至1.5年。,不足之處：難以大量生產(chǎn)復(fù)制需要輔助病毒包裝外源基因的能力有限,小于5kb臨床的應(yīng)用受到一定限制亟需建立穩(wěn)定表達(dá)rep和cap的細(xì)胞系，但rep表達(dá)的毒性可能是其困難所在,（4）單純皰疹病毒載體,基因組長(zhǎng)約152kb的雙鏈DNA病毒；不整合；對(duì)非分裂細(xì)胞具有天然的親和力；對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞具有嗜向性。多用于帕金森或腦瘤等神經(jīng)性疾病的治療；用作基因轉(zhuǎn)移載體的單純皰疹病毒主要來源于I型單純皰疹病毒（HSV-1）。,優(yōu)點(diǎn):宿主范圍廣,包括大量哺乳動(dòng)物和鳥類的分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞;載體易于操作;包裝外源基因的能力大,可插入長(zhǎng)達(dá)50kb的外源基因。,不足之處：野生型單純皰疹病毒對(duì)人類具有明顯的致病性,能夠從潛伏狀態(tài)激活,所以目前僅限于某些惡性腫瘤的臨床治療試驗(yàn)。,桿狀病毒侵入哺乳動(dòng)物細(xì)胞:內(nèi)吞,HBV肝靶向性基因治療載體用外源目的基因取代一個(gè)或多個(gè)HBV編碼基因:S/C/P/X;復(fù)制需要通過輔助病毒（包裝信號(hào)ε缺失）基因組的反式互補(bǔ)來實(shí)現(xiàn)。,血友病的基因治療,血友病B:人凝血因子IX:Ad-FIX；AAV－h(huán)FIX；反轉(zhuǎn)錄病毒臨床試驗(yàn)(復(fù)旦薛京倫）血友病A：人凝血因子VIII,地中海貧血的基因治療,珠蛋白基因及其調(diào)控序列突變?cè)煅杉?xì)胞,帕金森病（PD）的基因治療,酪氨酸羥化酶基因:L-酪氨酸轉(zhuǎn)換成L-dopa神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因,早老性癡呆（AD)的基因治療,淀粉樣蛋白-amiloidprecursorproteinAPP神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因,腫瘤基因治療的基本策略1.癌基因表達(dá)的反義抑制策略,利用反義DNA、反義RNA、核酶(Ribozyme)技術(shù)，抑制癌基因的表達(dá)，可以抑制腫瘤。c-myc的反義核酸在淋巴瘤細(xì)胞中有抗增殖活性。以反向K-ras質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，抑制了K-ras的表達(dá)，并且抑制腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng),采用ras癌基因特異的核酶，用逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入膀胱癌EJ細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的致癌性和轉(zhuǎn)移性均降低了50％。,腫瘤基因治療的基本策略2抑癌基因克隆和表達(dá)策略,在目前已分離克隆的抑癌基因中，對(duì)RB、p53、nm23等在腫瘤治療方面的作用研究最為深入?；謴?fù)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞中RB基因的表達(dá)對(duì)于這類腫瘤的治療具有一定的臨床價(jià)值；以野生型p53基因替換腫瘤細(xì)胞中突變的p53基因是p53基因治療最基本的應(yīng)用策略；恢復(fù)腫瘤細(xì)胞中nm23基因的表達(dá)對(duì)于防止腫瘤的轉(zhuǎn)移具有積極意義。,腫瘤基因治療的基本策略3.宿主免疫功能增強(qiáng)策略,向腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)中導(dǎo)入細(xì)胞因子基因或腫瘤相關(guān)性抗原基因、B7共刺激分子基因等，可以增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫功能。目前用于臨床的細(xì)胞因子有IL-2、TNF-?、IFN-?、GM-CSF等。腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫反應(yīng)的原因之一是許多腫瘤細(xì)胞缺乏B7共刺激分子，將B7基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中，再還輸小鼠體內(nèi)。無B7的小鼠1月后半數(shù)致死，導(dǎo)入B7的小鼠全部度過3月的實(shí)驗(yàn)期。,腫瘤基因治療的基本策略4.腫瘤治療藥物前體的轉(zhuǎn)換策略,又稱自殺基因(suicidegene)療法。將自殺基因?qū)爰?xì)胞中，這些基因的產(chǎn)物可將無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸镜漠a(chǎn)物，從而將細(xì)胞殺死。目前常用的自殺基因有單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSVTK)和細(xì)菌的胞嘧啶脫氨酶基因(CD)。TK能將無毒的GCV轉(zhuǎn)化為有毒的三磷酸GCV，CD能催化5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5－氟尿嘧啶。這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在DNA復(fù)制時(shí)摻入DNA分子中，抑制了DNA的合成。,腫瘤基因治療的基本策略5.多藥抗性基因的轉(zhuǎn)移策略,腫瘤化療的最大副作用就是骨髓抑制。將多藥抗性基因(multi-drugresistancegene,MDR)導(dǎo)入骨髓干細(xì)胞，可以控制化療的副作用。MDR1基因編碼170KD的跨膜P-糖蛋白，作為能量依賴性的藥物外運(yùn)泵，能將化療藥物驅(qū)逐出胞外，使細(xì)胞獲得抗藥表型。這一策略能使骨髓耐受大劑量化療。,